霍山石斛抗炎及腫瘤細胞毒活性研究

李艷茹，陳簫簫,2，許鳳清,3，王仁中，吳德玲,3*

(1.安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012; 2.六安市中醫(yī)院 藥劑科，安徽 六安 237000;3.安徽中醫(yī)藥大學 中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

霍山石斛又名米斛，為蘭科植物霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 的新鮮或干燥莖。作為傳統(tǒng)名貴中藥在我國具有悠久的藥用歷史，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[1]，被譽為“九大仙草”之首?；羯绞饕植加诎不帐』羯娇h、金寨縣等地[2]，是我國蘭科石斛類藥材中的特有品種。

霍山石斛作為藥食同源的中藥材，具有抗炎[3]、抗氧化[4-6]、抗腫瘤[7-11]以及免疫調(diào)節(jié)[12-13]等藥理活性?；羯绞餮髤㈩w粒、霍山石斛膠囊等都是具有保健食品批準號的產(chǎn)品?；羯绞奈镔|(zhì)基礎研究主要集中于現(xiàn)代分析手段對其中的聯(lián)芐類、黃酮類及生物堿類成分進行辨識[14-17]。本研究在前期完成霍山石斛乙醇提取物的系統(tǒng)化學分離工作的基礎上[18-19]，研究霍山石斛各組分以及單體化合物的抗炎以及腫瘤細胞毒活性，以期為霍山石斛的深度開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試藥

FORMA 700 型超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；Direct-Q with pump 型超純水儀（美國Millopore 公司）；SW-CJ-2FD 型超凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；FACSCanto II 流式細胞儀（美國BD 公司）；FA2104B 型分析天平（十萬分之一，上海右一儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；KH22R 型冷凍離心機（凱達科學儀器有效公司）；SpectraMax i3x 型酶標儀（美谷分子儀器有限公司）。DCFH-D 試劑盒（Beyotime Biotechnology, China）；NO檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；胎牛血清（FBS, GIBCO, Invitrogen Corporation，NY，USA）；RPMI1640 培 養(yǎng) 基（GIBCO，Invitrogen Corporation，NY，USA）；青霉素（Sigma，St.Louis，MO，USA）；鏈霉素（Sigma，St.Louis，MO，USA）；胰蛋白酶（Gibco，Grand Island，NY，USA）；Griess Reagent（格里斯試劑）、LPS、L-NMMA（單精氨酸）、MTS、Cisplatin（順式二胺二氯鉑）、paclitaxel（紫杉醇）均購自Sigma 公司；小鼠單核巨噬細胞（RAW 264.7 細胞）、HL-60（人白血病細胞）、A-549（人肺癌細胞）、SMMC-7721（人肝癌細胞）、MCF-7（人乳腺癌細胞）、SW480（人結腸癌細胞）均購自American Tissue Culture Collection（ATCC，Rockville，MD，USA）。

霍山石斛購自安徽省霍山縣長沖中藥材開發(fā)有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授鑒定為蘭科植物霍山石斛Dendrobium.huoshanenseC.Z.Tang et S.J Cheng 的干燥莖。用于測試的單體化合物均來自于安徽中醫(yī)藥大學中藥化學研究室。

2 方法

2.1 樣品的制備

霍山石斛粗粉（9.8 kg），依次用95%和50%乙醇滲漉提取，合并滲漉液，減壓回收溶劑得乙醇浸膏（1.6 kg）。浸膏加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮回收溶劑，分別得到石油醚部分（425 g，編號為A，得率為4.3%）、乙酸乙酯部分（160 g，編號為B，得率為1.6%）、正丁醇部分（340 g，編號為C，得率為3.5%）和水層（減壓回收至無醇味）。藥渣粉末揮去乙醇后，加8倍量水煎煮2次，每次2 h，水煎液濃縮后，加乙醇至濃度達80%乙醇，靜置，過濾，上清液濃縮后與萃取后的水層合并得水部分（1 042 g，編號為D，得率為10.6%）。利用各種色譜法（硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、ODS 反相柱色譜、高效液相制備色譜等）進行分離純化得到化合物1 ～ 11，分別為aduncin C（1）、michehedyoside C（2）、3,4-二羥基-5-甲氧基 苯 甲 醛（3）、5-hydroxyisobenzofuran-1 (3H)-one（4）、柚皮素（5）、4,4'-二羥基-3,5-二甲氧基聯(lián)芐（6）、鉤狀石斛素（7）、3,4,5-trimethoxyphenol-1-O-β-D-glucopyranoside（8）、(+)-syringaresinol-4-Oβ-D-glucopyranoside（9）、丁香脂素-4, 4'-O-β-D-二葡萄糖苷（10）、erythrosyringoylglycerol-4-O-β-Dglucoside（11）[19]。

2.2 抗炎活性

2.2.1 RAW 264.7 細胞培養(yǎng) 參考文獻[20]的方法，并稍作調(diào)整。RAW 264.7 細胞接種于培養(yǎng)瓶中，采用含10% FBS 并加有青霉素（終濃度為100 U/mL）和鏈霉素（終濃度為100 μg/mL）的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合至90%時，棄去培養(yǎng)基，加2 mL PBS洗滌細胞2次，棄去PBS 后加入2 mL 的0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA 混合消化液，置顯微鏡下觀察約30 s，當細胞變圓后迅速加入2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，4℃以轉(zhuǎn)速800 r/min 離心5 min，棄去上清液，收集細胞，用培養(yǎng)基重新懸浮細胞，分瓶培養(yǎng)，隔天換液。

2.2.2 RAW 264.7 細胞的ROS 測定 參考文獻[21]的方法，并稍作調(diào)整。采用二氯熒光乙酰乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針測定RAW 264.7 細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 含量。將對數(shù)生長期的細胞以1×106cells/孔接種于6 孔板上，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞80%融合后，空白組加入含等體積溶媒（0.1%DMSO）培養(yǎng)基處理RAW 264.7 細胞，模型組和給藥組分別加入含LPS（200 ng/mL）的培養(yǎng)基孵育RAW 264.7 細胞2 h 后，將模型組更換為不含LPS的培養(yǎng)基孵育細胞24 h，將給藥組更換為霍山石斛乙醇提取物以及不同極性部位樣品（低、中、高劑量組終濃度分別為50、100、200 mg/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。孵育結束后，按照分組情況分別收集細胞，將其放置在流式管中，每管加入0.5 mL 細胞培養(yǎng)液，重懸浮后再加入0.5 mL DCFH-DA 染色工作液，混勻，放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min 后，4℃以轉(zhuǎn)速600 r/min 離心4 min，除去上清液，加入1 mL PBS 緩沖液洗滌兩次，最后使用0.5 mL PBS 緩沖液懸浮細胞，30 min 內(nèi)利用流式細胞儀在470/530 nm 下測定細胞內(nèi)ROS 水平。

2.2.3 RAW 264.7 細胞內(nèi)NO 的測定 參照“2.2.1”項下方法培養(yǎng)細胞。采用Griess 試劑顯色法檢測NO生成量[22]。實驗方法參照“2.2.2”，將RAW 264.7 細胞接種至96 孔板，用1 μg/mL LPS 進行誘導刺激，同時加入霍山石斛乙醇提取物（終濃度為50 μg/mL）、不同極性部位（終濃度為50 μg/mL）和單體化合物1 ～ 11（終濃度為50 μmol/L）處理，陽性對照組加入NG-L-單甲基精氨酸單醋酸鹽（L-NMMA，總NOS 抑制劑）（50 μmol/L）。孵育細胞24 h 后取培養(yǎng)基檢測NO，在570 nm 處測定吸光度值（OD），計算各組分對NO 釋放的抑制率。

2.3 體外抗腫瘤活性評價

2.3.1 5 株腫瘤細胞培養(yǎng) HL-60、A-549、SMMC-7721、MCF-7 和SW-480 參照“2.2.1”項下方法培養(yǎng)，將培養(yǎng)基更換為含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基[23-24]。

2.3.2 測定腫瘤細胞的抑制率 參考文獻[25]的方法，并稍作調(diào)整。采用MTS 法將細胞提前24 h 接種培養(yǎng)，以每孔3 000 ～ 15 000 個的細胞接種到96 孔板。空白對照組加入含等體積溶媒（0.1% DMSO）的培養(yǎng)基處理細胞，給藥組分別加入霍山石斛乙醇提取物，不同極性部位樣品100 μL （100 μg/mL）和單體化合物1 ～ 11（終濃度為40 μmol/L），陽性對照組分別加入Cis-platin 100 μL（40 μg/mL）和paclitaxel100 μL（5 μg/mL），每種處理均設3 個復孔。37℃條件下培養(yǎng)48 h 后，細胞貼壁后除去孔內(nèi)培養(yǎng)液，在每孔內(nèi)加MTS 溶液20 μL 和培養(yǎng)液100 μL，每個樣品設3 個空白復孔（空白組，含MTS 溶液20 μL 和培養(yǎng)液100 μL 的混合液），繼續(xù)孵育4 h，使用酶標儀（492 nm）測定各孔的吸光度值（OD），記錄實驗結果。

2.3.3 測定化合物6的IC50實驗方法參照“2.3.2”，用不同濃度的單體化合物6（40、8、1.6、0.32、0.064μmol/L）處理HL-60、SMMC-7721、MCF-7 細胞。計算化合物6 的IC50值。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 霍山石斛乙醇提取物及不同極性部位對ROS 的影響

炎癥的病理狀態(tài)與細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生量密切相關，本研究采用DCFH-DA 熒光探針測定RAW 264.7細胞內(nèi)ROS 的水平。與空白組相比，模型組（LPS 200 ng/mL）RAW 264.7 細胞內(nèi)ROS 的水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，石油醚部位的低、中、高劑量組細胞內(nèi)ROS 水平均降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明石油醚部位對細胞內(nèi)ROS 水平的抑制作用較弱。與模型組相比，霍山石斛乙醇提取物和水部位的中、高劑量組細胞內(nèi)ROS 的水平降低（P＜0.05），說明上述部位對細胞內(nèi)ROS 水平的抑制作用較強。與模型組相比，乙酸乙酯部位和正丁醇部位的低、中、高劑量組均能降低細胞內(nèi)ROS的水平（P＜0.05），說明乙酸乙酯部位和正丁醇部位與其它部位相比對細胞內(nèi)ROS 水平的抑制作用較強，見圖1。

圖1 霍山石斛不同提取部位對RAW 264.7 小鼠巨噬細胞的ROS 水平的影響（±s，n = 3）Fig.1 Effects of different extraction sites of D. huoshanense Tang et Cheng on ROS level of macrophages in RAW 264.7 cell lines（±s，n = 3）

3.2 霍山石斛乙醇提取物及不同極性部位對NO 的影響

NO是LPS誘導RAW 264.7細胞炎癥模型過程中產(chǎn)生的一種重要的炎癥介質(zhì)，其產(chǎn)生量隨著細胞炎癥反應的增強而增加。本實驗采用Griess 試劑顯色法檢測NO 生成量。陽性對照藥L-NMMA 濃度為50 μmol/L，乙醇提取物及不同極性部位濃度均為50 μg/mL，測定結果見表1。霍山石斛乙醇提物以及不同極性部位對LPS 誘導的RAW 264.7 巨噬細胞內(nèi)NO 生成均具有一定的抑制作用（P＜0.05），其中，乙醇提取物、石油醚部位和正丁醇部位對NO 生成的抑制作用較弱，其NO 生成抑制率分別為16.05%、18.95%、15.75%。乙酸乙酯部位對NO 生成的抑制作用較強，NO 生成抑制率為26.39%（P＜0.05）。

表1 霍山石斛乙醇提取物及其不同極性萃取部位對NO 生成抑制率（±s，n = 3）Tab.1 The inhibitory rate of ethanol extracts from D. huoshanense and its different polar extracts on NO production（±s，n = 3）

表1 霍山石斛乙醇提取物及其不同極性萃取部位對NO 生成抑制率（±s，n = 3）Tab.1 The inhibitory rate of ethanol extracts from D. huoshanense and its different polar extracts on NO production（±s，n = 3）

注：同列字母完全不同，表示差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），表2 ～ 4 同。

樣品 抑制率/%L-NMMA 53.52±0.53a乙醇提取物 16.05±1.53c石油醚部位 18.95±2.54c乙酸乙酯部位 26.39±2.84b正丁醇部位 15.75±1.72c水部位 4.91±3.20d F 109.564 P 0.000

3.3 單體化合物對NO 生成的影響

對霍山石斛中分離得到的化合物1 ～ 11 進行LPS誘導的RAW264.7 巨噬細胞內(nèi)抑制NO 活性篩選，陽性對照藥L-NMMA 濃度為50 μmol/L，11 個化合物濃度均為50 μmol/L，測定結果見表2?；衔? 和化合物6 表現(xiàn)出較好的抑制NO 生成的作用，NO 生成抑制率分別為21.88%和23.32%。其它化合物在50 μmol/L 濃度下抑制NO 生成的作用均較弱。

表2 化合物NO 生成抑制率（±s，n = 3）Tab.2 Results of NO generation inhibition rate of compounds（±s，n = 3）

表2 化合物NO 生成抑制率（±s，n = 3）Tab.2 Results of NO generation inhibition rate of compounds（±s，n = 3）

樣品 抑制率/%L-NMMA 53.52±0.53a化合物1 6.57±2.32d化合物2 3.95±0.41d化合物3 21.88±1.21b化合物4 6.53±2.70d化合物5 11.12±2.06c化合物6 23.32±2.26b化合物7 5.26±1.79d化合物8 5.03±1.82d化合物9 4.92±0.76d化合物10 7.57±1.45cd化合物11 5.16±1.12d F 144.174 P 0.000

3.4 霍山石斛乙醇提取物及不同極性部位對5 株腫瘤細胞的細胞毒性

本研究采用MTS 法對霍山石斛乙醇提取物及不同極性部位進行抑制細胞增殖活性篩選。陽性對照藥Cis-platin 濃度為40 μg/mL，paclitaxel 濃度為5 μg/mL；乙醇提取物及不同極性部位濃度均為100 μg/mL。乙醇提物和石油醚部位均對除HL-60 細胞外的其他細胞具有一定的抑制細胞增殖的作用（P＜0.05）。石油醚部位對A-549 細胞、SMMC-7721 細胞、MCF-7細胞、SW-480 細胞的細胞抑制率分別為49.76%、33.28%、31.40%、49.96%；其它部位也具較弱的抑制細胞增殖的作用，見表3。

表3 霍山石斛乙醇提取部位及其不同極性萃取部位對5 株腫瘤細胞的細胞抑制率（%，±s，n = 3）Tab.3 Cell inhibition rate of ethanol extracted parts of D. huoshanense and its different polar extraction sites on 5 tumor cells （%，±s，n = 3）

表3 霍山石斛乙醇提取部位及其不同極性萃取部位對5 株腫瘤細胞的細胞抑制率（%，±s，n = 3）Tab.3 Cell inhibition rate of ethanol extracted parts of D. huoshanense and its different polar extraction sites on 5 tumor cells （%，±s，n = 3）

樣品 HL-60 A-549 SMMC-7721 MCF-7 SW-480 Cis-platin 97.99±0.12a 59.36±1.25a 66.45±0.10a 69.20±0.56a 70.68±1.21a paclitaxel 91.54±0.09b 59.41±0.44a 64.09±0.81a 72.45±0.68a 62.65±0.99b乙醇提取物 -14.63±0.55e 47.55±2.49b 31.62±1.55b 18.71±0.82c 47.09±1.10c石油醚部位 -12.30±1.63e 49.76±1.03b 33.28±0.38b 31.40±2.42b 49.96±1.00c乙酸乙酯部位 -13.00±2.46e 12.36±0.65c 11.92±1.00c 4.64±0.80e 11.76±3.63d正丁醇部位 0.07±2.99d 6.45±0.44d 7.78±2.23d 13.59±3.50d 6.66±3.54de水部位 8.73±0.68c 4.97±3.05d 7.07±1.54d 3.54±0.66e 4.02±2.31e F 1 901.226 466.691 773.552 573.550 307.819 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3.5 單體化合物對5 株腫瘤細胞的細胞毒性

采用MTS 法對霍山石斛所分離得到11 個化合物進行抑制細胞增殖活性篩選，陽性對照藥Cis-platin濃度為40 μg/mL，paclitaxel 濃度為5 μg/mL；化合物濃度均為40 μmol/L?；衔? 具有較好的體外抑制細胞增殖的作用，對HL-60、SMMC-7721 和MCF-7 三株腫瘤細胞的細胞抑制率依次為66.18%、59.47%、67.07%。其它化合物均具較弱的抑制細胞增殖的作用，見表4。

表4 單體化合物對5 株腫瘤細胞的細胞毒性 （±s，n = 3）Tab.4 Cytotoxicity of monomeric compounds on 5 tumor cell（±s，n = 3）

表4 單體化合物對5 株腫瘤細胞的細胞毒性 （±s，n = 3）Tab.4 Cytotoxicity of monomeric compounds on 5 tumor cell（±s，n = 3）

樣品 HL-60 A-549 SMMC-7721 MCF-7 SW-480 Cis-platin 97.99±0.12a 59.36±1.25a 66.45±0.10a 69.20±0.56ab 70.68±1.21a paclitaxel 91.54±0.09b 59.41±0.44a 64.09±0.81ab 72.45±0.68a 62.65±0.99b化合物1 13.19±1.28def 5.79±4.42ef 2.31±2.40e 12.58±1.73cd 9.14±0.64fg化合物2 8.66±0.73fgh 13.09 ±1.33cd 17.35±1.29c 16.70±3.93c 16.61±3.53de化合物3 13.18±2.64def 4.25 ±0.35ef 8.72±1.35d 12.37±1.80cde 10.25±1.08f化合物4 15.17±1.49d 7.34 ±2.89de 17.16±2.72c 12.33±0.90cde 12.21±3.64ef化合物5 13.57±1.83de 5.95 ±3.74ef 5.80±2.48de 16.79±2.59c 17.11±2.81de化合物6 66.18±0.70c 43.90 ±0.43b 59.47±1.11b 67.07±0.47b 49.91±3.35c化合物7 12.36±1.95defg 3.15 ±2.30ef 7.71±2.12de 9.74±1.71def 19.94±1.48d化合物8 7.77±1.10gh 5.44±4.46ef 5.03±3.86de 11.21±1.25def 9.36±1.71fg化合物9 6.16±3.98h 6.26±2.87ef 6.33±1.09de 7.60±1.96efg 4.36±1.96g化合物10 11.67±0.89defg 14.39±1.24c 7.38±1.97de 7.24±3.04fg 19.82±0.36d化合物11 10.17±2.81efgh 1.04 ±0.77f 10.07±4.51d 3.73±1.54g 19.45±2.80d F 644.035 147.612 221.775 349.272 186.562 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3.6 化合物6 的IC50 測定結果

化合物6 對HL-60、SMMC-7721 和MCF-7 細胞的IC50進行研究，實驗結果所示，對HL-60、SMMC-7721 和MCF-7 細胞的IC50值分別為27.79 μmol/L、6.66 μmol/L 和25.01 μmol/L，見表5。

表5 化合物6 對3 株腫瘤細胞的IC50 測定結果（μmol/L，±s，n = 3）Tab.5 Determination results of IC50 to compound 6 on 3 tumor cells（μmol/L，±s，n = 3）

表5 化合物6 對3 株腫瘤細胞的IC50 測定結果（μmol/L，±s，n = 3）Tab.5 Determination results of IC50 to compound 6 on 3 tumor cells（μmol/L，±s，n = 3）

樣品 HL-60 SMMC-7721 MCF-7化合物6 27.79±0.33 6.66±1.78 25.01±0.95 Cis-platin 2.75±0.12 18.71±1.25 4.57±0.10 paclitaxel ＜0.008 ＜0.008 ＜0.008

4 討論

本實驗通過LPS 誘導的細胞炎癥模型（細胞內(nèi)ROS 水平檢測和抑制NO 生成活性）和MTS 法對霍山石斛各組分以及單體化合物進行抗炎以及抗腫瘤活性篩選。實驗結果表明霍山石斛乙醇提取物具有一定降低ROS 水平以及抑制NO 生成的作用，石油醚部位對降低ROS 水平作用相對較弱，二者對除HL-60 細胞外的其它癌細胞均具有一定的抑制細胞增殖活性。與其它部位相比，正丁醇部位對降低ROS 水平作用較強并且呈現(xiàn)出劑量依賴性，乙酸乙酯部位抑制NO 生成的作用較強，說明霍山石斛各組分之間的生物活性存在差異。在11 個單體化合物中，化合物3 來自于石油醚部位、化合物6 來自于乙酸乙酯部位，二者抑制NO 生成的作用較好，并且化合物6 具有較好的體外抑制細胞增殖活性。化合物6 （4,4'-二羥基-2,5-二甲氧基聯(lián)芐）為聯(lián)芐類化合物，在之前的報道中，已有研究者從其它石斛中分離得到這一類化合物，發(fā)現(xiàn)這一類化合物在抗炎方面具有很好的生物活性[26-27]。

5 結論

通過對霍山石斛乙醇提取物、不同極性部位以及從中分離得到的單體化合物的抗炎以及抗腫瘤活性研究發(fā)現(xiàn)，霍山石斛的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位與其它部位相比生物活性較強，后續(xù)可以重點研究?；衔? 和6 具有較好的抑制NO 生成的作用，并且化合物6 具有較好的體外抑制細胞增殖活性。本實驗為霍山石斛后續(xù)化學成分、抗炎活性以及資源綜合開發(fā)利用提供方向,但是藥理活性研究目前處于淺顯階段，其作用機制有待進一步研究。