地膚子總黃酮脫色工藝及抗氧化活性研究

徐蕊，袁永雷，曲麗萍,

1.上海貝泰妮生物科技有限公司（上海 200335）；2.云南貝泰妮生物科技集團有限公司（昆明 650106）；3.云南云科特色植物提取實驗室有限公司（昆明 650106）

地膚子[Kochia scoparia（L.）Schrad.]為藜科、地膚屬植物的干燥成熟果實，又名地葵、地麥、竹帚子、孔雀松。地膚子在山東、江蘇、河南、河北、云南等地區(qū)有廣泛分布，其常生于山野、荒地、路旁，亦有庭院栽培用于觀賞。地膚子是一種具有悠久用藥歷史的傳統(tǒng)中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。對其描述“性味辛、苦，性寒，具有清熱利濕、祛風(fēng)止癢、利尿通淋的功效”[1]，現(xiàn)代臨床中常用于治療瘙癢、濕疹等皮膚類疾病[2]?！兜崮媳静荨酚涊d，地膚子可利膀胱小便積熱，洗皮膚之風(fēng)，療婦人諸經(jīng)客熱[3]?！侗静菥V目》記載：“地膚嫩苗，可作蔬茹”，地膚子在民間也被叫作掃帚菜，其嫩葉可作為蔬食之物，營養(yǎng)美味，老株可為掃帚，打掃庭院。

研究表明，地膚子具有抗炎[4]、抗過敏[5]、抗病原菌[6]、抗氧化[7]等作用，其主要化學(xué)成分包括三萜皂苷類化合物、黃酮類化合物、揮發(fā)油和微量元素等[1,8-10]。地膚子皂苷Ic（Momordin Ic）作為主要有效成分，具有抗炎、抗瘙癢和抗過敏的作用[11-12]。地膚子提取物中富含黃酮類化合物，是其發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠清除體內(nèi)過量自由基，對于其發(fā)揮抗氧化和抗衰能力具有重要意義[7,10,13]。

目前對于地膚子中活性成分的提取主要采用水提[14]、醇提[15-17]等傳統(tǒng)工藝，但是多糖、蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)也會隨之溶出，增加了分離純化工藝的難度，且黃酮部位顏色較深，多為棕褐色，會極大影響地膚子提取物的色澤、純度，限制其在藥品、功效性護膚品和保健食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

常用的除色素的方法有活性炭、大孔樹脂、膜脫色、過氧化氫脫色等[18-19]?；钚蕴棵撋ǖ脑硎抢每谞罱Y(jié)構(gòu)對色素產(chǎn)生吸附作用，使有效成分與色素分離，達到脫色目的[20]?；钚蕴孔鳛槌Ｓ梦絼诠I(yè)化生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，具有吸附能力強、無異味等特點。

因此，試驗先通過大孔樹脂富集地膚子的黃酮部位，選用活性炭作為試驗脫色劑，以活性炭添加量、脫色溫度和脫色時間為考察因素，設(shè)計正交試驗，篩選最佳的地膚子黃酮提取液脫色技術(shù)工藝。試驗致力于解決地膚子脫色問題，提升地膚子提取物在藥品、保健食品和功效性護膚品領(lǐng)域的應(yīng)用，為地膚子提取物投入生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)，具有重要的理論意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地膚子藥材（云南省昆明市）；活性炭粉767針用活性炭（上?；钚蕴繌S）；AB-8大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁和亞硝酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼，2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，≥98%）、維生素C（≥99%）、蘆?。ā?8.7%）：上海源葉科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XPE105電子分析天平（瑞士梅特勒）；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[步琦實驗室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司]；DF-101S電熱恒溫水浴鍋（上海景寧科學(xué)儀器有限公司）；MULTISKAN SkyHigh酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；GM-0.33A蠕動泵（上海蟻霖科學(xué)儀器有限公司）；Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀（安捷倫科技美國有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 地膚子黃酮提取液制備

地膚子黃酮提取液制備參考文獻方法[7, 11]并進行適當(dāng)調(diào)整。稱取100 g地膚子藥材，選擇體積分數(shù)70%的乙醇為提取溶劑，料液比1∶10（g/mL），采用回流提取裝置進行加熱回流提取，減壓濃縮得到地膚子浸膏。用200 g AB-8大孔樹脂進行分離純化，依次用純水洗脫2 BV（樹脂柱體積）和體積分數(shù)為40%的乙醇洗脫5 BV，去除雜質(zhì)和非目標(biāo)成分，使用體積分數(shù)為80%的乙醇洗脫8 BV，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮得到棕褐色地膚子黃酮提取液。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準曲線制作

參照文獻[21-22]的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL蘆丁標(biāo)準溶液，倍半稀釋，置于10 mL的容量瓶中，加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液，放置反應(yīng)6 min，然后加入0.4 mL 10%硝酸鋁溶液，放置反應(yīng)6 min，再加入0.4 mL 5%的氫氧化鈉溶液后放置反應(yīng)15 min，定容。在500 nm波長下測定吸光度。以蘆丁溶液濃度（x）和吸光度（y）做標(biāo)準曲線，用Origin軟件繪制蘆丁標(biāo)準曲線。得到線性回歸方程：y=0.510 9x+0.012 7，R2=0.997 1。

1.3.3 脫色效果評價指標(biāo)

采用地膚子提取液的黃酮保留率和脫色率兩個指標(biāo)作為對地膚子黃酮提取液活性炭脫色效果的評價。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法在500 nm下測定提取脫色前后提取液吸光度，黃酮保留率按式（1）進行計算。

根據(jù)文獻方法[23]，測定地膚子提取液脫色前后提取液在420 nm處測量的吸光度，脫色率按式（2）進行計算。

采用綜合加權(quán)評分法[24-25]進行考察，黃酮保留率和脫色率兩項考察指標(biāo)權(quán)重系數(shù)均為0.5，綜合評分按式（3）進行計算。

1.3.4 單因素試驗

選取三種因素（活性炭添加量、脫色溫度和脫色時間）作為地膚子提取液脫色工藝的考察因素，分別進行單因素試驗，考察以上三個因素對脫色效果的影響。

取100 g地膚子黃酮提取液于燒杯中，溶液呈深棕褐色，按照試驗設(shè)計，加入一定量的活性炭，在一定溫度下水浴加熱攪拌一段時間，趁熱過濾除去活性炭，收集地膚子黃酮提取液脫色后的濾液，備用。

1.3.4.1 活性炭添加量對脫色效果的影響

分別取100 g地膚子黃酮提取液，置于200 mL燒杯，考察活性炭添加量0.3%，0.5%，1%，1.5%和2%對脫色率和黃酮保留率的影響。設(shè)置反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間30 min，過濾去除活性炭，過濾后比較各濾液顏色。離心取上清液，按1.3.3小節(jié)中所述方法對地膚子黃酮提取液的黃酮保留率和脫色率進行計算。

1.3.4.2 脫色溫度對脫色效果的影響

分別取100 g地膚子黃酮提取液，置于200 mL燒杯，按照1%活性炭加入量，考察脫色溫度30，40，50，60和70 ℃對脫色率和黃酮保留率的影響。反應(yīng)30 min后過濾去除活性炭，比較不同溫度條件下的濾液顏色。離心后取上清液，按1.3.3小節(jié)中所述方法對地膚子黃酮提取液的黃酮保留率和脫色率進行計算。

1.3.4.3 脫色時間對脫色效果的影響

分別取100 g地膚子黃酮提取液，置于200 mL燒杯，按1%的活性炭添加，在50 ℃水浴加熱，考察脫色時間10，20，30，40和50 min對脫色率和黃酮保留率的影響。過濾去除活性炭，比較不同脫色時間條件下的濾液顏色。按1.3.3小節(jié)中所述方法對地膚子黃酮提取液的黃酮保留率和脫色率進行計算。

1.3.5 正交試驗設(shè)計

根據(jù)地膚子黃酮提取液脫色單因素的試驗結(jié)果，活性炭添加量、脫色溫度和脫色時間三種因素是影響地膚子黃酮提取液脫色效果的主要因素。因此選取活性炭添加量、脫色溫度和脫色時間三因素進行地膚子黃酮提取液脫色的正交試驗設(shè)計，每個因素選取3個水平，并對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，以確定最佳的工藝參數(shù)。正交試驗中各因素的水平設(shè)計見表1。

表1 因素水平

1.3.6 抗氧化試驗

參考文獻[26-27]，采用1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基法（DPPH）評價地膚子提取物的抗氧化能力。配制0.1 mg/mL DPPH溶液和0.5 mg/mL維生素C溶液，備用。維生素C溶液備用，倍半稀釋，得到6個以上不同濃度的溶液，作為陽性對照。配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL地膚子溶液。加入DPPH溶液，振蕩搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率按式（4）進行計算。

式中：AS為樣品組測定吸光度；ASB為樣品空白組測定吸光度；AC為控制組測定吸光度；ACB為控制空白組測定吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進行變化顯著性分析。使用Origin軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪制圖表，所有試驗重復(fù)3次，*表示P＜0.05顯著性差異。

酒堡背倚山巒，在城堡墻頭仰望，一片平緩的山坡開闊地延綿到高處密不透風(fēng)的山林。莊主打開一本藍圖，描述了規(guī)劃中楚樽閣景象。山坡上將建成空中酒閣，與酒堡互為犄角，由藏酒而品酒。以酒宴為主題，構(gòu)思禮儀、服飾、音樂、舞蹈，盡顯先秦年代楚國風(fēng)格的酒文化文章。屆時，登臨楚樽閣沐浴更衣，焚香執(zhí)禮。品一樽美酒時，佐酒的是古琴楚樂，《楚辭·九歌》。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 活性炭添加量對脫色效果的影響

考察不同活性炭添加量對地膚子黃酮部位提取液的黃酮保留率和脫色率影響，結(jié)果如圖1所示。

觀察濾液顏色發(fā)現(xiàn)，地膚子黃酮濾液顏色隨著活性炭添加量的增加由深至淺。由圖1可以看出，在試驗設(shè)置的范圍內(nèi)，脫色率隨活性炭添加量增加而上升，但提取液的黃酮保留率卻隨活性炭添加量增加而降低，該現(xiàn)象與金華等[21]在優(yōu)化銀杏葉脫色工藝中測定活性炭用量對脫色效果的影響時類似。因此為了保證地膚子黃酮提取液的脫色率和黃酮保留率均處在較高水平，綜合實際情況考慮后，確定使用1%活性炭添加量作為后續(xù)試驗最佳添加量。

2.1.2 脫色溫度對脫色效果的影響

考察不同脫色溫度對地膚子黃酮部位提取液的黃酮保留率和脫色率影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 脫色溫度對地膚子黃酮提取液脫色效果的影響

觀察濾液顏色發(fā)現(xiàn)，地膚子黃酮提取液的濾液顏色隨著溫度的增加而逐漸變淺。由圖2可以看出，在試驗設(shè)置的溫度范圍內(nèi)，地膚子黃酮提取液的脫色率隨溫度的升高先增加后下降，50 ℃達到最高，脫色率75.25%，總體趨勢較為平緩；黃酮保留率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，趨勢明顯，在溫度為60 ℃時黃酮保留率達到最高65.09%。溫度升高會加速色素分子擴散，有利于脫色，但同時會導(dǎo)致黃酮保留率降低，故脫色溫度70 ℃時黃酮保留率下降原因可能是過高的溫度降低活性炭對黃酮的吸附作用。當(dāng)溫度升至50 ℃時，黃酮保留率較高，同時脫色率也處于較高水平，因此選擇50 ℃作為后續(xù)試驗的脫色溫度。

2.1.3 脫色時間對脫色效果的影響

考察不同脫色時間對地膚子黃酮部位提取液的黃酮保留率和脫色率影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 脫色時間對地膚子黃酮提取液脫色效果的影響

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗分析，選取活性炭添加量、脫色溫度和脫色時間三個因素進行地膚子黃酮提取液脫色的正交試驗設(shè)計。選擇黃酮保留率和脫色率的綜合評分來確定最佳工藝條件。按照1.3.3小節(jié)公式計算綜合評分。

綜合評分=（脫色率/85.26）×100%×50%+（黃酮保留率/79.52）×100%×50%，試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

由表2和表3可知，按照對地膚子黃酮提取液脫色效果影響程度，影響順序為A＞B＞C，即活性炭用量（A）對脫色效果影響最為顯著（P＜0.05），是脫色工藝流程的關(guān)鍵條件，其次為脫色溫度（B）和脫色時間（C）。因此，根據(jù)正交試驗結(jié)果確定地膚子黃酮提取液脫色的最佳工藝A1B3C1，即活性炭添加量0.5%，脫色溫度60 ℃、脫色時間20 min時效果最好。

表3 方差分析表

2.3 最佳工藝驗證試驗

為了檢驗地膚子黃酮提取液的正交試驗所得結(jié)果的可靠性，在最佳試驗條件下進行驗證試驗。平行取3份制備的地膚子黃酮提取液，試驗脫色溫度為60 ℃，加入0.5%活性炭，脫色時間20 min，計算地膚子黃酮提取液的黃酮保留率和脫色率。同時，使用HPLC對地膚子提取液中的活性成分地膚子皂苷Ic的含量進行測定[28]。結(jié)果見表4。

表4 工藝驗證試驗（n=3） 單位：%

在此條件下，3次試驗脫色率均值為64.07%，黃酮保留率均值為77.58%，符合預(yù)期結(jié)果。表明正交試驗所優(yōu)化的最佳工藝穩(wěn)定可行。試驗采用活性炭脫色法能夠除去提取物中雜質(zhì)、色素和可能存在的致敏成分，脫色后的濾液呈淺黃色，地膚子提取液的色澤得到了顯著改善。此工藝脫色效果好且有效成分含量波動范圍較小，可以極大地拓展地膚子提取物的應(yīng)用。

2.4 抗氧化活性

地膚子提取物具有優(yōu)異的抗氧化活性[7,11]。如圖4所示，地膚子提取物脫色前和脫色后對DPPH自由基均有較好的清除效果，DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而逐漸加強，且脫色前的地膚子提取物清除率優(yōu)于脫色后清除率。

圖4 地膚子提取物對DPPH自由基的清除能力

經(jīng)計算，VC的IC50值為0.013 3 mg/mL，脫色前的地膚子提取物半抑制濃度IC50為0.063 1 mg/mL，脫色后的地膚子提取物半抑制濃度IC50為0.114 5 mg/mL，脫色前地膚子提取物對DPPH自由基清除能力高于脫色后。其原因可能是脫色工藝使得地膚子提取物中的一部分總黃酮損失，影響了總黃酮的抗氧化活性。經(jīng)脫色工藝處理后地膚子提取物在明顯改善色澤的同時依然具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

試驗采用單因素考察和正交試驗對地膚子黃酮部位活性炭的脫色工藝進行設(shè)計和優(yōu)化，確定地膚子黃酮提取液的脫色最佳工藝：活性炭添加量0.5%，脫色溫度60 ℃，脫色時間20 min。在此條件下進行驗證試驗：地膚子黃酮提取液脫色率均值可達64.07%，地膚子黃酮提取液的黃酮保留率均值可達77.58%。經(jīng)脫色工藝處理后的地膚子黃酮提取液顏色由棕褐色變?yōu)槌吻宓臏\黃色，該脫色工藝既保證了地膚子黃酮提取液具有較好的脫色效果，又保證了其黃酮保留率處于較高水平，且此脫色工藝對地膚子提取物中的活性成分地膚子皂苷Ic的損失較小。

另外，研究通過脫色前后的地膚子提取物對DPPH自由基清除作用評價抗氧化活性。結(jié)果表明脫色前的地膚子提取物抗氧化活性優(yōu)于脫色后，其原因可能是脫色工藝使得地膚子提取物中的一部分總黃酮損失，影響了總黃酮的抗氧化活性。經(jīng)此脫色工藝優(yōu)化后的地膚子提取物在改善色澤的同時具有良好的抗氧化活性。后續(xù)將進一步探究地膚子提取物作為天然活性成分的應(yīng)用。

因此，優(yōu)選脫色工藝后所得到的地膚子黃酮部位外觀得到顯著改善，解決了地膚子在實際應(yīng)用中顏色深的問題，降低風(fēng)險刺激以及增加產(chǎn)品附加值，具有更好的應(yīng)用價值，為地膚子提取物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持和參考。