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    小麥DREB4蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

    2023-05-30 10:48:04李永波魯琳方會見崔德周孟福燕黃琛隋新霞樊慶琦楚秀生
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年3期
    關(guān)鍵詞:非生物脅迫小麥

    李永波 魯琳 方會見 崔德周 孟福燕 黃琛 隋新霞 樊慶琦 楚秀生

    關(guān)鍵詞:小麥:非生物脅迫:DREB4轉(zhuǎn)錄因子:多克隆抗體

    中圖分類號:S512.1:Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2023) 03-0009-06

    干旱、鹽、高溫、冷等各種非生物脅迫會嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量。DREB蛋白含有一個保守的AP2結(jié)構(gòu)域,可以和順式作用元件DRE核心序列(A/GCCGAC)發(fā)生特異性結(jié)合,通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控下游基因的表達(dá),進(jìn)而應(yīng)對各種非生物脅迫。到目前為止,DREB轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、大豆、水稻、玉米、大麥和小麥等多種植物中被鑒定出來。DREB分為六大類(DREB1~6),其中,DREB1在擬南芥、水稻、玉米中主要應(yīng)答冷脅迫,DREB2主要應(yīng)答干旱、鹽脅迫,DREB3參與ABA和糖信號途徑,DREB4應(yīng)答干旱、冷脅迫及在乙烯與茉莉酸途徑中起作用,DREB5參與應(yīng)答干旱、冷脅迫,DREB6應(yīng)答干旱、鹽脅迫。大量研究已驗(yàn)證了DREB在植物應(yīng)對非生物脅迫中的功能。如在小麥中過表達(dá)擬南芥DREBIA、大豆GmDREB1或棉花Gh DREB基因,可通過提高根系活力、光合作用及滲透調(diào)節(jié)能力提高小麥的抗旱性;在擬南芥中過表達(dá)大豆GmDREB2、GmDREB3或小麥Ta DREB3基因,可提高擬南芥抗旱、耐鹽、耐高溫及抗凍性;過表達(dá)GmDREB6基因,可增強(qiáng)大豆的耐鹽能力。

    然而,目前幾乎所有關(guān)于DREB的研究是集中在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控,缺乏蛋白質(zhì)水平上的調(diào)控研究,且DREB蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能是否通過磷酸化、乙?;鹊鞍姿缴系恼{(diào)控尚未可知,因此,研究識別內(nèi)源性DREB蛋白的特異性多克隆抗體,對于DREB在蛋白水平的調(diào)控研究具有非常重要的意義。

    本研究通過對小麥中已有的DREB4A、4B和4C進(jìn)行序列分析,選取DREB4A進(jìn)行原核表達(dá)、純化,并以其作為抗原,首次制備出可識別小麥內(nèi)源DREB4蛋白的多克隆抗體,以期為進(jìn)一步研究植物DREB4在蛋白水平上的調(diào)控機(jī)理提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    供試小麥品種為濟(jì)麥379,由山東省審定(魯審麥20210017)。取其幼苗期根、葉為材料進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.2 DREB4序列分析與合成

    本研究通過DNAMAN8軟件對NCBI中提交的DREB4A(AY781354.1)、4B(AY781355.1)和4C(AY781356.1)序列進(jìn)行分析;DREB4A序列的合成由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行。

    1.3 DREB4A載體構(gòu)建、原核表達(dá)及純化

    將上述合成的DREB4A序列與大腸桿菌表達(dá)載體PET30a通過同源重組的方法(pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit,CU201-02,北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α(北京擎科生物科技有限公司)感受態(tài)細(xì)胞中,冰上放置15 min.42℃水浴熱激90s,再冰上放置2 min,加入1 mL無任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基,37℃、210r/min水平搖th,然后取100μL菌液,涂于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上,37℃過夜培養(yǎng)。挑取10個單克隆進(jìn)行PCR檢測,選取2個陽性信號最強(qiáng)的單克隆由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序,對測序正確的單克隆進(jìn)行搖菌、質(zhì)粒提?。ㄙ|(zhì)粒小提試劑盒,DP103,北京天根生化科技有限公司)。將提取好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B121( DE3)感受態(tài)細(xì)胞(CD701-02,北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)中,剩余步驟同DH5a感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。挑單克隆,置于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃過夜培養(yǎng),然后吸取1 mL菌液,加入到300 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),待菌液OD值為0.6~0.8時(shí),加入終濃度為50 mmol/L的IPTG(G5042-1G,武漢塞維爾生物科技有限公司)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),28℃過夜培養(yǎng);菌液于6000 r/min離心10 min,收集菌體沉淀,用1×PBS( phosphate buffer saline)清洗沉淀1次,然后加入40 mL lxPBS重懸,超聲破碎(開3s,關(guān)3s;共計(jì)30 min),6000 r/min離心10min,分別將沉淀、上清液進(jìn)行SDS電泳檢測。利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(P2226,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)對上清液進(jìn)行純化,然后置于透析袋中4℃過夜透析,將透析后的蛋白置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4小麥DREB4多克隆抗體制備

    選取實(shí)驗(yàn)級日本大耳白兔和新西蘭大白兔各1只,飼養(yǎng)體重至1~2 kg時(shí),用注射器將充分混勻的1mL完全弗氏佐劑(液體石蠟:羊毛脂=2:1)和0.3 mg DREB4A融合蛋白對每只兔子進(jìn)行皮下注射第1針,標(biāo)記為第1天;第12天,將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑(完全弗氏佐劑+終濃度20 mg/mL的卡介苗)和0.15 mg融合蛋白對每只兔子進(jìn)行皮下注射第2針;第26天,將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑和0.15 mg融合蛋白對每只兔子進(jìn)行肌肉注射第3針;第40天,將充分混勻的1 mL不完全弗氏佐劑和0.15 mg融合蛋白對每只兔子進(jìn)行肌肉注射第4針:第53天,取兔子血清進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。

    1.5 Western blot分析

    利用植物組織蛋白裂解液提取小麥幼苗期根、葉部的總蛋白(植物蛋白提取試劑盒,CW0885,康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司),配制15%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳:通過濕法轉(zhuǎn)膜,將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上,然后將膜放人含有2%脫脂奶粉的TBS(25 mmol/LTris-HCl,137 mmol/L NaCl)中,封閉1h;加入DREB4多克隆抗體(1:1000稀釋于2%脫脂奶粉中),4℃過夜;用TBST(TBS+20%吐溫-20)洗滌3次后,向封閉液中加入堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)標(biāo)記的二抗,緩慢搖動24 h,然后TBST洗滌3次,每次10 min;最后用發(fā)色液(TBS 10 mL,5% NBT 45μL,5% BCIP 35μL)進(jìn)行發(fā)色。

    1.6免疫組織化學(xué)法進(jìn)行亞細(xì)胞定位

    將小麥葉片下表皮撕下,置于4%多聚甲醛中,室溫放置24 h,棄掉多聚甲醛,用1×PBS清洗3次,加入2%脫脂奶粉于37℃封閉30 min,然后在4℃下加入DREB4多克隆抗體(1:200稀釋于2%脫脂奶粉中)過夜;用PBS洗滌3次后,加入1μL二抗(山羊抗兔-Alexa Fluor 555抗體)和10mL BSA,37℃繼續(xù)孵育th,然后用TBS清洗3次,在室溫下用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DA-PI,AnaSpec Inc., San Jose, CA,USA)染色10 min,然后用TBS清洗3次,置于熒光顯微鏡(HT7700,Hitachi,Tokyo,Japan)下觀察并拍照。

    2結(jié)果與分析

    2.1小麥DREB4序列分析

    在普通小麥中,DREB4存在DREB4A、4B、4C三種轉(zhuǎn)錄本,其中,DREB4A編碼394個氨基酸,分子量為42.8 kDa;DREB4B編碼346個氨基酸,分子量為37.7 kDa;DREB4C編碼68個氨基酸,分子量為7.1 kDa(圖1)。三個蛋白氨基酸序列的保守性為61.28%,第1~25位的氨基酸完全一致,其中,DREB4B除第26~73位氨基酸缺失外,其它位置的氨基酸與DREB4A完全一致。DREB4A、4B和4C存在序列間的差異,可能是應(yīng)對不同非生物脅迫產(chǎn)生的可變剪切所致。

    2.2小麥DREB4A的原核表達(dá)

    鑒于DREB4A的氨基酸序列最長,選其進(jìn)行后續(xù)分析。首先,將人工合成的DREB4A序列與表達(dá)載體PET30a連接后,在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),上清液中的蛋白純化后進(jìn)行SDS -PAGE檢測。結(jié)果顯示,在大約50 kDa處出現(xiàn)清晰的蛋白條帶(圖2),與預(yù)期的蛋白分子量相符,表明DREB4A成功表達(dá)。

    2.3 DREB4多克隆抗體的制備

    本研究以上述獲得的純化DREB4A融合蛋白為抗原免疫兔子,從兔血清中獲取了DREB4多克隆抗體。Western blot結(jié)果顯示,該抗體在目的蛋白位置清楚地識別到DREB4A蛋白(圖3)。

    2.4 DREB4多克隆抗體對小麥內(nèi)源性DREB4蛋白的識別及特異性檢測

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證該抗體能否識別小麥內(nèi)源性DREB4蛋白,分別提取小麥苗期根、葉總蛋白進(jìn)行免疫識別。Westem blot結(jié)果顯示,僅在37 kDa處檢測到清晰的蛋白條帶,這與預(yù)測的DREB4B蛋白分子量一致(圖4)。表明該抗體可以識別小麥內(nèi)源性DREB4B蛋白,而且特異性好,可以用于后續(xù)植物DREB分子機(jī)理的相關(guān)研究。

    2.5 DREB4亞細(xì)胞定位分析

    DREB4定位于細(xì)胞核中(圖5),與前人報(bào)道的DREB轉(zhuǎn)錄因子核定位的結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)了該抗體特異性較好,可用于開展免疫組織或細(xì)胞化學(xué)研究的可行性。

    3討論與結(jié)論

    DREB是一類抗非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子,目前主要用于抗逆轉(zhuǎn)基因植物的培育及相關(guān)分子機(jī)理的解析。小麥DREB4蛋白是一種對動物和人類無危害的蛋白,將其用于糧食作物抗逆性轉(zhuǎn)基因改良有著廣闊的市場前景。DREB4在小麥中存在三種轉(zhuǎn)錄形式(DREB4A、4B和4C),其中,DREB4A編碼的多肽鏈最長,涵蓋的蛋白信息最豐富,推測由此蛋白作為抗原產(chǎn)生的抗體可識別DREB4的所有三種形式,因此本研究利用DREB4A蛋白作為抗原,進(jìn)行了DREB4多克隆抗體的制備。經(jīng)過抗原上清蛋白的純化、免疫注射,最終研制出能識別小麥內(nèi)源性DREB4蛋白的多克隆抗體。

    盡管從植物中已克隆出多種類型的DREB基因,但由于其抗體類型匱乏以及識別內(nèi)源性蛋白抗體的空白,導(dǎo)致有關(guān)DREB在蛋白水平上的調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展相對緩慢。目前,只有擬南芥DREBIA的抗體制備成功,且僅對大腸桿菌中表達(dá)的擬南芥DREBIA融合蛋白進(jìn)行了檢測。本研究首次開發(fā)了特異性識別小麥內(nèi)源DREB4蛋白的多克隆抗體,既豐富了植物DREB的抗體類型,也為進(jìn)一步推動DREB在蛋白水平上的研究提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

    利用本研究制備的DREB4多克隆抗體檢測小麥苗期根、葉內(nèi)源性DREB4蛋白時(shí),僅識別到了DREB4B蛋白條帶,與預(yù)測的該抗體能識別小麥中DREB4三種蛋白形式的結(jié)果不一致,這可能是因?yàn)镈REB4具有組織器官以及不同發(fā)育階段表達(dá)特異性,在小麥苗期根、葉中主要以DREB4B的形式表達(dá),而在花、籽粒等其它組織器官以及不同發(fā)育階段中則以其它形式表達(dá);另外,DREB4在不同小麥品種中的表達(dá)形式也可能存在一定的差異,本研究所用小麥品種濟(jì)麥379為抗旱節(jié)水型品種,在其苗期根、葉中主要以DREB4B的形式表達(dá),但在其它類型的小麥品種中以哪種形式表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

    傳統(tǒng)DREB基因亞細(xì)胞定位是采用構(gòu)建DREB-GFP過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入組織或細(xì)胞中的方法進(jìn)行定位,而本研究是利用該抗體對內(nèi)源DREB4進(jìn)行免疫定位,與傳統(tǒng)方法相比可避免因過表達(dá)造成目的蛋白移位的現(xiàn)象。

    綜上所述,本研究通過對DREB4A進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)、純化,并以此作為抗原成功制備出可識別小麥內(nèi)源性DREB4蛋白的高度特異性多克隆抗體,可為深入研究植物DREB4在蛋白水平上參與非生物脅迫的調(diào)控機(jī)理奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

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