荔枝分枝調(diào)控基因LcSMXL7的鑒定及功能分析

王弋　付燈恩　董晨　鄭雪文　李偉才

關(guān)鍵詞：荔枝；LcSMXL7；分枝；獨腳金內(nèi)酯；生物信息學(xué)

中圖分類號：S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

獨腳金內(nèi)酯（strigolactones， SLs）屬于倍半萜烯型化合物，是一類新型植物激素[1-2]。1966 年，COOK 等[3]最先在棉花根系分泌物中發(fā)現(xiàn)一種可在激素水平可誘導(dǎo)獨腳金種子萌發(fā)的物質(zhì)，此后BUTLER[1]根據(jù)該物質(zhì)的功能特點將其命名為獨腳金內(nèi)酯。除了誘導(dǎo)獨腳金種子萌發(fā)，獨腳金內(nèi)酯還可促進(jìn)與植物根系共生的叢枝菌根真菌的菌絲分枝形成[4]。近年來的研究表明獨腳金內(nèi)酯可作為信號物質(zhì)在植物體內(nèi)移動并抑制植物側(cè)枝的形成[5-6]。

隨著不同物種中一系列獨腳金內(nèi)酯不敏感突變體的鑒定，獨腳金內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)的重要組分也相繼被克隆[7-10]。進(jìn)一步通過遺傳、生化及酶學(xué)分析，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)獨腳金內(nèi)酯具有獨特的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[11-14]。目前的研究結(jié)果表明獨腳金內(nèi)酯信號具有“底物－酶－配體－受體”這一植物激素識別新機(jī)制，獨腳金內(nèi)酯受體AtD14 既可作為酶催化SL 的水解反應(yīng)，又可作為受體感知SL信號[13]。獨腳金內(nèi)酯被受體AtD14 識別并被AtD14 催化中心水解為活性分子CLIM，之后AtD14 與CLIM 發(fā)生共價結(jié)合誘導(dǎo)AtD14 蛋白構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變并與F-box 蛋白MAX2結(jié)合，形成SCF復(fù)合體[11-12]，誘導(dǎo)D53/SMXL 發(fā)生泛素化修飾介導(dǎo)的蛋白降解，從而抑制植物分枝[12]。D53/SMXL作為獨腳金內(nèi)酯的重要組分，被認(rèn)為是具有抑制子和轉(zhuǎn)錄因子雙重功能的新型抑制子，可通過直接結(jié)合DNA 調(diào)控基因的表達(dá)。擬南芥中，過表達(dá)SMXL6/7/8 可顯著增加分枝數(shù)[14-15]。

研究表明，荔枝花穗分枝數(shù)量與花量密切相關(guān)，分枝數(shù)量多對應(yīng)的花量也大，但目前對荔枝花穗分枝發(fā)育機(jī)制的研究較少。為了明確荔枝花穗發(fā)育的分子機(jī)制，鑒定參與荔枝花穗分枝調(diào)控的基因，本研究以分枝調(diào)控因子LcSMXL7 為研究對象，通過生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)及異源轉(zhuǎn)基因等研究明確其功能，并為開發(fā)荔枝花穗分枝調(diào)控技術(shù)提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于2020年開展，荔枝（Litchi chinensisSonn.）材料來自南亞熱帶作物研究所荔枝試驗基地。選取12 a 樹齡、樹勢健壯的‘妃子笑/黑葉砧穗組合荔枝結(jié)果樹。擬南芥Col-0 用于分析LcSMXL7 功能（擬南芥研究中標(biāo)準(zhǔn)的野生型）[16]，本氏煙草用于分析亞細(xì)胞定位。

1.2 方法

1.2.1 LcSMXL7 生物信息學(xué)分析 利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）的OpenReading Frame Finder 在線軟件分析LcSMXL7 的開放閱讀框及編碼蛋白。蛋白生理生化性質(zhì)利用在線網(wǎng)站ExPAsy 站點工具Protparam 分析。利用MEGA 6 軟件中的Neighbor-joining 工具構(gòu)建LcSMXL7 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootrap 檢驗的重復(fù)值設(shè)置為1000。

1.2.2 LcSMXL7 的克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建 利用SDS/酚法提取荔枝總RNA，利用全式金公司的TransScript One-Step RT-PCR SuperMix 試劑盒合成cDNA 第一鏈?；赗NA-seq 獲得的LcSMXL7序列設(shè)計引物，上游引物為LcSMXL7F：TcatttggagaggacagggtacccATGGAACTGGGTTCAGGCTC，下游引物為LcSMXL7R：AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTAAAGTGACCAGTTCATC。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，切下目的條帶后利用全式金Easy-Pure? Quick Gel Extraction Kit 試劑盒進(jìn)行膠回收。隨后利用全式金公司pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit 試劑盒，將片段克隆至pCAMBIA2300 載體，獲得過表達(dá)載體。

1.2.3 熒光定量PCR 分析 利用SDS/酚法提取荔枝根、莖、葉、花、果皮等部位總RNA，利用全式金公司的TransScript One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒合成cDNA 第一鏈。熒光定量PCR引物為LcSMXL7RTF：GGAACGGGCTCATCATCAAC，LcSMXL7RTR：TGAAGGCCAGCAACAATGAC。內(nèi)參所用引物為LcActinF：AGTTTGGTTGATGTGGGAGAC，LcActinR：TGGCTGAACCCGAGATGAT。

1.2.4 亞細(xì)胞定位 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建所用引物為LcSMXL7GFPF：tcatttggagaggacagggtaccc-ATGCCTACGCCGGTAGCCG，LcSMXL7GFPR：CTCACCATTCTAGAGGATCCCCAACTCAGGACGATTTTTGG，去除終止子密碼子。采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將已構(gòu)建好的pCAMBIA2300-Lc-SMXL7-GFP 載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，隨后將農(nóng)桿菌侵染本氏煙草葉片。3 d 后剪下葉片侵染區(qū)域并置于于激光共聚焦下觀察熒光信號。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcSMXL7 的基因序列及理化特性分析

利用RNA-seq 的注釋結(jié)果（NCBI 序列號為SRX2336010），分析SUPPRESSOR OF MAX21-LIKE 7（SMXL7）基因家族成員，鑒定到一個LcSMXL7 成員。該基因CDS 長度為3408 bp，編碼1135 個氨基酸；SMXL7 具有2 個Clp 結(jié)構(gòu)域和1 個AAA_2 結(jié)構(gòu)域（圖1）。Clp 結(jié)構(gòu)域具有分子伴侶功能，AAA_2 結(jié)構(gòu)域是ATP 的結(jié)合和水解位點，具有ATPase 活性。

理化性質(zhì)分析表明，LcSMXL7 的分子式為C5429H8632N1530O1715S38，理論相對分子質(zhì)量（Mw）為123.99 kDa。理論等電點（pI）約為5.96，其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp + Glu）137 個，占總數(shù)的12.1%，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg +Lys）122 個，占總數(shù)的10.8%。LcSMXL 蛋白脂溶指數(shù)為83.74，親水性平均系數(shù)為-0.305，說明其為親水性脂溶蛋白。該蛋白的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為46.38，說明其穩(wěn)定性較低。

2.2 LcSMXL7 組織表達(dá)特異性分析

qRT-PCR 分析結(jié)果表明，在各個組織和器官中均可檢測到LcSMXL7 表達(dá)，但表達(dá)水平存在一定差異，其中在莖和種子中表達(dá)水平較高，其次為葉片、花穗、雄花和果皮，而在雌花、果肉和根中的表達(dá)水平較低（圖2）。分析結(jié)果說明該基因可能在莖和種子中起到重要作用，這與獨腳金內(nèi)酯參與調(diào)控擬南芥分枝和種子萌發(fā)的研究結(jié)論相一致。

2.3 LcSMXL7 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載甜橙[Citrus sinensis（L.） Osbeck]、杧果（Mangifera indica L.）、錦葵（Herrania umbratica）、可可（Theobroma cacao）、榴蓮（Durio zibethinus Murr.）、木本棉（Gossypiumarboreum Linn.）、木槿（Hibiscus syriacus Linn.）、普通核桃（Juglans regia L.）、白櫟（Quercus lobataHance.）、毛果楊（Populus trichocarpa Phr.）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas L.）、蓖麻（Ricinus communis）、橡膠樹（ Hevea brasiliensis） 及木薯（Manihot esculenta Crantz.）等物種的SMXL7 蛋白序列。對不同物種的SMXL7 蛋白序列作系統(tǒng)發(fā)育樹的分析的結(jié)果顯示，LcSMXL7 與來自木本果樹甜橙和杧果的SMXL7 蛋白序列聚類在同一個分支，而來自其他14 個物種的LcSMXL7 蛋白序列聚類在其他分支（圖3）。表明LcSMXL7 與來自甜橙和杧果的SMXL7 蛋白具有較近的進(jìn)化關(guān)系，而與其他物種SMXL7 蛋白進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。推測LcSMXL7 與甜橙和杧果的SMXL7 具有相似功能。

2.4 LcSMXL7 促進(jìn)植物分枝分析

為了明確荔枝LcSMXL7 的基因功能，將該基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化擬南芥并獲得T1 代轉(zhuǎn)基因種子。利用T1 代種子進(jìn)行卡納霉素抗性實驗，卡方檢驗分析表明所選的轉(zhuǎn)基因株系后代的抗性/無抗性植株均符合3∶1 的分離比，表明所選株系均為單拷貝株系。在獲得T3 代單拷貝穩(wěn)定基因植株后對其功能進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4 所示，相比野生型，轉(zhuǎn)基因擬南芥分枝數(shù)量顯著增多，分枝平均數(shù)量由野生型植株的1.5 個提高到轉(zhuǎn)基因植株的5.07 個，而株高并無顯著變化。該結(jié)果表明過表達(dá)LcSMXL7 可顯著提高擬南芥的分枝數(shù)量，即LcSMXL7 可促進(jìn)南芥分枝發(fā)育。

2.5 LcSMXL7 蛋白的亞細(xì)胞定位分析

LcSMXL7作為一個SQUAMOSA-pROMOTERBINDING PROTEIN 類型蛋白，被預(yù)測作為轉(zhuǎn)錄因子行使功能。為明確LcSMXL7 蛋白的亞細(xì)胞定位，將LcSMXL7 構(gòu)建入pCAMBIA2300-GFP 載體，并轉(zhuǎn)化本氏煙草。結(jié)果如圖5 所示，在細(xì)胞核位置能夠看到強(qiáng)烈的熒光信號，表明LcSMXL7-GFP 融合蛋白定位于細(xì)胞核。

3 討論

荔枝作為嶺南地區(qū)極具特色的水果，深受市場歡迎。但生產(chǎn)中荔枝存在“愛花不惜子”的現(xiàn)象，即荔枝花量大，但坐果少。荔枝花序呈聚傘花序圓錐狀排列，花序長度為10～40 cm，小花數(shù)量一般在200～1500 朵，大花穗的小花數(shù)量可達(dá)4000 朵以上[17]。小花數(shù)量過多會消耗樹體大量營養(yǎng)，影響荔枝坐果。荔枝的小花附著于分枝之上，而荔枝有1～4 級分枝，這暗示可通過調(diào)控花穗分枝數(shù)量改善荔枝坐果。植物分枝重要調(diào)控基因SMXL7 可有效的調(diào)控分枝， 最近的研究發(fā)現(xiàn)SMXL7 通過招募共抑制子TPL/TPR，直接結(jié)合下游轉(zhuǎn)錄因子BES1、SPL9 及SPL15 啟動子并抑制這些轉(zhuǎn)錄因子對BRC1 基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)植物分枝[13]。

本研究首次報道了1 個荔枝獨腳金內(nèi)酯的早期響應(yīng)基因LcSMXL7 ， 該基因編碼區(qū)全長3408 bp，編碼1135 個氨基酸，比擬南芥的SMXL7基因略大。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)LcSMXL7 蛋白含有2 個Clp 結(jié)構(gòu)域和1 個AAA_2 結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域的種類和數(shù)量與擬南芥SMXL7 蛋白一致，這表明LcSMXL7 是一個蛋白結(jié)構(gòu)保守的SMXL7成員，暗示其具有SMXL7 相似的蛋白功能。擬南芥中SMXL7 主要在腋芽和側(cè)枝中表達(dá)，調(diào)控腋芽萌發(fā)和側(cè)枝發(fā)育[18]。在荔枝中LcSMXL7 組成型表達(dá)，在莖、種子、花穗、葉片、雄花和果皮中均有一定的表達(dá)量，暗示LcSMXL7 在多個器官和組織中調(diào)控荔枝的生長發(fā)育。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示該基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核，暗示該蛋白與SMXL7 一樣，可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子行使功能[13]。轉(zhuǎn)基因結(jié)果顯示過表達(dá)LcSMXL7 的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系分枝數(shù)量顯著提高，說明該基因可促進(jìn)植物的分枝發(fā)育，是分枝發(fā)育的正調(diào)控因子，也證明該基因功能保守，與擬南芥SMXL7 功能類似。鑒于LcSMXL7 在花穗中有一定的表達(dá)量，且能夠促進(jìn)擬南芥分枝生長發(fā)育，推測該基因在荔枝花穗分枝發(fā)育過程中起到重要作用。

綜上所述，本研究從荔枝中克隆到1 個荔枝獨腳金內(nèi)酯的早期響應(yīng)基因LcSMXL7，對其蛋白的基本理化性質(zhì)、表達(dá)模式、進(jìn)化關(guān)系和基因功能進(jìn)行分析。結(jié)果表明，LcSMXL7 在莖和種子中高表達(dá)，其編碼蛋白擁Clp 和AAA_2 結(jié)構(gòu)域，是一個典型的D53/SMXLs 家族成員。該蛋白定位于細(xì)胞核，是一個分枝形成的正調(diào)控因子。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示荔枝花穗分枝發(fā)育提供了重要線索，關(guān)于其在荔枝花穗發(fā)育中的功能還有待進(jìn)一步研究。