FHA結構域蛋白TagH對霍亂弧菌腸道定植能力及致病力的影響

賈城壹,范 嬋,盧 琴,王小素,閔 迅,黃 健

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 醫(yī)學檢驗科,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院,貴州 遵義 563099;3.遂寧市中心醫(yī)院 檢驗科,四川 遂寧 629099)

霍亂弧菌是一種生存于水生環(huán)境的革蘭氏陰性菌,根據(jù)表面O抗原結構不同,可分為200多種血清型［1]。其中O1和O139型霍亂弧菌主要導致流行性霍亂,這主要與它們表達霍亂毒素(cholera toxin,CT)和毒素共調節(jié)菌毛(toxin coregulated pilus,TCP)有關［2-3]。由于非O1/非O139群霍亂弧菌缺少CT和TCP毒素［4-5],因此不會引起流行性霍亂,但可引起胃腸炎和腸外侵襲性感染如腦膜炎［6]、菌血癥、皮膚和軟組織感染［7]等。近年來,非O1/非O139群霍亂弧菌引起的腸外侵襲性感染病例呈上升趨勢,且顯著高于O1和O139型霍亂弧菌侵襲性感染的報告病例數(shù)［8]。但目前關于非O1/非O139群霍亂弧菌的致病分子機制知之甚少。

溶血素HlyA(hemolysin A,HlyA)屬于細胞外成孔毒素家族,是霍亂弧菌的一個重要毒力因子,主要由El Tor生物型和非O1/非O139群菌株分泌［9],其具有多種生物活性,包括細胞毒性、腸毒性［10]、心臟毒性、溶血活性［11]和致死性等。本課題組前期研究證實,HlyA是非O1/非O139群霍亂弧菌腸外侵襲致病的決定因子［12]。我們還證實Ⅵ型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion systems,T6SS)中的叉頭相關結構域(forkhead-associated domain,FHA)蛋白TagH通過轉錄因子HlyU和Fur在轉錄水平協(xié)同調控hlyA的表達,并在翻譯后水平通過蛋白酶PrtV調控HlyA的降解［12]。蛋白酶PrtV(vibrio cholerae protease,PrtV)屬于金屬肽酶M6家族成員,可降解哺乳動物血纖維蛋白溶酶原Ⅲ和細胞外基質復合物,也是霍亂弧菌的一個重要毒力因子［13]。本研究比較了tagH基因敲除菌株(ΔtagH菌株)、ΔtagHΔhlyA雙敲菌株、ΔtagHΔprtV雙敲菌株和野生菌株在小鼠腸道定植和致病力上的差異,以探究TagH對細菌毒力的影響,并初步明確溶血素HlyA和蛋白酶PrtV在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 非O1/非O139群霍亂弧菌HN375野生菌株(中國典型培養(yǎng)物保藏中心編號CCTCCAB2010414)為本實驗室保存。ΔtagH敲除菌株、ΔtagHΔhlyA雙敲菌株和ΔtagHΔprtV雙敲菌株為本課題組前期構建［12]。

1.2 實驗動物 3～5天齡CD1乳鼠(性別隨機)和4～6周齡雌性CD1小鼠購自重慶騰鑫生物技術有限公司,均為SPF級,動物實驗操作符合本校倫理委員會要求。

1.3 方法

1.3.1 細菌生長曲線實驗 將野生菌株(wild-type,WT)、ΔtagH菌株、ΔtagHΔhlyA菌株和ΔtagHΔprtV菌株分別接種于哥倫比亞羊血瓊脂平板,于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),次日分別挑取單菌落于生理鹽水中調至0.5麥氏濃度,再以1∶1 000比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、200 rpm恒溫搖床中增菌培養(yǎng),每小時檢測其OD600nm值,同時做3個生物學重復,計算值為平均值。根據(jù)結果比較各菌株的生長速率差異。

1.3.2 乳鼠腸道定植實驗 將CD1乳鼠稱重、編號,共分為5組(PBS陰性對照組、WT菌株組、ΔtagH菌株組、ΔtagHΔhlyA菌株組和ΔtagHΔprtV菌株組),每組24只(8只/籠,共3籠),共計120只。用異氟烷吸入麻醉后,使用灌胃針將50 μL菌量為1×107CFU的各菌懸液按組進行灌胃,陰性對照組直接灌胃50 μL的1×PBS。灌胃完畢后,觀察乳鼠是否有嗆咳、嘔吐等癥狀約10 s,如無異常放回飼養(yǎng)箱。在分別灌胃感染3、6、18 h后,用吸入過量異氟烷方式處死乳鼠,收集整個腸道稱重后進行研磨,將勻漿液稀釋102～104倍后,取50 μL涂布于鏈霉素(100 μg/mL)平板,次日進行菌落計數(shù)比較各菌腸道定植能力。

1.3.3 小鼠灌胃感染實驗 將CD1小鼠稱重、編號,共分為5組(PBS陰性對照組、WT菌株組、ΔtagH菌株組、ΔtagHΔhlyA菌株組和ΔtagHΔprtV菌株組),每組16只(8只/籠,共2籠),共計80只。實驗前4 h禁食禁水,用異氟烷吸入麻醉后,使用灌胃針先將100 μL 8.5%(W/V)NaHCO3溶液注入胃中,再立即將100 μL菌量為1×109CFU的各菌懸液按組進行灌胃,陰性對照組直接灌胃100 μL的1×PBS。灌胃完畢后,觀察乳鼠是否有嗆咳、嘔吐等癥狀約10 s,如無異常放回飼養(yǎng)箱。其中每組8只小鼠在灌胃感染18 h后檢測血液白細胞數(shù)目和回腸病理情況,另外8只小鼠觀察7 d內的生存狀況,統(tǒng)計生存率。

1.3.4 血細胞分析儀檢測外周血白細胞數(shù)目 各菌株行小鼠灌胃感染18 h后,經(jīng)異氟烷麻醉后,采集500 μL血液注入EDTA-K2+抗凝管后顛倒混勻,于希森美康Xs-500i血細胞分析儀上進行白細胞數(shù)測定。

1.3.5 ELISA法檢測血清IL-6、IL-8和TNF-α水平 各菌株行小鼠灌胃感染18 h后,經(jīng)異氟烷麻醉后,采集500 μL血液注入1.5 mL EP管中,37 ℃孵育30 min后于離心機中4 000 rpm離心10 min。取血清進行細胞因子白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的檢測。酶標板上分別設置空白孔、標準孔和樣本孔。空白孔中不加入任何樣本和試劑,各孔設置3個復孔。標準孔中準確加入各試劑盒標準品原液兩倍梯度稀釋后的標準品待測液,各孔設置1個復孔。樣本孔中先加入40 μL樣本稀釋液后,再加入10 μL小鼠血清,各孔設置3個復孔。加樣結束后輕輕晃動混勻,用封板膜將酶標板封板后置于37 ℃溫育30 min,再用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗板5次后拍干。除空白孔外每孔加入酶標試劑50 μL,用封板膜封板后置于37 ℃溫育30 min,再用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗板5次后拍干。每孔依次加入50 μL的顯色劑A和顯色劑B,輕輕晃動混勻,37 ℃避光孵育10 min后,再加入50 μL終止液,10 min內于酶標儀測定各孔OD450nm吸光度值。根據(jù)標準曲線和吸光度值進行各細胞因子濃度換算后比較分析。

1.3.6 回腸段病理組織切片的制備 各菌株行小鼠灌胃感染18h后,將小鼠吸入大量異氟烷麻醉處死,立即取一小塊回腸組織于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定48 h,依次于80%、90%、95%、100%乙醇中梯度脫水后,將組織浸入溶解的石蠟中進行包埋,蠟塊凝固修整后切片,將切片在40 ℃的水上展平后鋪片,置于60 ℃恒溫箱中烤片30 min以融化組織間隙的石蠟。用兩道二甲苯脫蠟后,依次在95%、85%、75%乙醇中浸泡2 min后水洗5 min,用蘇木精染色15 min后,于1%鹽酸酒精作用2 s后水洗1 min,置于5%氨水溶液中浸泡5 s,再置于水中30 min,待切片顏色返藍后用伊紅染液染色30 s,自然風干后用中性樹脂封片,光學顯微鏡下觀察切片,并用Image J軟件分析每組腸絨毛長度。

1.3.7 小鼠生存率的統(tǒng)計 各菌株行小鼠灌胃感染18 h后,將小鼠放回原飼養(yǎng)環(huán)境并提供充足水糧,連續(xù)觀察7 d左右,記錄小鼠死亡數(shù)量和時間,統(tǒng)計小鼠生存率。

2 結果

2.1 細菌生長曲線實驗 為排除不同菌株生長速率差異對小鼠定植能力和致病力的影響,我們進行了生長曲線實驗觀察各菌株生長狀況(圖1)。結果顯示,WT菌株、ΔtagH菌株、ΔtagHΔhlyA菌株和ΔtagHΔprtV菌株在培養(yǎng)后的第3小時進入指數(shù)生長期和第11小時左右進入平臺期,生長曲線幾乎趨于一致,生長速度無明顯差異。

圖1 細菌生長曲線

2.2 乳鼠腸道定植實驗 腸道定植是霍亂弧菌致病過程的一個重要環(huán)節(jié)［14],為探究各菌株在鼠腸道中的感染定植能力,在不同菌株灌胃感染乳鼠后,我們進行了腸道定植菌量計數(shù)分析。結果顯示,在各菌株分別感染3、6、18 h后,隨著感染時間的延長,各菌株腸道定植菌量均逐漸增加(圖2)。與WT菌株相比,ΔtagH菌株的腸道定植菌量在各時間段均明顯增加(P<0.01),ΔtagHΔhlyA菌株在6、18 h時的腸道定植菌量高于ΔtagH菌株(P<0.05),ΔtagHΔprtV菌株在3 h時的腸道定植菌量較ΔtagH菌株降低(P<0.05)。

A:各菌株感染組3 h的定植菌量;B:各菌株感染組6 h的定植菌量;C:各菌株感染組18 h的定植菌量;*、**、***:P <0.05、P <0.01、P <0.001。

2.3 小鼠灌胃感染實驗 為了進一步探究WT菌株、ΔtagH菌株、ΔtagHΔhlyA菌株和ΔtagHΔprtV菌株在小鼠腸道中感染致病能力的差異,我們進行了小鼠灌胃感染實驗。

2.3.1 各組小鼠血液中白細胞水平比較 為探究各菌株感染小鼠所引起的炎癥反應強度差異,在不同菌株灌胃感染小鼠18 h后,我們對小鼠血液中的白細胞進行了計數(shù)。結果顯示,ΔtagH菌株感染組小鼠血液中的白細胞數(shù)較WT菌株感染組明顯增高(P<0.05),ΔtagHΔhlyA菌株感染組的白細胞數(shù)較ΔtagH菌株感染組明顯下降(P<0.05),ΔtagHΔprtV菌株感染組的白細胞數(shù)與ΔtagH菌株感染組相近(P>0.05,圖3)。

*:P <0.05;ns:P>0.05。

2.3.2 各組小鼠血液中細胞因子水平比較 在不同菌株灌胃感染小鼠18 h后,我們對小鼠血液中的IL-6、IL-8和TNF-α的濃度進行檢測。與PBS陰性對照組相比,WT菌株感染組小鼠血清中IL-6水平顯著增加(P<0.05);ΔtagHΔhlyA菌株感染組小鼠血清IL-6水平與WT菌株感染組相比顯著下降(P<0.05);其余各組間無顯著差異(4A)。與PBS陰性對照組和WT菌株感染組相比,ΔtagH菌株感染組小鼠血清中IL-8水平顯著升高(P<0.05);ΔtagHΔprtV菌株感染組小鼠血清IL-8水平與PBS對照組相比也顯著增加(P<0.05),其余各組間無顯著差異(圖4B)。與PBS陰性對照組相比,ΔtagH菌株感染組小鼠血清中TNF-α水平顯著增加(P<0.05),其余各組間無顯著差異(圖4C)。

A:各菌株感染組小鼠血清中IL-6水平;B:各菌株感染組小鼠血清中IL-8水平;C:各菌株感染組小鼠血清中TNF-α水平;*:P <0.05。

2.3.3 各組小鼠回腸組織感染情況比較 為探究各菌株感染小鼠對腸道組織的損傷情況,在感染小鼠18 h后,我們對小鼠回腸段組織進行病理切片觀察。結果顯示,與WT菌株感染組相比,ΔtagH菌株感染組小鼠腸黏膜糜爛更嚴重、絨毛顯著縮短、白細胞數(shù)量更多并且充血更明顯,ΔtagHΔhlyA菌株感染組情況較ΔtagH菌株感染組明顯減弱,ΔtagHΔprtV菌株感染組情況與ΔtagH菌株感染組相似(圖5、6)。

A:PBS陰性對照組;B:WT菌株感染組;C:ΔtagH菌株感染組;D:ΔtagHΔhlyA菌株感染組;E:ΔtagHΔprtV菌株感染組;黑色箭頭指示腸絨毛;紅色箭頭指示中性粒細胞浸潤;×100。

****:P <0.000 1。

2.3.4 各組小鼠生存率比較 我們同時對小鼠的7 d的生存情況進行分析,結果顯示,WT菌株感染組、ΔtagH菌株感染組、ΔtagHΔhlyA菌株感染組、ΔtagHΔprtV菌株感染組的小鼠生存率分別為62.5%、75%、100%和75%(圖7)。

圖7 各菌株感染組小鼠生存率曲線

3 討論

FHA結構域是經(jīng)典的磷酸肽識別結構域［15],可專一性地識別蘇氨酸磷酸化位點,參與了細菌生長代謝過程,如細胞形態(tài)的調節(jié)、III型分泌系統(tǒng)、細菌與宿主相互作用和信號轉導等［16-17]。目前認為FHA結構域與其伴侶蛋白間的相互作用過程受蛋白磷酸化水平可逆調控［18-19],而阻止FHA結構域與磷酸肽分子之間的相互作用有可能成為新型抗菌藥物研發(fā)的重要靶點。有趣的是,許多T6SS基因簇也表達含有FHA結構域的蛋白,通常FHA結構域蛋白與絲氨酸-蘇氨酸激酶和絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶組成蘇氨酸磷酸化系統(tǒng),通過其蘇氨酸磷酸化作用能夠調節(jié)T6SS組裝?；魜y弧菌T6SS中含F(xiàn)HA結構域蛋白的編碼基因為tagH,其定位于T6SS基因簇中。有研究顯示:敲除tagH基因后,T6SS系統(tǒng)的標志性蛋白Hcp不能被分泌,提示tagH基因敲除會顯著抑制T6SS功能［20]。本課題組前期研究顯示,TagH在翻譯后水平通過蛋白酶PrtV負調控溶血素HlyA進而影響非O1/非O139群霍亂弧菌腸外侵襲及致病力［12]。為了引起腹瀉性霍亂,霍亂弧菌必須有效地在小腸內定植。本研究主要探究TagH對非O1/非O139群霍亂弧菌小鼠腸道定植能力和致病力的影響以及這種影響是否依賴于霍亂弧菌溶血素HlyA和蛋白酶PrtV。

本研究首先通過細菌生長曲線實驗驗證各菌株的生長速度一致并無明顯差異,進而排除后續(xù)小鼠定植和致病力是由于細菌自身生長速度差異所導致的。在乳鼠腸道定植實驗中,我們發(fā)現(xiàn),當敲除tagH基因時,相比WT菌株,ΔtagH菌株的定植能力明顯增強,說明tagH基因是影響霍亂弧菌定植能力的重要基因。為了進一步探究溶血素HlyA和蛋白酶PrtV對ΔtagH菌株定植能力增強的貢獻,我們在敲除tagH基因的基礎上進一步敲除hlyA基因和prtV基因。實驗結果顯示,ΔtagHΔhlyA菌株的腸道定植菌量高于ΔtagH菌株,提示溶血素HlyA可能對細菌定植可能有負性影響。Olivier等的研究發(fā)現(xiàn),溶血素不會增強霍亂弧菌初始定植或早期生長［21]。因此,關于HlyA在霍亂弧菌定植過程中的作用還有待進一步探究。此外,ΔtagHΔprtV菌株的定植能力與ΔtagH菌株比較只在3 h時明顯減弱,提示PrtV可能僅在早期定植中有一定的作用。

腸黏膜屏障是胃腸道抵御細菌攻擊最重要的結構,霍亂弧菌分泌的腸道內毒素引起炎癥反應可能是細菌致病的重要機制［22]。本實驗經(jīng)灌胃途徑感染成年小鼠,我們發(fā)現(xiàn)ΔtagH菌株感染組小鼠白細胞數(shù)較野生株顯著增高,提示ΔtagH菌株引起小鼠炎癥反應更重。而ΔtagHΔhlyA菌株感染組小鼠白細胞數(shù)較ΔtagH菌株感染組明顯下降。結果提示HlyA是ΔtagH菌株誘導小鼠炎癥反應加重的主要原因,與歐剛衛(wèi)的研究結果一致［23]。組織病理結果也提示ΔtagH菌株感染組腸組織損傷程度最強,ΔtagHΔhlyA菌株感染組腸組織損傷程度較ΔtagH菌株顯著減弱。此結果也提示HlyA是ΔtagH菌株毒力增強的主要原因,即TagH對細菌毒力的調控依賴于HlyA。此外,本研究發(fā)現(xiàn)ΔtagHΔprtV菌株感染組與ΔtagH菌株感染組小鼠的白細胞計數(shù)相近,組織病理結果顯示兩組小鼠的組織損傷程度相近,提示TagH對細菌毒力的調控基本不受蛋白酶PrtV的影響。

綜上所述,本研究結果提示TagH抑制霍亂弧菌的腸道定植能力和腸道致病力,其調控作用主要依賴于霍亂弧菌溶血素HlyA,而對蛋白酶PrtV的依賴性不高。本研究結果為進一步了解TagH蛋白調控霍亂弧菌毒力的分子機制提供重要的實驗證據(jù)。