胃癌患者外周血INPP4B表達水平與臨床病理特征、化療敏感性及PI3K/AKT通路的關(guān)系

劉 征,宮向良,于大中,趙艷云,徐愛芳,宋 楊

(1.唐山市人民醫(yī)院 檢驗科,河北 唐山063000;2.唐山市第三醫(yī)院 腫瘤科,河北 唐山063100)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤。隨著生活壓力的增加與飲食結(jié)構(gòu)的改變,胃癌的發(fā)生逐漸趨于年輕化,與遺傳因素、高鈉飲食和幽門螺旋桿菌感染等有密切關(guān)系[1-3]。胃癌早期并無明顯臨床癥狀,難以引起重視,因此多數(shù)患者確診時,病情已經(jīng)發(fā)展到中、晚期,錯過了最佳治療時期。化療是目前臨床治療胃癌的重要手段,雖然可以延長患者生存期,但預(yù)后不佳[4]。含奧沙利鉑的化療方案在治療胃癌晚期中的療效已經(jīng)得到公認[5],奧沙利鉑是第三代鉑類藥物,可以通過破壞腫瘤細胞中脫氧核苷酸的方式抑制其生長[6]。但長期化療仍會引起腫瘤細胞耐藥,降低治療效果[7]。因此尋找影響奧沙利鉑化療的分子機制,對針對性靶向治療胃癌具有重要意義。

磷脂酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路是腫瘤細胞中最常見的信號通路之一,它參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、生長、存活、遷移和代謝,在胃癌等多種腫瘤細胞中呈現(xiàn)異常高表達,是細胞耐藥相關(guān)的關(guān)鍵通路[8]。Ⅱ型多磷酸肌醇4-磷酸酶(INPP4B)是一種腫瘤抑制因子,可以抑制PI3K表達,阻斷PI3K/AKT傳導(dǎo)[9]。有研究表明[10],INPP4B在乳腺葉狀腫瘤組織中的表達高于正常組織。另有研究指出[11],下調(diào)INPP4B可以阻斷PI3K/AKT傳導(dǎo),抑制前列腺癌的細胞增殖與遷移。INPP4B在多種腫瘤細胞均出現(xiàn)異常表達,且可能靶向調(diào)控PI3K/AKT信號通路基因表達。由此可以推測,INPP4B及其調(diào)控的PI3K/AKT信號通路可能通過影響癌細胞惡性行為學(xué)從而參與胃癌化療過程。為探討INPP4B和PI3K/AKT通路在晚期胃癌患者的臨床病理特征和化療敏感性的關(guān)系,本研究選取79例晚期胃癌患者為研究對象,為臨床晚期胃癌開展針對性靶點治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采取率樣本量計算公式估算總體樣本量,校驗水準α=0.05,把握度1-β=0.9,以胃癌化療敏感率為指標,查閱文獻胃癌化療敏感率取P1=0.4,計算得到樣本量為67例,考慮15%的失訪率,最終取樣本量79例。N=2(Zα/2+Zβ)2(P0q0+p1q1)/(P0-P1)2。選取2018年12月至2019年12月醫(yī)院收治的79例晚期胃癌患者作為研究組,其中男性39例,女性40例;年齡31～69歲,平均年齡(50.74±7.61)歲;TNM分期ⅢB期48例,Ⅳ期31例。納入標準:①符合《AJCC胃癌TNM分期系統(tǒng)(第8版)》[12]中胃癌晚期診斷標準者;②經(jīng)病理學(xué)檢驗確診為胃癌晚期者;③臨床分期為TNM分期ⅢB或Ⅳ期[12];④影像學(xué)檢查有可測量病灶;⑤不可手術(shù)切除者或接受手術(shù)治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者;⑥Karnofsky(KPS)評分[13]≥70分者;⑦預(yù)計生存期≥3個月;⑧年齡18～80歲;⑨知情且同意參與研究。排除標準:①化療禁忌癥者;②伴胸腹水、彌漫性肝浸潤等無法進行影像學(xué)測量病灶者;③合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤者;④合并嚴重心腦血管疾病者;⑤合并完全性腸梗阻者;⑥嚴重過敏體質(zhì)者;⑦依從性差者;⑦合并精神病或無法交流者;⑧正在參與其他臨床研究者。另外選取與研究組性別、年齡匹配的健康體檢者40例作為對照組,其中男22例,女18例;年齡28～65歲,平均年齡(48.78±6.05)歲。經(jīng)檢驗研究組與對照組人員的年齡與性別具有可比性(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 研究方法

1.2.1治療方案

第1天:靜脈注射奧沙利鉑(注射用奧沙利鉑,50 mg/瓶,國藥準字H20093167,齊魯制藥有限公司)130 mg/m2;第1～14天:口服卡培他濱(希羅達,0.5 g×12片,國藥準字H20073024,上海羅氏制藥有限公司)2 000 mg/(m2·d),2次/d。每3周為1個治療周期,根據(jù)患者情況治療至病情進展或不能耐受化療副作用。

1.2.2化療敏感性評價

化療2個周期后根據(jù)《實體瘤的療效評價標準1.1(RECIST 1.1)》[14]對近期療效進行評估,根據(jù)療效情況分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)與疾病進展(PD);其中CR即表示目標病灶完全消失,PR即表示所有可測量目標病灶長徑總和縮小≥30%,PD即表示所有可測量目標病灶長徑總和增加≥20%,SD即表示可測量病灶長徑總和改變處于PR和PD之間;將評價為CR與PR的患者記為敏感組,評價為SD與PD的患者記為抵抗組。

1.2.3外周血INPP4B與PI3K/AKT信號通路mRNA表達檢測

化療前,采用真空采血管(含抗凝劑)采取對照組與研究組人員清晨空腹外周靜脈血5 mL,保存于-80℃超低溫冰箱中備用。采用Trizol法(產(chǎn)品貨號:RP2401,深圳輝諾生物科技有限公司)提取全血中總RNA,采用Qubit檢測RNA濃度,取適量RNA進行逆轉(zhuǎn)錄(產(chǎn)品貨號:11142ES10,上海翌圣生物科技有限公司)生成cDNA,以生成的cDNA為模板鏈,加入表1中引物進行實時熒光定量PCR(產(chǎn)品貨號:Q105,南京巨匠生物科技有限公司),反應(yīng)條件如下:(1)預(yù)變性:95℃(5 min)×1個循環(huán)數(shù);(2)循環(huán)反應(yīng):[95℃(5 s)+60℃(20 s)]×45個循環(huán)數(shù)。以β-actin為內(nèi)參基因,根據(jù)2-△△CT計算INPP4B、PI3K和AKT的相對表達量,每個樣品重復(fù)檢測3次。引物序列見表1。

表1 INPP4B、PI3K、AKT與β-actin的上下游引物序列

1.2.4患者臨床病理特征與隨訪

統(tǒng)計所有研究組患者的臨床資料,包括性別、年齡、TNM分期、腫瘤位置、病理類型、病灶個數(shù)和分化程度等。采用電話或復(fù)診方法進行隨訪,隨訪2年,以患者全因死亡或隨訪時間截止為終點事件。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究組與對照組外周血INPP4B表達水平比較

研究組外周血中INPP4B mRNA的相對表達量低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 研究組與對照組外周血INPP4B表達水平比較

2.2 外周血INPP4B與晚期胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)研究組中INPP4B mRNA表達水平的中位數(shù)進行分組,≥0.25的為高表達組,共40例;<0.25的為低表達組,共39例。

不同性別、年齡、腫瘤位置、病理類型、病灶個數(shù)和分化程度的胃癌患者外周血INPP4B mRNA高表達和低表達的占比經(jīng)比較,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Ⅳ期胃癌患者外周血INPP4B mRNA低表達占比高于ⅢB期患者,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 外周血INPP4B與晚期胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 敏感組和抵抗組外周血INPP4B、PI3K與AKT mRNA表達水平

79例患者均完成2個及以上化療周期,其中CR 1例,PR 30例、SD 33例、PD 15例,敏感組共31例,占39.24%;抵抗組共48例,占60.76%。抵抗組的INPP4B mRNA表達水平低于敏感組,抵抗組PI3K和AKT mRNA表達水平高于敏感組(P<0.05)。見表4。

表4 敏感組和抵抗組外周血INPP4B、PI3K與AKT mRNA表達水平比較

2.4 外周血INPP4B水平與PI3K/AKT信號通路的相關(guān)性分析

化療前,研究組胃癌患者外周血INPP4B mRNA表達水平與PI3K和AKT mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.551、-0.312,P<0.05)。見圖1。

圖1 外周血INPP4B水平與PI3K/AKT信號通路的相關(guān)性分析

2.5 INPP4B的表達與生存期分析

隨訪24個月,其中高表達組2例失訪,低表達組1例失訪,隨訪率96.20%。高表達組與低表達組的中位生存時間為12.00個月(95%CI:10.515～13.954)和11.00個月(95%CI:10.046～12.794),2組累積生存曲線差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Logrankχ2=7.669,P=0.006)。見圖2。

圖2 外周血INPP4B水平對晚期胃癌總體生存曲線的影響

3 討論

含奧沙利鉑的化療治療方案在臨床上具有廣泛應(yīng)用。奧沙利鉑進入機體后可以迅速與腫瘤細胞中的DNA形成鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián),抑制DNA復(fù)制與合成,從而達到抗腫瘤的作用[15]。但隨著治療的推進,胃癌細胞對奧沙利鉑的耐藥逐漸顯現(xiàn),治療效果降低。因此尋找胃癌細胞藥物敏感的分子生物學(xué)靶點具有重要的臨床意義。INPP4B可促進PI(3,4)P2的D4磷酸基團發(fā)生去磷酸化生成為3磷酸磷脂肌醇[PI(30)P],阻斷PI3K/AKT通路傳導(dǎo),抑制腫瘤細胞增殖,且有研究顯示,INPP4B在部分腫瘤細胞中呈低表達[16]。因此本文對INPP4B和PI3K/AKT通路在晚期胃癌患者的臨床病理特征和化療敏感性的關(guān)系進行探究,以期為臨床晚期胃癌開展針對性靶點治療提供參考依據(jù)。

INPP4B位于染色體4q31.21上,編碼蛋白分子量約為110 kDa,其表達水平與前列腺癌、乳腺葉狀癌等眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[10-11]。本研究結(jié)果顯示,研究組外周血中INPP4B mRNA的相對表達量低于對照組,Ⅳ期胃癌患者外周血INPP4B mRNA低表達占比高于ⅢB期患者,提示外周血INPP4B mRNA的相對表達量在胃癌晚期患者中呈低表達,且表達水平與胃癌晚期TNM分期有關(guān)。Wang等研究顯示[17],INPP4B在多發(fā)性骨髓瘤細胞中表達低于正常漿細胞。苗玉等研究顯示[18],INPP4B在正常乳腺組織中表達高于乳腺癌組織,且其表達水平與隨著TNM分期升高而降低。以上研究和本研究結(jié)果共同說明,INPP4B在腫瘤患者中的低表達狀態(tài)與腫瘤病理特征有關(guān),并且可能參與病情進展。

AKT是一種蛋白激酶,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。PI3K/AKT通路是調(diào)控細胞增殖、凋亡、自噬等生物學(xué)過程的關(guān)鍵通路,目前已成為化療敏感性機制研究的熱點。高度激活的AKT會形成pAKT,調(diào)節(jié)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9等靶蛋白,起到抗細胞凋亡的作用,降低腫瘤細胞的化療敏感性,促使患者對化療耐受。本研究結(jié)果顯示,抵抗組的INPP4B mRNA表達水平低于敏感組,抵抗組PI3K和AKT mRNA表達水平高于敏感組,化療前研究組胃癌患者外周血INPP4B mRNA表達水平與PI3K和AKT mRNA表達水平呈負相關(guān),提示胃癌晚期患者外周血INPP4B表達水平與化療敏感性有關(guān),且INPP4B可能通過負調(diào)控PI3K/AKT通路實現(xiàn)改變癌細胞對化療藥物的敏感性。張玉清等研究顯示[19],下調(diào)PI3K/AKT通路的表達可以降低宮頸癌細胞對化療藥物的耐藥性。說明PI3K/AKT通路是參與調(diào)控癌細胞化療藥物敏感性的關(guān)鍵通路。細胞實驗顯示[20],在人急性髓細胞白血病THP-I細胞系中過表達INPP4B可以抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,降低細胞凋亡率。臨床研究顯示[16],INPP4B在肝癌組織中表達低于正常組織,且INPP4B高表達可以抑制肝癌細胞凋亡,增加其化療敏感性。以上研究表明,INPP4B可能是胃癌細胞化療敏感性的重要靶基因。此外,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),高表達組與低表達組的中位生存時間為12.00個月和11.00個月,2組中位累積生存曲線經(jīng)比較具有統(tǒng)計學(xué)意義,提示INPP4B表達水平對晚期胃癌患者生存預(yù)后產(chǎn)生影響。以上研究和本研究共同說明,高表達INPP4B可能會抑制下游PI3K/AKT通路,起到促進腫瘤細胞凋亡的作用,使化療敏感性增加,有利于延長患者生存期。

綜上,外周血INPP4B與胃癌晚期TNM分期、化療敏感程度及預(yù)后生存有關(guān),且INPP4B調(diào)控化療敏感性的機制可能與負調(diào)控PI3K/AKT通路有關(guān),為臨床晚期胃癌開展針對性靶點治療提供參考依據(jù)。但INPP4B在胃癌細胞中的分子生物學(xué)機制仍需開展細胞學(xué)及動物學(xué)研究進行深入探討。