花楸屬直脈組7種/變種基因組大小及葉表皮微形態(tài)特征的分類學(xué)意義

邱 靖,李嘉寶,朱大海,陳 昕

(1.南京林業(yè)大學(xué),南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210037;2.三江學(xué)院,江蘇 南京 210012;3.龍溪-虹口國家級自然保護(hù)區(qū),四川 成都 611830)

花楸屬(Sorbus)隸屬于薔薇科蘋果亞科,主要分布于北半球的溫帶地區(qū),我國是該屬的物種多樣性分布中心[1]。該屬通常分為6個亞屬:復(fù)葉的花楸亞屬(subg.Sorbus)和subg.Cormus;單葉的白花楸亞屬(Subg.Aria)、水榆亞屬(Subg.Micromeles)、Subg.Chamaemespilus和subg.Torminalis[2],或?qū)⑺芎虲hamaemespilus亞屬并入白花楸亞屬而分為4個亞屬[3]。分子系統(tǒng)學(xué)研究多認(rèn)為花楸屬為復(fù)系,支持將亞屬提升到屬的地位[4-6],但也有研究表明亞屬間界限不清晰,各自不能形成單系[7]。

不僅花楸屬的界定和屬下分類存在分歧,物種數(shù)量和種間親緣關(guān)系認(rèn)知也存在顯著不同[3,8-9]。直脈組(SorbusSect.Alnifoliae)即是很好例證。直脈組是Aldasoro等[3]最新單葉花楸屬植物分類修訂中白花楸亞屬的7個組之一,包括水榆花楸[S.alnifolia(Sieb. et Zucc.)K. Koch]、石灰花楸[S.folgneri(C.K. Schneid.) Rehder]、日本花楸[S.japonica(Decne)Hedl]、神農(nóng)架花楸(S.yuanaSpongberg)和長果花楸(S.zahlbruckneriC.K. Schneid.)5種。直脈組的界定同俞德浚等[10]的直脈系(Ser.AlnifoliaeT.T. Yu)差異很大。直脈系4種植物中僅水榆花楸1種被置于直脈組,且水榆花楸的兩個變種棱果花楸(S.alnifoliavar.angulataS. B. Liang)和裂葉水榆花楸(S.alnifoliavar.lobulataRehd.)均被作為日本花楸的異名處理。

基因組大小是指染色體基數(shù)x的DNA含量Cx值,或體細(xì)胞的DNA含量2C值。被子植物的基因組大小相差約2 400倍[11]?；蚪M大小差異不僅存在于不同物種之間,還存在于同一物種不同倍性的個體之間。同種植物的2C值有隨染色體倍性增加而成倍增加的趨勢[12],同屬植物的2C值亦有隨倍性加大而增加的趨勢[13]。因而,2C值作為物種的重要特征,不僅可為物種的分類界定和親緣關(guān)系理解提供依據(jù),2C值與染色體計數(shù)相結(jié)合,還可準(zhǔn)確判斷植物倍性。花楸屬植物倍性復(fù)雜,基因組大小測定是該屬植物倍性判斷和系統(tǒng)演化理解的重要方法[14-17]。

葉表皮形態(tài)特征是植物本身遺傳特性表達(dá),具有分類學(xué)研究價值[18-19]。葉表皮細(xì)胞大小同基因組大小之間還存在著一定的相關(guān)性。同一物種多倍體個體的細(xì)胞顯著大于它們的二倍體祖先[20],不同物種的基因組大小同表皮細(xì)胞和氣孔大小也呈現(xiàn)正相關(guān)[21]。葉表皮特征尤其是氣孔特征還同物種生態(tài)環(huán)境適應(yīng)策略密切關(guān)聯(lián)[22]。因而,細(xì)胞大小、基因組大小、倍性特征及其相關(guān)性具有分類、生態(tài)適應(yīng)和生活史對策上的研究價值[23]。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對直脈組植物的基因組大小進(jìn)行測定并推斷其倍性,利用光學(xué)和電子顯微鏡對葉表皮細(xì)胞和氣孔的定性和定量性狀進(jìn)行分析,以期探討基因組大小和葉表皮特征的分類學(xué)意義以及基因組大小同倍性和細(xì)胞大小之間的相關(guān)性,同時為棱果花楸和裂葉水榆花楸的分類處理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以花楸屬直脈組5種花楸:水榆花楸、石灰花楸、日本花楸、神農(nóng)架花楸和長果花楸,以及具有分類爭議的2個變種裂葉水榆花楸和棱果花楸為研究對象。每居群選擇3個單株,單株間距50 m以上。采集上述花楸野生居群中成年單株的健康葉片,硅膠干燥,-80 ℃低溫保存?zhèn)溆?采集完整葉片壓干;憑證標(biāo)本保存于南京林業(yè)大學(xué)標(biāo)本館(NF),標(biāo)本采集信息見表1。

表1 花楸屬直脈組植物采集信息

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組大小測定

以水稻品種日本晴(Oryzasativasubsp.japonica‘Nipponbare’; 2C=0.91 pg)為內(nèi)標(biāo),取待測樣品1 cm2與等量內(nèi)標(biāo)共同置于1 mL預(yù)冷的WPB解離液[24]中,用鋒利的刀片快速切碎。用38 μm (400 目)的濾網(wǎng)過濾,獲得細(xì)胞核懸浮液。隨后向其中加入 50 μL 預(yù)冷的 PI 染液,置于 4 ℃冰箱避光染色 10 min。采用 BD Influx 流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品檢測,低速收集 5 000～10 000 個顆粒。選用 488 nm 藍(lán)光激發(fā) PI,于 FL2 通道收集 PI 發(fā)射的熒光強(qiáng)度;每個樣本做 3 次平行測定。

使用BD Influx自帶軟件FACSTMSortware1.0.0.650對圖像及檢測結(jié)果進(jìn)行處理。樣本基因組大小的計算公式為:待測樣本基因組大小為待測樣本G0或G1峰熒光均值與對照樣本G0或G1峰熒光均值之比與對照樣本基因組大小之積。其中,G0為分裂停止期,G1為細(xì)胞DNA復(fù)制未開始期。變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)控制在5%以內(nèi)。

1.2.2 葉表皮微形態(tài)特征觀察測量

光學(xué)顯微鏡觀察。從每種/變種花楸中隨機(jī)選取成熟葉片2片,在盡量避開中脈及較大側(cè)脈的每一葉片中部切取面積5 mm × 5 mm的小塊2塊,加入沸水中煮40 min將其軟化。隨后將葉片轉(zhuǎn)移至冰醋酸與30%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫的等比混合液中,于60 ℃下水浴加熱14～16 h至葉片全白且有透明氣泡出現(xiàn),便可將葉片取出,用鑷子輕輕分離上下表皮并除去殘留葉肉。將分離好的上下表皮置于1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))番紅-50%(體積分?jǐn)?shù))酒精溶液中染色20 min,取出表皮放入蒸餾水中漂洗約20 min。最后用中性樹膠封片,于室內(nèi)自然晾干。在Nikon Eclipse Ci-S(日本)光學(xué)顯微鏡的40倍物鏡下隨機(jī)選取每種植物的5個上表皮視野和10個下表皮視野進(jìn)行觀察和拍照。從視野中隨機(jī)選取上、下表皮細(xì)胞及氣孔器各50個,用ImageJ 1.4.8軟件測量表皮細(xì)胞面積、氣孔器長、寬及氣孔面積。統(tǒng)計單位視野內(nèi)氣孔數(shù)和表皮細(xì)胞數(shù),計算氣孔密度(DS)和氣孔指數(shù)(IS)。計算公式如下:DS=S/N,IS=[S/E+S)]× 100%。式中:N為單位視野面積,S為單位視野面積上的氣孔數(shù),E為相同面積內(nèi)的表皮細(xì)胞數(shù)。

掃描電鏡觀察。先用毛筆輕輕拂去葉片表面灰塵,每種葉片切取 5 mm × 5 mm 的小塊,在 FEI-Quanta 200 掃描電子顯微鏡(美國)下對上、下表皮進(jìn)行拍照、觀察及記錄。

氣孔器所用術(shù)語參考Dilcher[25]、王宇飛等[26];葉片角質(zhì)膜及蠟質(zhì)紋飾所用的術(shù)語參考Barthlott等[27]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行統(tǒng)計處理,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示,利用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組大小

由花楸屬直脈組7種/變種基因組流式直方圖見圖1。

P1.水稻‘日本晴’(Oryza sativa subsp. japonica‘Nipponbare’);P2.樣品材料sample。

由圖1可見,內(nèi)標(biāo)峰和樣品峰區(qū)分度良好,顯示了水稻日本晴作為內(nèi)標(biāo)測定的數(shù)據(jù)可靠性?；ㄩ睂僦泵}組植物2C值和Cx值分別介于1.348～1.586 pg和 0.674～0.793 pg(表2),長果花楸2C值最大且顯著高于其他類群,神農(nóng)架花楸值最小且顯著低于其他類群。水榆花楸及其變種棱果花楸和裂葉水榆花楸2C值和1C值差異不顯著,三者顯著高于日本花楸。

表2 花楸屬直脈組植物的基因組大小及倍性水平

依據(jù)C值庫(https: //cvalues. science. kew. org/)中花楸屬植物不同倍性的2C值變化區(qū)間,推斷直脈組植物均為二倍體。

2.2 葉表皮微形態(tài)特征

2.2.1 葉表皮細(xì)胞微形態(tài)特征

直脈組花楸的葉表皮細(xì)胞兼具多邊形和不規(guī)則形或僅具不規(guī)則形。垂周壁隆起或凹陷,多邊形細(xì)胞的垂周壁有平直和弧形兩種樣式,不規(guī)則形細(xì)胞的垂周壁呈波狀。裂葉水榆花楸(圖2C)和長果花楸(圖2G)的上、下表皮均為不規(guī)則形,其他5個分類群則兼具多邊和不規(guī)則形。

1.上表皮adaxial epidermis; 2.下表皮abaxial epidermis。A.水榆花楸S. alnifolia;B.棱果花楸S. alnifolia var. angulata;C.裂葉水榆花楸S. alnifolia var. lobulata;D.石灰花楸S. folgneri;E.日本花楸S. japonica;F.神農(nóng)架花楸S. yuana;G.長果花楸S. zahlbruckneri。下同。The same below.

垂周壁凹陷平周壁隆起的僅見于棱果花楸上下表皮(圖3B)和石灰花楸上表皮(圖3D),其他分類群均為垂周壁隆起,平周壁凹陷。

a、b.上表皮 adaxial epidermis (a. 800×;b. 3 000×);c、d、e.下表皮 abaxial epidermis (c. 200×,d. 800×;e. 3 000×)。

細(xì)胞表面紋飾有局部加厚、脊?fàn)盥∑?、皺褶、網(wǎng)紋、光滑5種類型,局部加厚最為常見。葉表皮微形態(tài)部特征見表3。結(jié)合電鏡下葉表皮特征(圖3)可知,棱果花楸近光滑的上表皮(圖3B)、石灰花楸脊?fàn)盥∑鸬纳媳砥?圖3D)、日本花楸網(wǎng)紋狀的上表皮(圖3E)使三者易于同其他類群區(qū)分開來。表皮蠟質(zhì)紋飾平滑層、殼狀、顆粒狀、片狀、線狀5種類型,平滑層見于水榆花楸(圖3A)和長果花楸(圖3G),其他分類群為殼狀;顆粒狀為共有紋飾(圖3);片狀、線狀則同時出現(xiàn)在水榆花楸(圖3A)、裂葉水榆花楸(圖3C)和長果花楸(圖3G)中,棱果花楸的下表皮(圖3B)和石灰花楸的上表皮(圖3D)具線狀紋飾。

表3 花楸屬直脈組植物葉表皮微形態(tài)特征(定性性狀)

分類群間的表皮細(xì)胞面積差異顯著。上表皮細(xì)胞面積介于605.05～967.63 μm2,下表皮細(xì)胞面積介于496.84～826.62 μm2(表4)。長果花楸的上、下表皮面積均最大且顯著大于其他分類群,神農(nóng)架花楸的上表皮面積最小,下表皮面積大于石灰花楸但顯著小于另5個分類群。裂葉水榆花楸和日本花楸的上下表皮細(xì)胞均顯著大于水榆花楸和棱果花楸。

表4 花楸屬直脈組植物葉表皮細(xì)胞與氣孔數(shù)量微形態(tài)特征(定量性狀)

2.2.2 氣孔器微形態(tài)特征

花楸屬直脈組植物的氣孔器均分布在葉片下表皮脈間區(qū),氣孔器都由兩個腎形保衛(wèi)細(xì)胞組合而成,無副衛(wèi)細(xì)胞,氣孔類型均為無規(guī)則型(圖2)。

氣孔器多呈橢圓形或圓形,氣孔器長度介于24.41～30.81 μm,分類群間無顯著差異。氣孔器寬度和面積分別介于19.58～22.87 μm和457.59～564.55 μm2,兩者在分類群間存在顯著差異(表4)。裂葉水榆花楸的氣孔器長、寬、面積3項指標(biāo)均為最低,長果花楸氣孔最長,棱果花楸氣孔最寬且面積最大。

保衛(wèi)細(xì)胞凸起或平,不凹陷。除裂葉水榆花楸(圖3C)而外,其他6個分類群均具有完全或不完全的環(huán)形外緣,其中水榆花楸(圖3A)、棱果花楸(圖3B)和石灰花楸(圖3D)氣孔兩極T狀加厚。氣孔紋飾有殼狀、顆粒狀、片狀或近光滑。

氣孔密度介于101.82～265.02 個/mm2,日本花楸最低,棱果花楸密度最大,后者是前者的2.01倍。氣孔指數(shù)為7.64%～17.08%,棱果花楸最高,日本花楸最低。

2.2.3 表皮毛

直脈組植物成熟葉片的表皮具毛或光滑。具毛的植物有石灰花楸(圖3D)、日本花楸(圖3E)、神農(nóng)架花楸(圖3F)和長果花楸(圖3G)4種,且毛狀體均位于下表皮且呈帶狀。石灰花楸的毛被最密,覆被下表皮致使細(xì)胞形狀和紋飾均不可見。水榆花楸及其變種棱果花楸、裂葉水榆花楸葉表皮光滑(表3)。

2.3 相關(guān)性分析

基因組大小與葉表皮性狀之間、表皮性狀各特征之間的相關(guān)性分析結(jié)果如表5。由表5可見,基因組大小與上、下表皮細(xì)胞面積以及氣孔器長、寬、面積均呈正相關(guān),而同氣孔密度和氣孔指數(shù)呈負(fù)相關(guān)?；蚪M大小與上表皮細(xì)胞面積呈顯著正相關(guān)(R=0.737,P<0.05),與氣孔器長度相關(guān)性位列第2(R=0.562)。表皮性狀各特征之間相關(guān)性最大的為氣孔密度和氣孔指數(shù),其次為氣孔長寬和氣孔面積,均呈極顯著相關(guān)(P<0.01);上下表皮細(xì)胞面積之間呈顯著正相關(guān),而上下表皮細(xì)胞面積與氣孔密度之間也均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表5 花楸屬直脈組植物的基因組大小與葉表皮性狀的相關(guān)系數(shù)

3 討 論

花楸屬直脈組植物Cx值為0.674～0.793 pg,同薔薇科其他屬一樣[28],均屬于極小基因組(Cx≤1.4 pg)?；诹魇郊?xì)胞術(shù)(FCM)倍性推斷的可靠性因類群而異,如同屬蘋果亞科(Maloideae),2C值在唐棣屬(Amelanchier)的不同倍性之間分化良好[29],在山楂屬(Crataegus)不同倍性之間則存在重疊區(qū)域[30]?；ㄩ睂僦参锊煌缎缘?C值區(qū)分良好,不存在重疊區(qū)域,基于FCM基因組大小測定的倍性推斷可靠性高[16-17]。本實驗直脈組植物均為二倍體,2C值的最高值在前期報道范圍內(nèi),而最低值為1.348,較前期報道略低;水榆花楸而外的6個分類群基因組大小為首次報道[27]。原產(chǎn)歐洲的白花楸亞屬植物有2x、3x、4x、5x4種倍性水平,多倍體和無融合生殖類群數(shù)量眾多[31],該亞屬在亞洲尚無多倍體報道,亞洲是否存在多倍體還需進(jìn)一步的實驗研究。

葉表皮特征在薔薇科具有重要的分類價值[32-33]。直脈組植物葉表皮具有一定的共同特征,如均具有等徑或伸長的細(xì)胞、氣孔均分布于下表皮且均為無規(guī)則形等,但其表皮紋飾、蠟質(zhì)類型、氣孔特征等同蘋果亞科的蘋果屬(Malus)[34]、山楂屬[13]、乃至花楸屬復(fù)葉組[35]差異較大。直脈組的葉表皮綜合特征可以為組內(nèi)物種鑒定提供有價值的依據(jù),通過細(xì)胞形狀可以將該組分為兩類,僅具有不規(guī)則形細(xì)胞的裂葉水榆花楸和長果花楸,兩種可以通過氣孔是否具有環(huán)形外緣進(jìn)一步區(qū)分開來,兼具多邊形和不規(guī)則形的5個分類群可以通過毛被有無及疏密、垂周壁凹陷或隆起、表皮紋飾等進(jìn)行區(qū)分。爭議分類群裂葉水榆花楸的上、下表皮均為不規(guī)則形、棱果花楸的垂周壁凹陷平周壁隆起,加之兩者的表皮細(xì)胞和氣孔的大小和紋飾,可以將兩者同水榆花楸和日本花楸明確區(qū)分;日本花楸網(wǎng)紋狀紋飾使之顯著區(qū)別于其他6個分類群。因而本研究不支持Aldasoro等[3]將棱果花楸和裂葉水榆花楸作為日本花楸異名的分類處理。

基因組大小和細(xì)胞大小的相關(guān)性在植物界普遍存在,本研究也為這種相關(guān)性提供了佐證。基因組大小對細(xì)胞大小,尤其是氣孔大小和密度的影響,進(jìn)而可能影響植物的生理活動,在生態(tài)適應(yīng)和生活史對策上起做重要的作用[21];與此同時,氣孔也會在一定程度上通過響應(yīng)環(huán)境變化而推動基因組大小進(jìn)化[22]。本研究中各個種的采集地和海拔有很大差異,其基因組大小與細(xì)胞特征是否會隨環(huán)境變化而呈現(xiàn)不同的適應(yīng)響應(yīng)還需要更多居群的研究證據(jù)。