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      SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳分析24個廣西常規(guī)香稻品種的遺傳多樣性

      2023-05-30 02:42:45唐梅孫富盧宏琮夏秀忠唐忠平鐘志堅陸桂耀
      熱帶作物學(xué)報 2023年3期
      關(guān)鍵詞:遺傳多樣性廣西

      唐梅 孫富 何 聰 盧宏琮 黃 鸝 夏秀忠 唐忠平 鐘志堅 陸桂耀

      關(guān)鍵詞:廣西;常規(guī)香稻;SSR 熒光標(biāo)記;毛細(xì)管電泳;遺傳多樣性

      中圖分類號:S511 文獻標(biāo)識碼:A

      隨著近年來消費者對稻米品質(zhì)要求的不斷提高,優(yōu)質(zhì)香稻品種以飯香濃郁和營養(yǎng)豐富等優(yōu)異品質(zhì)越來越受到市場的青睞。從1980 年我國開始進行香稻育種,目前已經(jīng)育成一批優(yōu)質(zhì)香稻品種[1]。廣西在2000 年以來也相繼育成了‘八桂香[2]、‘田東香[3]、‘玉香占[4]、‘三香628[5]等香稻品種。但由于廣西自育香稻品種的優(yōu)質(zhì)米達標(biāo)率低、產(chǎn)量低和抗病性差等原因,推廣的香稻品種數(shù)量和質(zhì)量滿足不了市場需求[6]。為了滿足當(dāng)前消費者對稻米品質(zhì)好聞、好吃、好看、高營養(yǎng)的理想追求,因此廣西加快了優(yōu)質(zhì)常規(guī)香稻新品種的審定。而在香稻育種中,有香味基因的親本來源較少,且遺傳背景較近,從而使得香稻品種的遺傳多樣性較低[1]。通過對香稻品種的遺傳多樣性進行分析,理清香稻品種的親緣關(guān)系,加強香稻品種的遺傳特性研究,可為選育廣西優(yōu)質(zhì)香稻品種提供技術(shù)參考。

      DNA 分子標(biāo)記技術(shù)分析水稻品種遺傳多樣性是目前應(yīng)用最廣泛的手段之一,其中簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、操作方便,可利用SSR 標(biāo)記對香稻進行遺傳多樣性分析[7-13]。唐傲等[9]利用60 個SSR 標(biāo)記對國內(nèi)外370 份香稻材料的遺傳多樣性進行了比較分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)參試材料可分為秈粳兩大類。朱勇良等[10]利用40 對SSR 引物對太湖稻區(qū)和國內(nèi)其他地區(qū)的39 個香稻品種進行遺傳多樣性分析,試驗結(jié)果基本反映了不同品種間的親緣關(guān)系。趙鳳民等[13]用50 對SSR 分子標(biāo)記對42 份黑龍江省香稻種質(zhì)資源進行遺傳多樣性研究,結(jié)果說明香稻資源的區(qū)域特征明顯,各類群中的香稻資源親緣關(guān)系較近。

      聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的方法步驟繁多,耗時耗力且靈敏度低。而SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)可直接讀取目的片段準(zhǔn)確大小,大大降低了分辨擴增產(chǎn)物的難度,提高了研究的效率和準(zhǔn)確性。利用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)用于香稻特別是涉及廣西常規(guī)香稻品種遺傳多樣性的研究還未見報道。本研究采用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測技術(shù),利用48 對SSR 分子標(biāo)記對廣西審定的24 個常規(guī)香稻品種進行遺傳多樣性分析,以期分析廣西常規(guī)香稻品種間的遺傳多樣性,闡明廣西常規(guī)香稻的遺傳多樣性特點,為廣西常規(guī)香稻品種的遺傳基礎(chǔ)拓展、品種選育和鑒定提供技術(shù)參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      以通過廣西審定的24 個常規(guī)香稻品種為材料(表1)。種子由廣西壯族自治區(qū)種子管理站提供。

      1.2 方法

      1.2.1 廣西常規(guī)香稻品種DNA 的提取 將香稻種子發(fā)芽7 d 后,剪取新鮮葉片,采用CTAB 法提取幼苗葉片中的DNA。

      1.2.2 SSR 熒光引物及PCR 反應(yīng) 48 對SSR 核心標(biāo)記引物由農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1433—2014)推薦,熒光引物由上海生工生物公司合成。12 μL的SSR 反應(yīng)體系包括2×PCR Master Mix 5 μL,ddH2O 5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板1 μL 。PCR 反應(yīng)在T100 PCR 儀(BIO-RAD, USA)上進行,PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min,10 ℃保溫。

      1.2.3 產(chǎn)物分析 取PCR 產(chǎn)物0.3 μL、分子量內(nèi)標(biāo)0.5 μL 和去離子甲酰胺9.5 μL 混合加入PCR板,95 ℃變性5 min,迅速冷卻到4 ℃后離心,在ABI3730XL DNA 遺傳分析儀上進行毛細(xì)管電泳,并用Data Collection 軟件收集電泳原始數(shù)據(jù)。

      1.3 數(shù)據(jù)處理

      利用Genemapper 軟件分析原始數(shù)據(jù),計算擴增片段大小。按照毛細(xì)管電泳遷移位置,用1 和0 分別代表檢測到擴增片段的有無,建立原始數(shù)據(jù)表。利用POPGENE 1.32 軟件統(tǒng)計觀測等位基因數(shù)(Na)、Shannons 信息指數(shù)(I)、有效等位基因數(shù)(Ne),利用NTSYS 2.10e 軟件對各品種進行遺傳相似性分析,采用UPGMA(unweighted pairgroup method? with average)法對各品種進行聚類分析,利用PIC-CAL 計算多態(tài)信息含量(PIC)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 48 對SSR 標(biāo)記的多態(tài)性分析

      本研究利用覆蓋水稻12 條染色體的48 對SSR 引物對24 個廣西常規(guī)香稻品種進行等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannons指數(shù)(I)和多態(tài)信息含量值(PIC)檢測(表2)。結(jié)果表明,48 個SSR 位點在24 個廣西常規(guī)香稻品種中檢測到170 個等位基因,等位基因數(shù)(Na)的變化幅度為1~9 個,平均為3.54 個,說明這些引物可適于24 個廣西常規(guī)香稻品種的遺傳多樣性檢測。有效等位基因數(shù)(Ne)的變化幅度為1~4.5534,平均為2.0736,其中有效等位基因數(shù)最高是RM21,其指數(shù)為4.5534,其次是RM481、RM493 和RM258,其指數(shù)分別為4.5000、4.4825和4.1739。說明這4 對引物有較高的檢測效率。Shannons 指數(shù)(I)的變化幅度為0~1.7942,平均為0.7726。多態(tài)信息含量(PIC)大于0.50 的位點為高度多態(tài)位點,在0.25~0.50 為中度多態(tài)位點,小于0.25 時為低度多態(tài)位點[14]。24 個廣西常規(guī)香稻品種的PIC 值的變化范圍為0~0.7541,平均為0.3732,屬于中度多態(tài)位點,說明24 個廣西常規(guī)香稻品種具有一定的遺傳變異。

      2.2 遺傳相似性分析

      使用NTSYS 2.10 軟件計算24 個廣西常規(guī)香稻品種的遺傳相似性系數(shù)(表3),由表3 可知,24 個品種的遺傳相似系數(shù)介于0.3299~0.9600 之間,平均值為0.5790,其中‘三香628(11)與‘農(nóng)香32(19)遺傳相似系數(shù)最小,為0.3299,說明這2 個品種遺傳基礎(chǔ)差異最大,親緣關(guān)系最遠(yuǎn);‘萬香696(14)與‘廣糧香2 號(15)、‘萬香696(14)與‘糧發(fā)香絲(16)、‘廣糧香2號(15)與‘糧發(fā)香絲(16)之間的遺傳相似性系數(shù)大, 其數(shù)值分別為0.9600 、0.9293 和0.9216,說明這幾個品種遺傳基礎(chǔ)差異較小,親緣關(guān)系接近。

      2.3 聚類分析

      在遺傳相似性系數(shù)的基礎(chǔ)上采用UPGMA 法對24 個廣西常規(guī)香稻品種進行聚類分析(圖1),在遺傳相似性系數(shù)0.504 處分為三大群類。第Ⅰ大類包括‘八桂香(1)和‘農(nóng)香32(19)2 個品種,說明這2 個品種遺傳背景較為接近;第Ⅲ大類包括‘早香一號(2)、‘玉香占(4)和‘家福香1 號(10)3 個品種,說明這3 個品種具有相近的遺傳背景,與其他品種遺傳關(guān)系較遠(yuǎn);其余19 個品種被分到第Ⅱ大類。進一步遺傳分析表明,第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)0.624 處又可分為4個亞類,第ⅰ亞類只有‘桂香2 號(3)1 個品種;第ⅲ亞類有‘三香628(11)、‘桂香99(21)和‘桂香18(23)3 個品種;第ⅳ亞類只有‘柳豐香占(9)1 個品種;剩余14 個品種劃分到第ⅱ亞類。本研究基本反映了24 個常規(guī)香稻品種的親緣關(guān)系。

      2.4 SSR 指紋圖譜的構(gòu)建

      從48 對標(biāo)記中篩選出14 對等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、Shannons 指數(shù)和PIC 值較高的標(biāo)記,根據(jù)檢測到的引物等位基因差異,建立24 個廣西常規(guī)香稻品種的指紋圖譜。對14 個標(biāo)記的擴增片段按分子量大小排列,并進行數(shù)字編碼(表4)。按表4 順序?qū)?4 對標(biāo)記對應(yīng)的編碼組合,每個品種可得到唯一的數(shù)字編碼,組成每個品種的DNA 指紋圖譜(表5)。如‘三香628(11)的SSR 指紋編碼如下,毛細(xì)管電泳檢測到14 個標(biāo)記在‘三香628(11)中的擴增片段大?。╞p)為192/192、148/148、169/169、194/194、170/170、179/179、162/162、147/147、136/136、263/263、148/148、186/186、106/106、164/164,轉(zhuǎn)換成28位的指紋數(shù)字代碼為1122 5511 2244 4411 33663333 3311,其中第1、第2 位的“1、1”表示標(biāo)記RM583 在‘三香628(11)中的擴增片段(192/192)在其多態(tài)性片段中2 個片段排第1 位,第3、第4 位的“2、2”表示標(biāo)記RM71 的2 個擴增片段(148/148)在其多態(tài)性片段中2 個片段排第2 位(表4),其余24 位類推。

      3 討論

      廣西香稻的種植歷史比較悠久[6],早在南宋時靖西香糯就被列為朝廷貢品,目前仍是馳名中外的優(yōu)良品種。但是由于近年來廣西市場上可用的香稻品種不多,無法滿足消費者對香稻的需求。因此加快廣西香稻品種的選育和推廣對廣西香稻產(chǎn)業(yè)有著十分重要的意義。而研究廣西常規(guī)香稻品種的遺傳多樣性,分析香稻品種之間的親緣關(guān)系,挖掘和利用香稻的優(yōu)異基因,可為廣西優(yōu)質(zhì)常規(guī)香稻品種選育提供技術(shù)參考。

      已有的水稻品種遺傳多樣性研究中,SSR 擴增產(chǎn)物主要由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[15-17],較難準(zhǔn)確讀出擴增片段大小,并且整合不同試驗批次和不同膠板的數(shù)據(jù)是個難題,容易出現(xiàn)人為的誤讀或錯讀。SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測可直接讀出擴增的目標(biāo)片段大小,檢測數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確[18-20],便于遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)整合及分析。

      本研究利用國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1433—2014)推薦的48 對SSR 引物,應(yīng)用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)對24 個廣西常規(guī)香稻品種進行遺傳多樣性,可準(zhǔn)確有效地分析24 個廣西常規(guī)香稻品種遺傳多樣性。結(jié)果表明,在48 個SSR 位點上檢測到等位基因數(shù)170 個,等位基因數(shù)變化幅度為1~9 個,平均為3.54 個;比云南地方香稻品種[21]檢測到的平均等位基因5.44 個和黑龍江香稻[13]檢測到的平均等位基因4.08 個低。PIC 值的變化范圍為0~0.7541,平均值為0.3732,比云南地方香稻[21]的0.4300 和黑龍江香稻[13]的0.4649 低。說明廣西審定的常規(guī)香稻品種的遺傳背景比較接近,其遺傳多樣性不夠豐富。這與陳遠(yuǎn)孟等[22]的研究結(jié)果相似。

      本研究利用NTSYS 2.10 軟件計算24 個廣西常規(guī)香稻品種的遺傳相似性系數(shù),結(jié)果顯示24 個品種的遺傳相似系數(shù)介于0.3299~0.9600 之間,平均為0.5790,低于太湖地區(qū)香稻品種的0.6400[10],但高于云南地區(qū)香稻的0.4700[21],進一步說明廣西香稻品種具有一定的遺傳多樣性,但不夠豐富。在遺傳相似性系數(shù)的基礎(chǔ)上采用UPGMA 法對24份廣西常規(guī)香稻品種進行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在遺傳相似性系數(shù)0.504 處24 個品種可分為三大群類,第Ⅰ大類包括2 個品種,第Ⅱ大類包括19 個品種,第Ⅲ大類包括3 個品種。而第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)0.624 處又可分為4 個亞類。聚類分析結(jié)果表明,雖然三大類群間部分品種存在一定遺傳差異,但遺傳多樣性還不夠豐富,其原因可能是廣西香稻種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較窄,且育種單位的親本材料遺傳背景相近[22]。因此在育種的親本選擇上可引入國內(nèi)外地緣關(guān)系較遠(yuǎn)和遺傳背景差異較大的香稻種質(zhì)資源。

      DNA 指紋圖譜具有特異性,比表型鑒定更能準(zhǔn)確地鑒定品種(系),可為品種選育和鑒定提供參考[23]。本研究利用SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳對24 個廣西香稻品種進行SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測,從48 對SSR 引物中篩選出14 對多態(tài)性較好的SSR 構(gòu)建了24 個廣西常規(guī)香稻品種的DNA 指紋圖譜??赏耆珜?4 個廣西常規(guī)香稻品種區(qū)別開來,適于24 個廣西常規(guī)香稻品種的品種鑒定。本研究建立的24 個廣西常規(guī)香稻品種DNA指紋圖譜,可大幅提高24 個香稻品種鑒定的準(zhǔn)確度,對廣西香稻品種的鑒定和保護具有現(xiàn)實意義。

      雖然廣西香稻品種具有一定的遺傳多樣性,但由于其親本來源較單一,遺傳基礎(chǔ)狹窄。因此要培育更好的香稻品種或進行品種改良,應(yīng)多引進國內(nèi)外豐富的香稻資源,挖掘更多的優(yōu)異基因?qū)氲綇V西香稻品種中,以拓寬廣西香稻品種的遺傳基礎(chǔ),從而培育更好更優(yōu)異的知名香稻品種,打響廣西香米品牌。本研究結(jié)果可為廣西香稻品種的育種親本選配和開發(fā)新的遺傳資源提供參考。

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