干腌牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化

伏慧慧，潘麗，王慶玲

石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子 832000）

基于新疆得天獨(dú)厚的資源優(yōu)勢(shì)，通過(guò)干腌肉制品加工技術(shù)，鮮牛脊肉經(jīng)腌制、風(fēng)干、發(fā)酵和成熟工藝制得極具新疆地域特色的干腌牛肉，其有獨(dú)特的口感、豐富的營(yíng)養(yǎng)特性且便于貯藏[1]。然而干腌牛肉并未形成工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，流通量較少，因而鮮有人知。

干腌肉制品中蛋白質(zhì)的組成、含量、生化特性的變化及穩(wěn)定性均關(guān)系到產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、色澤等多方面的品質(zhì)特性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化是多種生化修飾的結(jié)果，可引起蛋白質(zhì)溶解性、疏水性的變化，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生不同程度影響[2]。蛋白質(zhì)分子中氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用的變化是因腌制環(huán)境的改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間構(gòu)象改變，最終影響產(chǎn)品的功能特性。腌臘加工過(guò)程中因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變及水解、氧化使肉制品產(chǎn)生風(fēng)味前體物質(zhì)[3]。

試驗(yàn)以干腌牛肉加工過(guò)程中工藝點(diǎn)為研究對(duì)象，主要研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、濁度、溶解度、表面疏水性及蛋白質(zhì)分子相互作用力變化，從而明確蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對(duì)干腌牛肉品質(zhì)的影響，為進(jìn)一步研究干腌牛肉產(chǎn)品品質(zhì)提供理論參考，為新疆牛肉加工制品工業(yè)化提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮褐牛脊肉（購(gòu)自烏魯木齊市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、三氯乙酸、氫氧化鈉、溴酚藍(lán)等（均為分析純，購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)（力康發(fā)展有限公司）；X7酶標(biāo)儀（基因有限公司）；IKA-T25高速分散器（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡（SEM，日本電子公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

工藝流程：鮮牛脊肉→腌制→風(fēng)干→發(fā)酵→成熟→成品。

工藝條件：將鮮牛脊肉冷藏48 h（4 ℃），按樣品總量6.0%稱取食鹽并均勻揉搓在樣品表面，在8 ℃，Hr65%腌制35 d；牛脊肉洗后于10 ℃，Hr60%風(fēng)干15 d；發(fā)酵80 d（20 ℃，Hr70%，40 d；24 ℃，Hr75%，40 d），于27 ℃、Hr70%成熟50 d即得成品。

分別采集原料（0 d）、腌制期（35 d）、風(fēng)干期（50 d）、發(fā)酵期（130 d）、成熟期（180 d）5個(gè)階段牛脊肉樣品，置于-80 ℃冷藏備用。

1.3.2 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的提取

提取干腌牛肉中蛋白質(zhì)參考冉麗丹等[4]的方法，并進(jìn)行微調(diào)。肉樣破碎處理，稱取5.00 g樣品放入離心管，勻漿混勻前加入10 mL磷酸鹽緩沖液，并在4 ℃，以5 000 r/min離心15 min后，取清液，重復(fù)操作2次，即得肌漿蛋白溶液（SP）。向剩余沉淀中加入10 mL磷酸鹽緩沖液，勻漿混勻、離心15 min（4 ℃，5 000 r/min），獲得清液，此重復(fù)操作2次，即得肌原纖維蛋白溶液（MP），蛋白濃度通過(guò)雙縮脲法測(cè)定。

1.3.3 干腌牛肉加工過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的觀察

將各工藝的蛋白溶液進(jìn)行真空冷凍干燥，肉樣破碎處理，稱取5.00 g置于離心管中。采用SEM分析形態(tài)，在激發(fā)電壓下（10 kV）獲得圖片。

1.3.4 干腌牛肉加工過(guò)程中表面疏水性的測(cè)定

表面疏水性（HFS）的測(cè)定參考劉娟[5]的方法。取1 mL樣品蛋白稀釋液，加入200 μL溴酚藍(lán)，混勻后于搖床振蕩5 min（200 r/min，25 ℃），離心（5 000 r/min，15 min），取上清液，測(cè)定吸光度（595 nm），用A表示。同時(shí)做空白對(duì)照（磷酸鹽緩沖液），用A0表示。HFS（μg）按式（1）計(jì)算。

1.3.5 干腌牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)分子相互作用力的測(cè)定

將不同加工時(shí)期干腌牛肉樣品用組織搗碎機(jī)破碎，準(zhǔn)確稱取3.00 g，分別向肉樣中加入20 mL如下試劑：S1，0.6 mol/L的KCl溶液；S2，20 mmol/L的Tris溶液，pH 8.0；S3，20 mmol/L Tris包含1% SDS，pH 8.0；S4，20 mmol/L Tris包含8 mol/L尿素、1% SDS，pH 8.0；S5，20 mmol/L Tris包含8 mol/L尿素、1% SDS、2%β-巰基乙醇、pH 8.0；S6，0.5 mol/L NaOH溶液。

在25 ℃以150 r/min搖床振搖2.5 h，其中振搖S5樣品前，需在100 ℃水浴4 min。所有樣品溶液振搖后離心（5 000 r/min，20 min），取5 mL上清液，加入20%三氯乙酸并使三氯乙酸終濃度為10%，樣品在4 ℃避光靜置18 h，將樣品離心（5 000 r/min，20 min），經(jīng)0.5 mol/L NaOH溶解沉淀，通過(guò)雙縮脲法對(duì)其蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量，結(jié)果以每一個(gè)樣品中蛋白含量所占S6的百分比表示[6]。

1.3.6 干腌牛肉加工過(guò)程中溶解度的測(cè)定

參考Xiong等[7]的方法對(duì)溶解度進(jìn)行測(cè)定，稍作修改。將SP和MP蛋白稀釋至1 mg/mL，低溫離心（4℃，5 000 r/min，20 min），通過(guò)上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)的氮溶指數(shù)（NSI）按式（2）計(jì)算。

1.3.7 干腌牛肉加工過(guò)程中濁度的測(cè)定

濁度的測(cè)定參考Xiong等[7]的方法，并作適當(dāng)修改。將SP和MP蛋白稀釋至1 mg/mL，試管中各取5 mL蛋白稀釋液，分別于30，40，50，60和70 ℃的溫度加熱30 min，冷卻至室溫，測(cè)定吸光度（600 nm），同時(shí)做空白對(duì)照（磷酸鹽緩沖液）。根據(jù)吸光度的大小計(jì)算濁度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)工藝點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3次，顯著水平P＜0.05，數(shù)據(jù)ANOVA分析使用SPSS Statistics 25.0軟件，圖表繪制通過(guò)Origin 2021軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 干腌牛肉微觀結(jié)構(gòu)的變化

樣品表面形態(tài)及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化常用掃描電鏡來(lái)觀察。圖1顯示加工過(guò)程中干腌牛肉蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，干腌牛肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在各時(shí)期均發(fā)生不同程度的變化。肌漿蛋白原料時(shí)結(jié)構(gòu)結(jié)實(shí)致密、間隙小且分布均勻，隨著加工工序的開展，結(jié)構(gòu)變得越來(lái)越疏松，間隙距離明顯增加，逐漸呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀，結(jié)構(gòu)破壞更加嚴(yán)重，同時(shí)，不斷出現(xiàn)肌漿蛋白溶出物。肌原纖維蛋白原料形狀規(guī)則、結(jié)構(gòu)緊密、間隙小且分布均勻，在加工過(guò)程中逐漸呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)疏松，形狀不規(guī)則、間隙變大且分布極不均勻。成品時(shí)結(jié)構(gòu)松散，聚集塊增加，間隙越來(lái)越大，且分布更加不均勻，形成眾多大小不一的蛋白聚集物。造成這些現(xiàn)象的原因是蛋白質(zhì)氧化、水解使蛋白質(zhì)分子的天然構(gòu)象發(fā)生變化，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由原料緊實(shí)至成熟期空洞松散，因而蛋白質(zhì)主要作用力形成也發(fā)生改變，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的相互作用力減弱[8]。

圖1 干腌牛肉加工過(guò)程中蛋白微觀結(jié)構(gòu)變化

2.2 干腌牛肉加工過(guò)程中表面疏水性的變化

蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)分布及構(gòu)象變化通常用蛋白質(zhì)表面疏水性表示。由圖2可知，加工過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性呈顯著增加趨勢(shì)（P＜0.05）。從原料到成品時(shí)干腌牛肉的SP和MP分別增長(zhǎng)49.13%和52.39%，這可能是因溫度升高、蛋白氧化引起蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)改變，使疏水性氨基酸暴露出來(lái)[9]，同時(shí)，受到pH和食鹽量增加影響，蛋白質(zhì)的表面疏水性增強(qiáng)。這與孫為正[6]對(duì)廣式臘腸的研究結(jié)果一致。

圖2 干腌牛肉加工過(guò)程中表面疏水性的變化

2.3 干腌牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)相互作用力

蛋白質(zhì)分子相互作用形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)影響著干腌牛肉產(chǎn)品的功能性質(zhì)。圖3顯示加工過(guò)程中蛋白質(zhì)分子相互作用力變化，S1從原料至腌制期增長(zhǎng)3.96%，而后續(xù)加工至成熟期時(shí)降低14.55%。S2在加工過(guò)程中逐漸減少，降幅為12.31%。S1和S2降低是因蛋白質(zhì)出現(xiàn)變性或降解，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)作用力改變。S3呈現(xiàn)波動(dòng)變化，從原料至腌制期的降幅為2.68%，至風(fēng)干期增加8.90%，加工后期逐漸下降，到成品時(shí)降低21.81%。S4和S5呈先降后升的變化，從原料至腌制期分別下降11.20%和4.54%，而后逐漸上升，到成熟期增幅分別為39.37%和37.10%，試驗(yàn)結(jié)果與表面疏水性的增加一致，說(shuō)明加工過(guò)程中蛋白質(zhì)氧化程度不斷加劇。在干腌牛肉由原料到成品時(shí)二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)影響最大（即S5＞S4＞S3＞S2＞S1），該結(jié)果與孫為正[6]研究相吻合。干腌牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)分子相互作用改變了蛋白質(zhì)構(gòu)象，使靜電相互作用減弱，而氫鍵、疏水相互作用力和二硫鍵明顯增強(qiáng)，蛋白質(zhì)變性聚集對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)形成和穩(wěn)定性有重要影響。

圖3 干腌牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)分子相互作用力變化

2.4 干腌牛肉加工過(guò)程中溶解度的變化

溶解性與氧化變性程度呈正相關(guān)。由圖4可知，加工過(guò)程中干腌牛肉的SP和MP溶解度均呈顯著降低的變化趨勢(shì)（P＜0.05），從原料至成熟期分別下降20.40%和25.56%，這主要因牛肉在腌制過(guò)程中疏水基團(tuán)暴露及氧化使蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)生聚集和沉淀，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性下降，這與鄒朝陽(yáng)[10]研究結(jié)果變化趨勢(shì)一致。

圖4 干腌牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)溶解性的變化

2.5 干腌牛肉加工過(guò)程中濁度的變化

蛋白質(zhì)聚集情況可用濁度來(lái)反映。如圖5所示，加工過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的濁度出現(xiàn)不同程度增長(zhǎng)（P＜0.05）。在同一溫度梯度下，加熱0.5 h后，肌漿蛋白濁度吸光度在成品時(shí)分別增長(zhǎng)0.149，0.192，0.118，0.088和0.103，肌原纖維蛋白濁度吸光度在成品時(shí)分別增長(zhǎng)0.063，0.073，0.077，0.112和0.128，其增長(zhǎng)是因加熱使蛋白分子相互作用形成大分子聚集體，使得光散射增加[11]，同時(shí)，巰基基團(tuán)改變使蛋白質(zhì)出現(xiàn)變性聚集，使?jié)岫仍黾?。干腌牛肉加工過(guò)程中濁度值增加越大，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變及變性形成更大的聚集體。

圖5 干腌牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)濁度的變化

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明：干腌牛肉在加工過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由緊致變得松散無(wú)序；氫鍵、疏水相互作用力和二硫鍵作用下形成蛋白質(zhì)聚集體，且各作用力顯著增強(qiáng)。蛋白質(zhì)表面疏水性分別增加49.13%和52.39%，而溶解性分別減少20.4%和25.56%。蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化對(duì)干腌牛肉品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)特性產(chǎn)生不同程度影響，這為深入干腌牛肉品質(zhì)機(jī)理的研究提供參考依據(jù)，有利于該產(chǎn)品工業(yè)化、規(guī)模化的發(fā)展進(jìn)程。