偶聯(lián)斑蝥素的納米介孔碳靶點(diǎn)“鉤釣”載體平臺研究

熊麗娟,何 清,袁曉艷,張 艷,張建永,余 明

(遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 遵義 563099)

斑蝥為芫青科昆蟲南方大斑蝥(mylabris phalerata pallas)或黃黑小斑蝥(mylabris cichorii linnaeus)的干燥體。已被證明具有明確的抗癌療效,是我國發(fā)現(xiàn)最早的具有抗腫瘤作用的傳統(tǒng)中藥之一,入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有破血逐瘀、散結(jié)消癥、攻毒蝕瘡之功,藥用歷史可以追溯到公元前1世紀(jì)［1]。斑蝥素(cantharidin)是一種單萜烯類化合物(圖1),為斑蝥中主要活性成分?，F(xiàn)有臨床研究表明,斑蝥素及其衍生物具有良好的抗肝癌作用,同時(shí)可增加機(jī)體免疫力,已被開發(fā)成上市藥物,圍繞其開發(fā)的衍生藥物斑蝥素酸鈉等抗肝癌效果也較好［2-4]。然而斑蝥素抗肝癌作用的藥效機(jī)制、分子靶點(diǎn)至今尚不明確,大大限制其在臨床的使用。目前,針對斑蝥素及其衍生物的抗肝癌作用機(jī)制的研究主要集中在蛋白相關(guān)性的研究,包括阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［5-7],未能深入和確切地揭示斑蝥素發(fā)揮抗肝癌作用與增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用機(jī)制。斑蝥素分子直接作用靶點(diǎn)的探明可能是揭示斑蝥素發(fā)揮抗肝癌作用的關(guān)鍵突破口,獲取并且鑒定斑蝥素的分子作用靶點(diǎn)將有助于深入了解斑蝥素與肝腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡的相關(guān)機(jī)制,進(jìn)而闡釋斑蝥素抗肝癌的分子作用機(jī)理,從而為斑蝥素的臨床安全使用提供依據(jù)。雖然目前有大量報(bào)道闡明蛋白磷酸2A(PP2A)是斑蝥素抗肝癌潛在作用靶點(diǎn)［8-9],但也有大量研究發(fā)現(xiàn),斑蝥素作為PP2A抑制劑,在PP2A過表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞中仍有顯著的腫瘤抑制作用［10],故PP2A有可能并非斑蝥素的唯一分子作用靶點(diǎn),因此有必要開展斑蝥素抗肝癌靶點(diǎn)的鑒定研究。

圖1 斑蝥素

分子靶點(diǎn)“鉤釣”技術(shù)是目前應(yīng)用十分廣泛的藥物分子靶點(diǎn)識別方法［11]。分子靶點(diǎn)“鉤釣”技術(shù)基于蛋白質(zhì)可與藥物分子發(fā)生特異性結(jié)合的原理,將藥物分子通過化學(xué)反應(yīng)連接到固相微球表面的功能基上,進(jìn)而將靶點(diǎn)蛋白捕獲并富集到固相微球表面,使之得以分離、純化和鑒定的一種靶點(diǎn)鑒定方法［12]。其中固相載體材料通過共價(jià)鍵合藥物而有效實(shí)現(xiàn)藥物與靶點(diǎn)蛋白的富集,目前基于該技術(shù),人們已經(jīng)成功地捕獲了一些藥物的直接作用靶點(diǎn),并基于此靶點(diǎn)闡明該藥物的分子作用機(jī)制。例如,通過制備鍵合首薈通便膠囊藥材總提取物的磁性固相微球,獲得首薈通便膠囊的潛在作用靶點(diǎn)蛋白(CNOT4、GSK3β等138個(gè)靶點(diǎn)蛋白)［13];通過構(gòu)建一種表面鍵合有肉蓯蓉苯乙醇苷的瓊脂糖固相微球,獲得了肉蓯蓉腦保護(hù)作用相關(guān)靶點(diǎn)蛋白(HSP90、78GRP等18個(gè)靶點(diǎn)蛋白)等［14]。該技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于藥物與固相載體平臺的有效鍵合或偶聯(lián)且不影響該藥物藥效。但目前尚無針對斑蝥素特性與結(jié)構(gòu)特征(單萜烯結(jié)構(gòu))且鍵合斑蝥素后將其用于分子作用靶點(diǎn)“鉤釣”的固相載體材料。因此,針對斑蝥素分子結(jié)構(gòu)直接作用靶點(diǎn)“鉤釣”的固相載體材料亟需開發(fā),為斑蝥素抗肝癌分子作用靶點(diǎn)“鉤釣”奠定平臺基礎(chǔ)。

基于此,本實(shí)驗(yàn)擬設(shè)計(jì)合成一類可用于偶聯(lián)斑蝥素的納米碳材料,對材料相關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,并研究其與斑蝥素的偶聯(lián)作用,以及偶聯(lián)斑蝥素后固相載體平臺的生物相容性和抗肝癌活性評價(jià),為斑蝥素抗肝癌分子作用靶點(diǎn)“鉤釣”與鑒定研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器 DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華股份有限公司);85-2恒溫磁力攪拌器(鄭州市亞榮儀器有限公司);SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀(德國BRUKER公司);JW-BK122W靜態(tài)氮吸附儀(北京精微高博科學(xué)技術(shù)有限公司);Zesscars掃描電子顯微鏡(德國carzeiss公司);OTF真空管式高溫?zé)Y(jié)爐(合肥科晶材料技術(shù)有限公司);DZF-250真空干燥箱(上海亞榮有限公司);AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);311二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);XD-202倒置顯微鏡(中國南京江南永新光學(xué)有限公司)。

1.2 試劑 甲醛(安耐吉化學(xué),純度37%);苯酚(安耐吉化學(xué),純度37%);嵌段共聚物Pluronic F127(安耐吉化學(xué),分析純);氫氧化鈉(成都金山化學(xué)試劑有限公司,分析純);硝酸(安耐吉化學(xué),分析純);乙醇(上海泰坦科技股份有限公司,分析純);斑蝥素(CTD)(成都埃法生物科技有限公司,純度98%);聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(河北百靈威超精細(xì)材料有限公司,分析純);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(安耐吉化學(xué),純度98%);二甲基亞砜(安耐吉化學(xué),99.7%);DMEM-12(1∶1)培養(yǎng)基(中國大連每輪生物技術(shù)有限公司);0.2%胰蛋白酶(美國GIbco公司);PBS緩沖液(中國大連侖生物技術(shù)有限公司);胎牛血清(美國Sigma公司);CCK-8試劑盒［東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]。

1.3 偶聯(lián)斑蝥素介孔碳的制備

1.3.1 介孔碳的制備 (1)MCN-COOH-1的合成:取苯酚1.20 g、4.20 mL甲醛溶液(37%)以及30.0 mL(0.1 mol/L)的氫氧化鈉溶液加入250 mL圓底燒瓶中,在69 ℃反應(yīng)0.6 h得低階酚醛樹脂碳質(zhì)前驅(qū)體。接著將溶解有1.92 g三嵌段共聚物泊洛沙姆F127(Mw=12600,PEOl06PP070PE0106)的30.0 mL去離子水加入到低階酚醛樹脂中;兩者混合均勻后,在69 ℃的攪拌3 h后加入100 .0 mL水,繼續(xù)反應(yīng)12～16 h,得到前驅(qū)體溶液Solution P。隨后取25.0 mL Solution P、40.0 mL的水混勻后在130 ℃水熱反應(yīng)12 h。待釜溫降至室溫,抽濾水熱后的產(chǎn)物,取濾餅,并用去離子水和乙醇分別洗滌3次,最后于50 ℃下烘干得深棕色粉末。將該深棕色粉末置于真空管式氣氛爐中,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下,于700 ℃ (升溫速率5 ℃/min)焙燒1 h,得到介孔碳初胚。進(jìn)一步將該初胚與一定量的30%硝酸在70 ℃下回流12 h后,抽濾,取濾餅,并用去離子水洗滌3次至中性,烘干得氧化介孔碳MCN-COOH-1。(2)MCN-COOH-2的合成:取苯酚6.00 g、21.0 mL甲醛溶液(37%)以及90.0 mL(0.1 mol/L)的氫氧化鈉溶液于69 ℃反應(yīng)0.6 h得低階酚醛樹脂。接著將溶解有0.30 g三嵌段共聚物Pluronic F127和0.10 g CTAB的20.0 mL乙醇溶液加入到20.0 mL低階酚醛樹脂中;兩者混勻后,在69 ℃攪拌3 h。之后在攪拌條件下加入100.0 mL水后繼續(xù)反應(yīng)12～16 h。隨后取25.0 mL上述混合溶液與40.0 mL的水混勻后在130 ℃水熱處理12 h,之后進(jìn)行分離、干燥、焙燒、硝化即得氧化介孔碳MCN-COOH-2。

1.3.2 氨基功能化的介孔碳偶聯(lián)斑蝥素制備 將制備的介孔碳(MCN-COOH-1與MCN-COOH-2)分別與 1-乙基3(3-二甲基氨基丙基)鹽酸碳二酰亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和斑蝥素(CTD)分散體加入10.0 mL DMSO于70 ℃反應(yīng)12 h后,抽濾,取濾餅,乙醇和去離子水將濾餅各洗滌3次,干燥后得MCN-COOH-1@NH2@CTD和MCN-COOH-2@NH2@CTD。

1.4 結(jié)構(gòu)表征和性能測試

1.4.1 結(jié)構(gòu)表征方法 通過靜態(tài)氮吸附儀(JW-BK122W)測定不同合成工藝所制得的介孔碳材料的比表面積與相關(guān)孔結(jié)構(gòu)參數(shù);利用FT-IR(德國BRUKER公司生產(chǎn)的VERTEX70)測試偶聯(lián)斑蝥素前后介孔碳的化學(xué)組成;采用SEM(德國carzeiss公司生產(chǎn)的Zesscars)觀察合成介孔碳偶聯(lián)斑蝥素前后的表面形貌。

1.4.2 介孔碳偶聯(lián)斑蝥素的細(xì)胞毒性 (1) CCK-8法測定空白納米載體的細(xì)胞毒性:首先,將HepG2細(xì)胞接種在96孔板中(1.0×105個(gè)/mL)并孵育24 h。正常對照組和調(diào)零組各孔加完全培養(yǎng)基100 μL,MCN-COOH和MCN-COOH@NH2實(shí)驗(yàn)組各分4個(gè)不同的濃度,在同一板上加入濃度10、20、40、60 μg/mL的完全培養(yǎng)基各100 μL;在37 ℃下進(jìn)一步孵育24 h。為了檢測細(xì)胞活性,首先去除培養(yǎng)基,接著用PBS洗滌,然后向每孔加入完全培養(yǎng)基90 μL+CCK-8 10 μL,繼續(xù)放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h;置酶標(biāo)儀,檢測波長450 nm時(shí)各孔吸光度比值(A),記錄并保存結(jié)果。(2) 介孔碳偶聯(lián)斑蝥素對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用:采用CCK-8法初步評價(jià)納米載藥復(fù)合體MCN-COOH-1@NH2@CTD和MCN-COOH-2@NH2@CTD對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。MCN-COOH-1@NH2@CTD給藥組和MCN-COOH-2@NH2@CTD給藥組分別加入濃度5 μg/mL的完全培養(yǎng)基各100 μL;37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12 h。

2 結(jié)果

2.1 介孔碳比表面積和孔結(jié)構(gòu)特征 樣品介孔孔徑主要分布在2～6 nm,同時(shí)存在微孔結(jié)構(gòu)(表1)。MCN-COOH-1的等溫線顯示為典型IV型等溫線,且相對壓強(qiáng) P/P0<0.1時(shí),樣品MCN-COOH-1的氮?dú)馕搅考眲≡黾?表明存在大量的微孔;當(dāng)壓強(qiáng)P/P0在0.5～0.9時(shí),曲線出現(xiàn)明顯升溫滯回環(huán),這說明所制備的介孔碳材料中具有介孔孔隙的存在［15]。介孔碳MCN-COOH-2為典型的I型等溫線,且當(dāng)相對壓強(qiáng) P/P0<0.1時(shí),樣品MCN-COOH-2的氮?dú)馕搅考眲≡黾?表明存在大量的微孔;當(dāng)相對壓強(qiáng) P/P0在0.2～0.8,樣品MCN-COOH-2氮?dú)馕搅康脑鲩L極為緩慢,說明存在少量的介孔(圖2)。結(jié)合介孔碳的孔結(jié)構(gòu)參數(shù)分布(表1)可知,MCN-COOH-1與MCN-COOH-2孔結(jié)構(gòu)中均存在介孔結(jié)構(gòu)。

表1 不同投料比的介孔碳的孔結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖2 不同投料比介孔碳的吸附等溫線和孔徑分布

2.2 介孔碳偶聯(lián)斑蝥素前后表面官能團(tuán) 由圖3A 所示,載藥前的介孔碳MCN-COOH-1FT-IR圖譜中主要特征峰出現(xiàn)在～3 700-3 800 cm-1、～2 996 cm-1、～1 600-1 790 cm-1、1 517 cm-1、～661 cm-1處,分別對應(yīng)O- H 伸縮振動峰、芳環(huán)上C-H 伸縮振動峰、C=O 伸縮振動峰、C=C骨架振動峰、芳環(huán)上C-H面外彎曲振動峰［16-17],這說明MCN-COOH-1中含有苯環(huán)、酚羥基、羰基等基團(tuán)。從圖3A可知,載藥后的MCN-COOH-1@NH2@CTD在3 424.6 cm-1處有N-H伸縮振動峰,1 639 cm-1處有C=O伸縮振動峰,1 225 cm-1處有C-N伸縮振動峰,說明載藥后的MCN-COOH-1@NH2@CTD具有O=C-N。而斑蝥素特征官能團(tuán)為CH3,C-O-C,CO-O-CO［18],在圖3A中,MCN-COOH-1@NH2@CTD在2 990 cm-1處有C-H伸縮振動,在1 897 cm-1和1 683 cm-1處均有C=O伸縮振動,在1 007 cm-1處有C-O-C伸縮振動,具有CTD的特征官能團(tuán)峰。此外,負(fù)載CTD后,最大吸收峰分別轉(zhuǎn)移至～3 438、～1 890、～1 679 cm-1處,MCN-COOH-1@NH2@CTD吸收峰出現(xiàn)微弱的紅移和藍(lán)移［16],上述說明MCN-COOH-1成功與斑蝥素通過酰胺化進(jìn)行共價(jià)鍵偶聯(lián)。如圖3B所示,載藥前的介孔碳MCN-COOH-2主要特征峰出現(xiàn)在～3 855 cm-1、～3 060 cm-1、～1 715 -1 580 cm-1、～1 205 cm-1、～1 092 cm-1、～579.7 cm-1處,分別對應(yīng)O-H 伸縮振動峰、芳環(huán)上C-H 伸縮振動峰、C=O 伸縮振動峰、C=C骨架振動峰,C-O伸縮振動峰,芳環(huán)上C-H面外彎曲振動峰,說明MCN-COOH-2含有苯環(huán)、酚羥基、羰基。載藥后的MCN-COOH-2@NH2@CTD中未出現(xiàn)酰胺的特征峰,無斑蝥素的特征峰或者其他多余的吸收峰,這說明斑蝥素與MCN-COOH-2未發(fā)生偶聯(lián)。

圖3 載藥前后介孔碳的FT-IR圖譜

2.3 介孔碳偶聯(lián)斑蝥素前后微觀形貌 為進(jìn)一步觀察介孔碳載藥前后的情況確證介孔碳與CTD的偶聯(lián)與負(fù)載,本研究采用SEM 對其載藥前后微觀形貌進(jìn)行分析。圖4為介孔碳載藥前后的微觀形貌圖。由圖4A可觀察到,MCN-COOH-1表面光滑,顆粒呈球形,球形顆粒部分可見孔隙,球形顆粒有交聯(lián)團(tuán)聚現(xiàn)象。在圖4B中,載藥后斑蝥素的MCN-COOH-1@NH2@CTD碳球表面黏附有納米顆粒,說明MCN-COOH-1與CTD間也有負(fù)載作用。從圖4C中可看到,MCN-COOH-2形貌較為規(guī)則,表面光滑,基本無粘連情況,有明顯的孔道結(jié)構(gòu)。載上斑蝥素后碳球孔道消失,碳球表面包裹著納米顆粒,說明MCN-COOH-2與CTD有負(fù)載作用(圖4D)。結(jié)合FT-IR結(jié)果分析可知,MCN-COOH-1載藥方式為偶聯(lián)和負(fù)載,MCN-COOH-2為負(fù)載。

A:MCN-COOH-1;B:MCN-COOH-1@NH2@CTD;C:MCN-COOH-2;D:MCN-COOH-2@NH2@CTD。

2.4 空白納米載體的細(xì)胞毒性 HepG2細(xì)胞與10～60 μg/mL MCN-COOH以及MCN-COOH@NH2共孵育24 h后,均表現(xiàn)出較高的細(xì)胞活力(超過90%),這表明MCN和MCN-NH2對HepG2細(xì)胞的毒性很小,材料安全(圖5)。這證實(shí)了MCN-COOH和MCN-COOH@NH2具有良好的生物相容性。這對于后續(xù)斑蝥素靶點(diǎn)“鉤釣”具有重要意義。

圖5 MCN-COOH和MCN-COOH@NH2對HepG2細(xì)胞的毒性

2.5 介孔碳偶聯(lián)斑蝥素對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用 藥物濃度在5 μg/mL時(shí),MCN-COOH-1@NH2@CTD對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于MCN-COOH-2@NH2@CTD,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。

*:MCN-COOH-1@NH2@CTD與MCN-COOH-2@NH2@CTD比較,

3 討論

分子靶點(diǎn)“鉤釣”技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于藥物與固相載體平臺的有效鍵合或偶聯(lián)且不影響該藥物藥效。斑蝥素屬于單萜烯類化合物,無法通過“光偶聯(lián)”“C-C鍵合”等技術(shù)與固相載體材料進(jìn)行鍵合。因此本研究設(shè)計(jì)以活化的氨基功能化介孔碳與斑蝥素通過“酰胺化”進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián),并驗(yàn)證鍵合斑蝥素后對其藥效活性的影響。首先,本研究以低階酚醛樹脂作為碳源,F127為軟模板,借助水熱合成法制備了比表面積適宜、孔徑為2.955 nm的羧基修飾介孔碳。通過FT-IR和SEM分析可知,MCN-COOH-1與斑蝥素的結(jié)合方式為偶聯(lián)和負(fù)載,MCN-COOH-2與斑蝥素的結(jié)合方式為負(fù)載。由此也證明,MCN-COOH-1羧基活化劑EDC存在條件下與NHS發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),同時(shí)與斑蝥素進(jìn)行有效偶聯(lián),而介孔碳的介孔結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)斑蝥素的有效吸附。其次,本研究通過體外斑蝥素活性成分芯片的生物相容性與抑制細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了斑蝥素活性成分芯片具有生物安全性與藥效活性。結(jié)果顯示,10～60 μg/mL MCN-COOH以及MCN-COOH@NH2與HepG2細(xì)胞共孵育24 h后,均表現(xiàn)出較高的細(xì)胞活力(超過90%);藥物濃度在5 μg/mL時(shí),MCN-COOH-1@NH2@CTD對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于MCN-COOH-2@NH2@CTD。因此,所合成的介孔碳材料具有良好的生物安全性,無論與斑蝥素進(jìn)行鍵合或者負(fù)載作用進(jìn)行結(jié)合均對其藥效活性影響不大。

綜上所述,本文合成的介孔碳為后續(xù)斑蝥素分子直接作用靶點(diǎn)群“鉤釣”提供了有效的固相載體平臺。