耐鹽堿促生菌S4的鑒定及其提高水稻耐鹽堿作用研究

齊玉璽 張琇 楊國平 季鴻飛 沈婷婷 吳凱華

關(guān)鍵詞：人參地微桿菌；菌株鑒定；耐鹽堿；促生作用；水稻

土壤鹽漬化是一個(gè)全球性問題，由于受到人類活動與自然環(huán)境破壞的影響，鹽堿地面積仍有增大趨勢。土壤鹽漬化抑制植物的光合作用、影響相關(guān)酶活性及代謝途徑使作物減產(chǎn)。雖然現(xiàn)有鹽堿地改良措施如水利、物理、化學(xué)等方法發(fā)揮了較好的作用，但因改良成本高、易反復(fù)等問題使得鹽堿地利用率不高。許多研究表明，植物根際促生菌（plant growth promoting thizobacte-ria， PGPR）可依靠解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA等促生功能，提高植物在逆境脅迫下的生存能力；PGPR還可通過提高清除活性氧（ROS）相關(guān)酶活性，減少有害物質(zhì)積累，促進(jìn)植物在逆境條件下的生長。PGPR已成為用于改良鹽堿地方法的研究熱點(diǎn)之一，因此探索微生物提高作物抗鹽堿能力，對于促進(jìn)鹽堿地的開發(fā)利用具有重要意義。

水稻（Oryza sativa L．）作為世界一半人口的主食，同時(shí)也是重要的工業(yè)原料，稻殼、稻稈等部分還可作為飼料。隨著土壤鹽漬化愈加嚴(yán)重，土地資源緊缺，越來越多的水稻開始種植于鹽堿地，但是產(chǎn)量和品質(zhì)明顯降低。王華笑等研究發(fā)現(xiàn)接種解淀粉芽孢桿菌YM6菌株（Bacillus arnyloliquefaciens YM6）可以提高鹽脅迫下玉米抗氧化酶活性及脯氨酸（Pro）含量，降低氧化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)：李麗艷等研究發(fā)現(xiàn)彎曲芽孢桿菌（BacilLus flexus）可以提高鹽脅迫下燕麥抗氧化酶活性及Pro含量，降低氧化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。目前關(guān)于促生菌促進(jìn)鹽堿條件下水稻生長的報(bào)道相對較少。

本研究以課題組前期篩選得到的能促進(jìn)鹽堿脅迫下水稻生長的S4菌為研究對象，對菌株進(jìn)行鑒定，探究S4菌對鹽堿脅迫下水稻生理指標(biāo)及根和葉的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）等抗逆相關(guān)酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，以期為促生菌促進(jìn)鹽堿地水稻生長的機(jī)理提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1生物材料

試驗(yàn)于2022年2-6月于北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。S4菌保藏在寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。水稻品種為寧粳51號。

1.1.2培養(yǎng)基及植物營養(yǎng)液TSA培養(yǎng)基、無機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷培養(yǎng)基、CAS培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、硅酸鹽培養(yǎng)基、Ashby培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

淀粉水解培養(yǎng)基：可溶性淀粉2g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L和瓊脂16g/L。

甲基紅培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L和氯化鈉5g/L。

水瓊脂培養(yǎng)基：8g/L瓊脂。

1.1.3植物營養(yǎng)液配置

母液A：六水合氯化鈷0.004g、硼酸2.86g、四水合氯化錳1.81g、七水合硫酸鋅0.22g、五水合硫酸銅0.102g、二水合鉬酸納0.122g溶于1L蒸餾水；母液B：七水合硫酸鎂49.296g溶于IL蒸餾水；母液C：磷酸氫二鉀174.18g、磷酸二氫鉀136.886g溶于1L蒸餾水；母液D：二水合氯化鈣110.99g溶于1L蒸餾水；母液E：三水合檸檬酸鐵5g溶于1L蒸餾水。1L蒸餾水中加入上述5種母液各1mL、硫酸銨0.66g，可得常規(guī)植物營養(yǎng)液。鹽堿脅迫植物營養(yǎng)液在常規(guī)植物營養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入氯化鈉11.7g，并用16g/L碳酸鈉溶液調(diào)至pH=8.5。

1.1.4試驗(yàn)儀器LHS-130L-3三溫區(qū)恒溫恒濕箱；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)；UV-1000天美紫外可見分光光度計(jì)；JLRX-800B-FB植物培養(yǎng)箱。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1S4菌分離純化與形態(tài)特征觀察將用25%甘油保存在超低溫冰箱的S4菌接種于TSA培養(yǎng)基，28℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)2d，觀察菌落形狀、顏色、大小、質(zhì)地、邊緣結(jié)構(gòu)、隆起程度等特性。對S4菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡油鏡下（放大倍數(shù)10x100）對S4菌顏色及形狀、大小進(jìn)行觀察。

1.2.2S4菌生理生化與促生性能測定共9項(xiàng)：

（1）生理生化指標(biāo)測定：用青島海博生物技術(shù)有限公司的細(xì)菌微量鑒定管進(jìn)行相關(guān)鑒定。

（2）解鉀能力測定：將S4菌接種于硅酸鹽培養(yǎng)基中，28℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)12～36h，觀察菌落形狀，呈現(xiàn)油滴狀則具有解鉀能力，否則不具備解鉀能力。

（3）解有機(jī)磷能力測定：將S4菌接種到有機(jī)磷培養(yǎng)基中．37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)2d，觀察有機(jī)磷培養(yǎng)基變化。如菌落周圍變?yōu)橥该?，則說明有解有機(jī)磷能力，否則無此能力。

（4）解無機(jī)磷能力測定：將S4菌接種到無機(jī)磷培養(yǎng)基中，37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)2d，觀察培養(yǎng)基變化。菌落周圍變透明，說明有溶無機(jī)磷能力，否則無溶無機(jī)磷能力。

（5）解淀粉能力測定：將S4菌接種到淀粉水解培養(yǎng)基上，38℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)1d。在S4菌附近加入碘液，觀察菌落附近是否變透明，透明則說明S4菌有解淀粉能力，否則無此能力。

（6）甲基紅試驗(yàn)：將S4菌接種到甲基紅培養(yǎng)基中，36℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，添加甲基紅試劑。培養(yǎng)基變紅為陽性，變黃為陰性。

（7）分泌IAA能力測定：將S4菌接種到R，A培養(yǎng)基（添加L-色氨酸）中，280C、150 r/min振蕩培養(yǎng)48h。吸取100L菌液到白瓷板，以100LIAA標(biāo)準(zhǔn)液（50mg/L）作空白對照，加入等量Salkowski比色液，隨后將白瓷板放人25℃無光培養(yǎng)箱30min，取出后對顏色進(jìn)行判別，如果為紅色說明S4菌可以產(chǎn)IAA，否則無此能力。

（8）分泌鐵載體能力測定：將S4菌接種于CAS培養(yǎng)基中，37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)72h后觀察培養(yǎng)基變化。如果S4菌附近為黃色，說明可以分泌鐵載體，否則無此能力。

（9）固氮能力測定：將S4菌接種于Ashby培養(yǎng)基中，37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)72h后觀察是否出現(xiàn)菌落，有菌落出現(xiàn)則具有固氮能力，否則無此能力。

1.2.3S4菌16S rRNA測序S4菌16SrRNA序列測定由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成，將測序序列通過NCBI網(wǎng)站完成BLAST分析，并利用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4S4菌抗鹽堿能力測定將S4菌分別接種于不同NaCl濃度梯度（0、1%、2%、3%、4%．5%、6%、7%、8%）的TSA培養(yǎng)基中與用HCI、NaOH調(diào)節(jié)為不同pH梯度（4、5、6、7、8、9、10、11）的TSA培養(yǎng)基中．37℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)48h后觀察S4菌生長狀況，測定其耐鹽與耐堿能力。

1.2.5水稻水培試驗(yàn)及其抗逆指標(biāo)測定試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理?？瞻讓φ战M（CKO）：無S4菌浸種，常規(guī)植物營養(yǎng)液；鹽堿對照組（CK1）：無S4菌浸種，鹽堿脅迫植物營養(yǎng)液；CKO+S4菌組：S4菌浸種，常規(guī)植物營養(yǎng)液；CKl+S4菌組：S4菌浸種，鹽堿脅迫植物營養(yǎng)液（S4菌浸種方法為lx108cfu/mL菌懸液浸種）。將水稻種子在55℃水浴鍋中浸種15min，用酒精去除表面張力10s，0.1%升汞表面消毒30s，無菌水清洗6次，消毒完成后對種子進(jìn)行不同處理。將不同處理種子擺放于水瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行暗處理，待其發(fā)芽后移到滅菌的480mL塑料瓶（塑料瓶中有300g石子、60mL不同處理的植物營養(yǎng)液）中，放人植物光照培養(yǎng)箱（濕度35%，設(shè)置6個(gè)時(shí)段，即時(shí)段1：時(shí)間4h、溫度25℃、光照10000lx;時(shí)段2：時(shí)間3h、溫度20℃、光照5000lx;時(shí)段3：時(shí)間8h、溫度18℃．光照01x;時(shí)段4：時(shí)間2h、溫度20℃、光照50001x;時(shí)段5：時(shí)間3h、溫度25℃、光照9000lx;時(shí)段6：時(shí)間4h、溫度28℃、光照13000lx）培養(yǎng)14d后用尺子測量不同處理下水稻根長、株高。將樣品液氮保存后存放于-80℃超低溫冰箱，根和葉的抗逆指標(biāo)使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2019和SPSS 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性差異分析，使用GraphPadPrism 8做圖。

2結(jié)果與分析

2.1S4菌菌落形態(tài)特征

S4菌在TSA培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色，切面隆起，表面光滑，邊緣完整或波紋狀，不透明，粘稠度較高，易挑起（圖1A）。顯微鏡油鏡下（放大倍數(shù)10x100）觀測到染色結(jié)果為紫色，形狀為桿狀，判定為桿狀的革蘭氏陽性菌（圖IB）。

2.2S4菌生理生化特性與促生能力

S4菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、棉子糖、半乳糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇半固體、水楊苷在糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)中測定結(jié)果為陽性（顏色變?yōu)辄S色）；蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、D-纖維二糖測定結(jié)果為陰性（顏色未變?yōu)辄S色）。硫化氫生化管無黑色生成，ONPG為無色，VP試驗(yàn)為黃色，鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶測定結(jié)果為陰性（黃色），色氨酸也為陰性（無色）。

促生能力測定結(jié)果表明，淀粉水解能力的測定結(jié)果呈陰性，培養(yǎng)基未變透明：解鉀能力測定結(jié)果呈陽性：S4菌產(chǎn)IAA，加入比色液避光處理后呈現(xiàn)紅色；有機(jī)磷、無機(jī)磷培養(yǎng)基上S4菌周圍出現(xiàn)透明，呈陽性：CAS培養(yǎng)基上，S4菌周圍有黃褐色產(chǎn)生，呈陽性，有產(chǎn)鐵載體能力；Ashby培養(yǎng)基上無菌落出現(xiàn)，不具有固氮能力：甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為亮黃色，呈陰性。綜上，S4菌具備解磷、解鉀、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體能力，屬于典型的PGPR，有助于植物生長，改變周圍土壤環(huán)境。

2.3S4菌的分子生物學(xué)鑒定

將序列信息輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，選取6株與S4菌相似程度超過98%的模式菌株，用MEGA 6完成S4菌的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。由圖2可知，S4菌與人參地微桿菌（Microbacteri-um gznsengiterrae）聚為一支，結(jié)合形態(tài)特征，確定S4菌為M. ginsengiterrae。

2.4S4菌抗鹽堿能力

S4菌在0～7% NaCl濃度的TSA平板上可以生長，NaCl濃度超過50%時(shí)長勢減弱，濃度為7%時(shí)菌落生長狀況較差，需借助光源觀察菌落，濃度超過7%時(shí)不能生長（圖3）；S4菌在pH為4—10的平板上可以生長，但在pH=10的平板上長勢較弱，pH=11時(shí)S4菌不能生長（圖4）。

2.5S4茵對水稻耐鹽堿的促生作用

14 d時(shí)水稻生長情況見圖5。與CKO相比，CKO+S4組根長提高1.1%，無顯著性差異（P>0.05）；CKI+S4組根長較CKI顯著提高163.0%（P<0.05），說明在鹽堿脅迫下S4菌浸種對根長有顯著促進(jìn)作用。與CKO相比，CKO+S4組株高提高10.8%，無顯著性差異（P>0.05）；CK1+S4組株高較CK1顯著提高66.1%（ P<0.05），說明在鹽堿脅迫下S4菌浸種對水稻株高有顯著促進(jìn)作用。

SOD、POD、CAT都是重要的抗氧化酶，可以使H202分解，降低ROS對植物的毒害作用。由圖6可知，與CKO相比，CK1、CK1+S4水稻地上部分與地下部分的抗氧化酶活性均顯著升高（P<0.05）；CKO+S4相較于CKO的水稻抗氧化酶活性除SOD在地下部分有顯著提升外（P<0.05），其余抗氧化酶活性無論是地上部分還是地下部分均無顯著變化（P>0.05）；與CK1相比，CK1+S4地下部分的SOD、CAT、POD分別顯著提高23.1%、16.9%、15.6%，地上部分分別顯著提高36.7%、8.1%、13.6%。

通過脯氨酸（Pro）含量可以判斷鹽堿脅迫對水稻的傷害程度以及對鹽堿脅迫的抵抗能力，可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）均起著穩(wěn)定植物細(xì)胞滲透壓的作用，反映植物受到鹽堿脅迫的程度。本試驗(yàn)SP含量以Cpr（樣本蛋白濃度）表現(xiàn)，S4菌對水稻Pro、SS、SP的影響結(jié)果如圖7所示。與CKO相比，CK1地下、地上部分Pro、SS、SP含量均顯著提高（P<0.05）；CKO+S4相較于CKO，水稻地上部分Pro含量顯著升高（P<0.05），地下部分SS含量顯著下降（P<0.05），其余含量均無明顯變化（P>0.05）；CK1+S4相較于CK1，水稻地下、地上部分Pro含量顯著升高33.3%、36.5%，地下部分SS、SP含量顯著降低55.9%、19.2%，地上部分SS、SP含量顯著降低22.9%、18.5%。

MDA作為最終過氧化產(chǎn)物之一，它的積累會導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、植物衰老，是反映植物抗逆能力的重要指標(biāo)。CK1相較于CKO，地下、地上部分的MDA含量顯著增加（P<0.05）；CKO與CKO+S4的MDA含量無顯著差異（P>0.05）；CK1+S4相較于CK1，水稻地下、地上部分MDA含量顯著降低55.5%、46.2%（P<0.05）.

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)將水稻耐鹽堿促生菌S4鑒定為人參地微桿菌，并對S4菌生理生化特性、促生能力及在鹽堿下的水稻生長狀況進(jìn)行測定。結(jié)果表明，S4菌擁有解有機(jī)磷、解無機(jī)磷、解鉀、分泌鐵載體和IAA的促生性能，并可在重度鹽堿環(huán)境下生長，是擁有多種促生功能的耐鹽堿PGPR菌株。大部分促生菌促生功能較為單一并且在鹽堿條件下停止生長，目前對人參地微桿菌可以同時(shí)提高植物耐鹽與耐堿能力菌株的研究鮮有報(bào)道，大部分菌株只具有提高植物耐鹽能力。

鹽堿脅迫造成植物體內(nèi)活性氧過量與MDA積累，為了減少這些傷害，植物會產(chǎn)生SOD、CAT、POD等抗氧化酶來清除過量的活性氧，積累SS、SP和Pro等有關(guān)調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)維持細(xì)胞水勢正常。大量研究發(fā)現(xiàn)，接種PGPR可以減少鹽脅迫對植物的危害，促進(jìn)植物生長發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽堿脅迫下接種S4菌的水稻相較于未接菌的水稻，地上、地下部分的SOD、POD、CAT活性及Pro含量顯著提高，MDA含量顯著降低，可溶性糖和可溶性蛋白含量與無鹽堿脅迫時(shí)的水平相近，說明S4菌浸種后提高了植株的抗鹽堿能力，降低了鹽堿脅迫對水稻產(chǎn)生的危害。這與劉鵬等的研究結(jié)果（NaCl脅迫下添加耐鹽菌株可提高水稻幼苗根長、株高以及SOD、POD、CAT活性，降低MDA含量）和袁東關(guān)于植物促生菌對鹽脅迫下水稻生長影響的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，人參地微桿菌S4是可以在重度鹽堿環(huán)境下（NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、pH=10）生長繁殖，是具有解有機(jī)磷、解無機(jī)磷、解鉀、分泌鐵載體、產(chǎn)IAA的PGPR。S4菌可以促進(jìn)鹽堿脅迫下水稻的生長，提高水稻根長、株高以及地上部分和地下部分的抗氧化酶活性以及Pro含量，降低MDA含量，減少鹽堿脅迫下對水稻帶來的危害，使SS、SP含量向無鹽堿脅迫時(shí)的水平趨近，提高水稻耐鹽堿能力。本研究初步揭示了S4菌株促生機(jī)理，可為采用微生物方法提高鹽堿地作物產(chǎn)量提供理論依據(jù)。