西洛他唑改善2型糖尿病小鼠腸黏膜屏障損傷的機(jī)制

宋平義,蔣世秋,胡 娟,檀佳璐,楊 嵐,王 強(qiáng)

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉手術(shù)部&腦科學(xué)中心,陜西西安 710061)

腸黏膜屏障是將體內(nèi)、體外環(huán)境分開(kāi),并參與維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要防御屏障。腸黏膜屏障的完整性具有保護(hù)機(jī)體免受腸道有害微生物及其代謝物影響的作用[1]。2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者腸黏膜屏障功能受損可導(dǎo)致微生物產(chǎn)物全身性內(nèi)流,從而增加腸道感染風(fēng)險(xiǎn)和全身炎癥風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。因此,維持腸黏膜屏障正常功能對(duì)于T2DM患者有至關(guān)重要的意義。

T2DM 患者血清中血小板P2Y12受體表達(dá)顯著增加并呈持續(xù)性激活狀態(tài),表現(xiàn)為血小板黏附、聚集和促凝作用的增強(qiáng),且有研究表明,慢性高血糖和餐后高血糖狀態(tài)與血小板活化增強(qiáng)相關(guān)[4-6]。同時(shí),抑制血小板活化可以改善膿毒癥腸屏障功能損傷,表明活化的血小板可能與膿毒癥時(shí)腸黏膜屏障功能受損有關(guān)[7]。西洛他唑是一種新型血小板聚集抑制藥,通過(guò)抑制炎癥改善T2DM 患者的代謝異常和全身胰島素抵抗,廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療多種糖尿病慢性并發(fā)癥[8-9]。研究表明,在非酒精性脂肪性肝病中,血小板依賴于P2Y12受體釋放的CD40 配體(CD40L)與CD40作用從而激活CD8+T 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫的作用[10]。血小板CD40L 還可通過(guò)誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞活化破壞高血壓大鼠模型的血腦屏障,從而介導(dǎo)腦的炎癥損傷[11]。然而,西洛他唑是否可以通過(guò)抑制血小板活化改善糖尿病腸黏膜屏障損傷尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選用db/db糖尿病小鼠和對(duì)照m/m 小鼠,采用西洛他唑干預(yù)的方式,通過(guò)檢測(cè)腸黏膜屏障功能以探究西洛他唑?qū)2DM 腸屏障損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體級(jí)別的8周齡雄性db/db小鼠和相同條件的對(duì)照m/m 小鼠,購(gòu)買(mǎi)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦科學(xué)研究中心SPF動(dòng)物房,室溫21～25℃,相對(duì)濕度50%～60%,12 h/12 h晝夜交替光照。db/db小鼠為每2～3只一籠,對(duì)照m/m 小鼠為每4只小鼠一籠進(jìn)行飼養(yǎng),可自由進(jìn)食與飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照西安交通大學(xué)動(dòng)物研究所制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過(guò)GEOquery 包從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE142153數(shù)據(jù)集,獲取糖尿病及對(duì)照組患者基因集。通過(guò)limma包Normalize Between Arrays函數(shù)再次標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù),利用limma包進(jìn)行差異分析(倍數(shù)變化＞2或＜0.5,P＜0.05)。差異分析結(jié)果用火山圖進(jìn)行可視化,差異基因用clusterProfiler包進(jìn)行富集分析。

1.3 材料與試劑

西洛他唑(cilostazol,cilo)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)MedChemExpress公司;sCD40L ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司;4 ku異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-葡聚糖(dextran)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma公司;兔抗CD40購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Abcam公司;兔 抗ZO-1 購(gòu) 買(mǎi) 自 美 國(guó)Affinity 公 司,兔 抗Occludin購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)ABclonal公司,兔抗β-Tubulin 購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)ABclonal公司。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù)

將db/db小鼠和對(duì)照m/m 小鼠隨機(jī)分為m/m+溶劑組、m/m+西洛他唑組、db/db+溶劑組、db/db+西洛他唑組,每組10只小鼠。其中m/m+西洛他唑組及db/db+西洛他唑組小鼠給予西洛他唑處理,西洛他唑溶解于5 g/L羧甲基纖維素鈉鹽(carboxymethyl cellulose sodium salt,cmc),m/m+溶劑組和db/db+溶劑組給予等量5 g/L羧甲基纖維素鈉鹽溶劑處理,采取灌胃給藥的方式,并根據(jù)體質(zhì)量大小以30 mg/(kg·d)的藥物劑量及等量溶劑給藥4周。

1.5 ELISA檢測(cè)CD40L水平

各組小鼠禁食12 h后,通過(guò)異氟烷麻醉小鼠并眼眶取血,室溫靜置2 h后,3 000 r/min離心10 min收集小鼠血清,并嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作,檢測(cè)血清可溶性CD40L(sCD40L)水平。

1.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

小鼠經(jīng)過(guò)異氟烷麻醉后,取小鼠小腸組織立即制備蛋白樣品或置于-80℃冰箱待用。在小腸組織中加入適量快速裂解液,并于冰上充分研磨及超聲破碎,將勻漿液以12 000 r/min轉(zhuǎn)速于4℃離心10 min,提取上清液并采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入適量5×蛋白上樣緩沖液,于100℃高溫處理使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)電泳分離后,以恒流轉(zhuǎn)膜,封閉采用50 m L/L脫脂牛奶于常溫下孵育1～2 h,之后置于適量的一抗溶液中(兔抗CD40、兔抗ZO-1、兔抗Occludin、兔 抗β-Tubulin),4℃孵 育 過(guò) 夜 后,進(jìn) 行10 min×3次洗膜處理。二抗于室溫孵育1～2 h后,再次進(jìn)行洗膜處理。利用ECL發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光顯像,拍攝后的圖像使用Image J分析。

1.7 腸道通透性檢測(cè)

小鼠過(guò)夜禁食后,用4 ku異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FITC-dextran)溶液對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理。經(jīng)過(guò)1.5 h后,小鼠眼眶取血,于激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm 條件下,檢測(cè)熒光吸光度值。

1.8 腸道含水量測(cè)定

測(cè)定小鼠腸道組織含水量以評(píng)估小鼠腸道水腫的程度。取小鼠新鮮小腸組織,立即稱重,此時(shí)記為組織濕重。隨后將組織置于60℃烘干48 h后再次稱重,此時(shí)為組織干重,計(jì)算含水量(%)=(組織濕重-組織干重)/組織濕重×100%。

1.9 腸道細(xì)菌計(jì)數(shù)

取小鼠腸系膜淋巴結(jié)組織、肺臟組織并分別將其勻漿處理,室溫離心提取上清液。經(jīng)過(guò)連續(xù)稀釋后,將500μL稀釋液均勻平鋪在TSA 瓊脂平板上,于37℃恒溫孵育24 h后進(jìn)行細(xì)菌含量計(jì)數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用Graphpad Prizm 軟件完成。連續(xù)變量選用單因素方差分析(Turkey事后檢驗(yàn)),計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病患者差異基因富集通路分析

通過(guò)提取GSE142153數(shù)據(jù)集中10例對(duì)照組和23例糖尿病患者外周血單核細(xì)胞基因進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病患者共有109個(gè)基因上調(diào),73個(gè)基因下調(diào)(圖1)。差異基因富集在血小板活化、內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能等通路中,提示糖尿病患者存在血小板活化及內(nèi)皮屏障損傷。

圖1 糖尿病患者差異基因富集通路Fig.1 Differentially expressed genes enriched pathway of diabetic patients

2.2 西洛他唑抑制糖尿病小鼠體內(nèi)血小板的活化

ELISA 結(jié)果顯示,db/db小鼠血清中sCD40L表達(dá)量較對(duì)照m/m 小鼠明顯升高(P＜0.05),而給予西洛他唑處理后,db/db小鼠血清中sCD40L 表達(dá)水平下降(P＜0.05,圖2A)。除此之外,Western blotting結(jié)果顯示,與m/m 溶劑組小鼠相比,db/db溶劑組小鼠腸道組織中CD40蛋白水平升高(P＜0.05),db/db西洛他唑組小鼠腸道組織中CD40蛋白水平下降(P＜0.05,圖2B、圖2C)。

圖2 西洛他唑?qū)ρ錽CD40L水平及腸道CD40蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of cilostazol on serum sCD40L and intestinal CD40 expression

2.3 西洛他唑改善小鼠腸道通透性、含水量及腸道菌群含量

通過(guò)給各組小鼠給予4 ku FITC-dextran 溶液灌胃處理以檢測(cè)小鼠的腸道通透性,結(jié)果顯示,db/db溶劑組小鼠血清FITC 的濃度顯著高于m/m 溶劑組小鼠(P＜0.05);西洛他唑干預(yù)后,db/db西洛他唑組小鼠血清FITC 的濃度明顯降低(P＜0.05,圖3A)。與m/m 溶劑組相比,db/db溶劑組的腸道含水量明顯升高,腸組織明顯水腫(P＜0.05);db/db西洛他唑組腸道含水量明顯降低,腸組織水腫程度減輕(P＜0.05,圖3B)。通過(guò)小鼠腸道細(xì)菌平板計(jì)數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與m/m 溶劑組和m/m 西洛他唑組相比,db/db溶劑組腸系膜淋巴結(jié)及肺臟組織勻漿菌落數(shù)均明顯升高,西洛他唑的干預(yù)顯著降低了兩個(gè)部位的菌落數(shù)(P＜0.05,圖3C、圖3D)。

圖3 腸道通透性、含水量及組織菌落計(jì)數(shù)的比較Fig.3 The effect of cilostazol on the permeability of intestine

2.4 小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示,糖尿病db/db溶劑組小鼠腸道組織中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照m/m 溶劑組小鼠(P＜0.05);與db/db溶劑組小鼠相比,db/db西洛他唑組小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖4)。

3 討 論

腸道屏障是機(jī)體隔絕內(nèi)環(huán)境與腸道毒素的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。T2DM 患者往往伴隨腸道屏障損傷,一旦出現(xiàn)外界刺激,將大大增加其炎癥感染和罹患膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)。遺憾的是,T2DM 腸道屏障損傷機(jī)制仍未闡明。研究表明,抑制血小板活化可以改善小鼠腸黏膜屏障損害[7],而糖尿病導(dǎo)致的慢性高血糖在內(nèi)的代謝異?？赡軐?dǎo)致體內(nèi)血小板活化,嚴(yán)格控制代謝功能等方法可減少體內(nèi)血小板的活化[12]。本研究通過(guò)對(duì)糖尿病與非糖尿病患者的外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其差異基因在血小板活化和上皮屏障相關(guān)通路富集,進(jìn)而證實(shí)抗血小板藥物西洛他唑可抑制血小板活化,下調(diào)CD40-CD40L 信號(hào)通路、改善腸道通透性和含水量,提高腸道緊密連接蛋白表達(dá),為改善糖尿病腸道屏障功能提供了新策略和新靶點(diǎn)。

本研究借助GSE142153數(shù)據(jù)集中10例對(duì)照組和23例糖尿病患者外周血單核細(xì)胞基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)差異基因富集在血小板活化、內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能等通路中,在一定程度上可以反映糖尿病患者體內(nèi)基因的表達(dá)變化趨勢(shì)。由于人與小鼠基因具有高度同源性,我們推測(cè)模式動(dòng)物體內(nèi)具有相似變化。然而,使用外周血基因變化推測(cè)腸道變化存在組織間差異,因此,本研究通過(guò)后續(xù)血液及腸道組織相關(guān)實(shí)驗(yàn)予以證明,完善了相應(yīng)證據(jù)。當(dāng)然,基于本研究結(jié)果,針對(duì)二代測(cè)序組織特異性不足這一缺陷,我們將在后期展開(kāi)針對(duì)腸道的組學(xué)分析,進(jìn)一步探索糖尿病腸道屏障功能損傷的下游分子機(jī)制。

血小板是屏障功能的重要調(diào)控者,在維持血腦屏障、血?dú)馄琳虾脱c屏障等功能中具有關(guān)鍵作用[13]。同時(shí),血小板因其包含數(shù)百種可分泌蛋白,在靜息和活化狀態(tài)對(duì)屏障功能的調(diào)控展現(xiàn)出雙向作用,即靜息態(tài)血小板往往維持屏障功能穩(wěn)定,而活化態(tài)血小板卻表現(xiàn)出損傷屏障功能的傾向[14]。糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥患者體內(nèi)sCD40L 水平異常升高,并且T2DM 與sCD40L 水平升高在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者中呈現(xiàn)獨(dú)立相關(guān)[15-16]?；罨难“迨莝CD40L的主要來(lái)源,而CD40-CD40L 信號(hào)通路參與糖尿病在內(nèi)的多種炎癥性疾病的病理生理過(guò)程[17]。研究表明,西洛他唑可降低T2DM 患者體內(nèi)的C 反應(yīng)蛋白和sCD40L的水平,從而延緩其動(dòng)脈粥樣硬化和慢性炎癥的進(jìn)展[18]。我們的研究結(jié)果顯示,糖尿病小鼠血清中sCD40L明顯升高,腸道組織CD40的表達(dá)量顯著增加,而西洛他唑干預(yù)可明顯改善血清sCD40L和腸道組織CD40的表達(dá)水平。

既往研究發(fā)現(xiàn),西洛他唑可以通過(guò)抑制血小板與其他免疫細(xì)胞的相互作用來(lái)改善小鼠腸道炎癥及損傷[19-20]。為進(jìn)一步證實(shí)西洛他唑是否可改善T2DM小鼠腸道屏障功能,本研究針對(duì)T2DM 小鼠腸道屏障功能研究發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠腸道黏膜屏障明顯受到破壞,表現(xiàn)為腸道通透性、含水量、組織勻漿菌落數(shù)明顯增加,腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 表達(dá)水平下降,而西洛他唑治療明顯緩解了糖尿病小鼠腸道黏膜屏障的損傷,提示其對(duì)改善糖尿病小鼠屏障功能的有效性。當(dāng)然,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅僅為西洛他唑改善T2DM 屏障功能提供了實(shí)驗(yàn)室證據(jù)和理論依據(jù),其具體作用仍待臨床多中心大樣本研究證實(shí)。

綜上,本研究表明西洛他唑可能通過(guò)抑制血小板活化,減少血清及腸道組織中sCD40L 和CD40的表達(dá),進(jìn)而改善糖尿病小鼠腸道黏膜屏障的破壞。本研究為西洛他唑?qū)2DM 及其相關(guān)并發(fā)癥的影響及其潛在作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。