苧麻炭疽病病原菌的分離與鑒定

王緒霞，湯滌洛，彭洪翠，彭蝶，黎州，劉立軍

(1.武昌首義學(xué)院城市建設(shè)學(xué)院，湖北 武漢 430064；2.咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 咸寧 437100；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

苧麻(Boehmeria niveaL. Gaud)是蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬(Boehmeria)多年生宿根性纖維作物，在我國有著悠久的種植歷史。 我國苧麻種質(zhì)資源和遺傳多樣性豐富，種植面積和原料產(chǎn)量在世界上處于優(yōu)勢地位[1]。 苧麻炭疽病是苧麻上經(jīng)常發(fā)生的主要病害之一，給苧麻生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。 該病害在我國長江流域以南各省麻區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病率達(dá)20%～40%，感病后葉片上產(chǎn)生典型病斑進(jìn)而影響作物生長，發(fā)病嚴(yán)重的麻園纖維產(chǎn)量減產(chǎn)達(dá)l0%以上[3]，并且刮制后的原麻有紅褐色斑點，極大影響苧麻纖維的品質(zhì)[4]。 長期以來，我國苧麻在種質(zhì)資源創(chuàng)新與鑒定、品種篩選、育種與繁育技術(shù)研究[5-8]以及基于UAV-RGB 遙感系統(tǒng)估算苧麻產(chǎn)量等方面均取得重大進(jìn)展[9-10]，但在苧麻炭疽病病害及其病原菌的研究方面還比較薄弱。 1914 年日本學(xué)者Sawada 在中國臺灣首次對該病菌進(jìn)行分離和形態(tài)學(xué)觀察，并將苧麻炭疽病菌命名為C. boehmeriaeSawada(以寄主來源和其名字命名)[11-12]。 二十世紀(jì)八九十年代，我國苧麻研究專家對苧麻炭疽病的癥狀及各個生育期病害發(fā)生的特點、侵染源、發(fā)生規(guī)律等進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，提出了苧麻炭疽病的防治措施，為苧麻炭疽病害的防治提供了指導(dǎo)[3-4，13-14]。 至今，國內(nèi)外關(guān)于苧麻炭疽病病原菌的研究報道仍較少。 在以往苧麻炭疽病的田間調(diào)查、病害防治、苧麻品種抗性檢測和對苧麻炭疽菌的研究報道中，根據(jù)寄主來源和發(fā)現(xiàn)者命名的“Colletotrichum boehmeriaeSawada”一直作為苧麻炭疽病菌的病原，但其不能說明苧麻炭疽菌真正的病原和分離地位。 準(zhǔn)確鑒定引起苧麻炭疽病的病原菌是研究病菌生物學(xué)特性、發(fā)生規(guī)律和開展病害防治的基礎(chǔ)。

本研究通過采集苧麻炭疽病感病的葉片，采用傳統(tǒng)組織分離法進(jìn)行病原真菌的培養(yǎng)和分離，依據(jù)病菌的形態(tài)學(xué)特征、致病性測定、分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)結(jié)合的方法對引起苧麻炭疽病的病原菌進(jìn)行鑒定，旨在明確引起苧麻炭疽病的病原菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻材料圃、湖北省咸寧市苧麻基地大田、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所苧麻材料圃(湖南長沙)和江西省宜春市農(nóng)科所苧麻材料圃等地，采集癥狀典型的苧麻炭疽病病葉，用于病原菌的分離。

1.2 試驗方法

1.2.1 病菌分離與純化

應(yīng)用常規(guī)植物病原菌的分離法進(jìn)行病菌的分離[15-16]。 在無菌操作臺上，切取病健交界處約2 mm×2 mm 的病組織，先用滅菌水沖洗干凈，再用75%酒精消毒1 min，5%次氯酸鈉消毒3 min，最后用無菌水沖洗3 遍，將消毒好的病組織置于PDA 平板上，28 ℃下暗培養(yǎng)3～4 d。 待菌落長出后，重復(fù)純化2～3 次。 將分離的菌株保存在PDA 平板中，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性檢測

分生孢子液接種:選取新鮮健康的苧麻葉片(華苧4 號)，放入鋪有吸水紙的盤中擺放整齊，吸水紙經(jīng)滅菌水滋潤。 在每個葉片上滴加分生孢子液，每片葉片接10 處，每處接種6 μL(1×106個/mL)，3 個重復(fù)，以清水作為對照組，用保鮮膜封盤并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中12 h 光暗交替培養(yǎng)，連續(xù)觀察10 d，記錄葉片發(fā)病情況。

菌絲塊接種:葉片選取同以上分生孢子液接種。 PDA 平板上活化好的菌落用打孔器(d=6 mm)打取菌絲塊。 將菌絲塊面朝下接種到葉片上，每片葉片接5 ～6 個菌絲塊，3 個重復(fù)，清水作為對照，培養(yǎng)條件和觀察方法同分生孢子液接種。 葉片發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌，比較再分離菌株與接種菌株的一致性，完成柯赫氏法則的驗證。

1.2.3 病原菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:將菌絲塊接種到PDA 平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱里黑暗培養(yǎng)，3 d 后觀察并記錄菌落特征，主要包括菌落顏色、形態(tài)和生長情況。 在顯微鏡下觀察分生孢子、附著胞及孢子梗的形態(tài)，用顯微鏡及標(biāo)尺測量分生孢子的大小，并計算分生孢子的長寬比例，查閱真菌分離鑒定工具書，初步判定病菌的種類。

分子生物學(xué)鑒定:采用CTAB 法提取病原菌DNA，用真菌核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄序列ITS 通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[17]、β-微管蛋白基因(β-tubulin，TUB2)的PCR 擴增引物T1(5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3’)和βt2b (5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’)[18]對目的基因區(qū)域進(jìn)行PCR 擴增。 將PCR 產(chǎn)物純化后進(jìn)行T 載體的連接和大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，并對質(zhì)粒進(jìn)行測序。 將所測得的序列在NCBI 網(wǎng)站(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源性比較，以近緣菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

2 結(jié)果和分析

2.1 苧麻炭疽病的田間癥狀

根據(jù)苧麻炭疽病田間癥狀觀察，從我國3 個省份(湖北、湖南、江西)主要苧麻產(chǎn)區(qū)采集具有苧麻炭疽病癥狀的葉片。 對田間癥狀和采集的葉片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)苧麻炭疽病主要癥狀包括:染病葉片呈現(xiàn)典型的圓形病斑，病斑直徑1～3 mm，病斑邊緣黑色，中央褐色，可擴展，嚴(yán)重的呈中間凹陷壞死癥狀(圖1-A～C)；葉片上具有大量小圓斑癥狀，病斑直徑＜1 mm，病斑中央灰白色，邊沿深褐色，擴展有限(圖1-D)；葉片上具有大量小圓斑癥狀，病斑直徑＜1 mm，可擴展成片(圖1-E)；葉片上具有黑色大斑，直徑＞5 mm，病斑擴展成片(圖1-F)。

圖1 苧麻炭疽病田間葉片癥狀Fig.1 Representative symptoms of ramie anthracnose on leaves in filed

2.2 苧麻炭疽病病原菌致病性測定結(jié)果

本試驗共分離89 個菌株，選取形態(tài)有差異且能在PDA 培養(yǎng)基上直接產(chǎn)生或者切斷菌絲后能誘導(dǎo)產(chǎn)生橘紅色分生孢子的23 個菌株進(jìn)行致病性測定。 先采用分生孢子接種法對菌株的致病性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，菌株大致有強致病性、弱致病性和無致病性3 類(圖2)。 23 個菌株中有14個菌株可以引起“華苧4 號”發(fā)病，其中，強致病性菌株占總測試菌株的61%。 強致病性菌株接種葉片3 d 后，葉片上接種點開始出現(xiàn)病斑，隨著培養(yǎng)時間的延長病斑變大，擴大成片，最后整個葉片退綠，腐爛(圖2-A1～A4)；第二類弱致病性菌株，接種葉片3 d 后出現(xiàn)病斑，隨著培養(yǎng)時間的延長，壞死部位沒有繼續(xù)惡化，10 d 后葉片仍然完好(圖2-B1 ～B4)；第三類菌株接種后葉片沒有受感染，葉片表面未見任何病斑(圖2-C1～C4 )。

圖2 苧麻炭疽病菌分生孢子測定致病性Fig.2 Pathogenicity test of pathogens of ramie anthracnose with conidia

將致病性強的菌株用菌絲片法再次進(jìn)行致病性檢測。 結(jié)果顯示，接種3 d 后接種處開始發(fā)病，初為褐色斑點(圖3-A)，接種7 d 后病斑顏色加深并擴展為圓形，有的病斑連成片導(dǎo)致葉片腐爛(圖3-B)。 從病組織再分離的病原菌與接種用的菌株形態(tài)上一致。

圖3 苧麻炭疽病菌菌絲塊測定致病性Fig.3 Pathogenicity test of pathogens of ramie anthracnose with mycelium

2.3 苧麻炭疽病菌的形態(tài)特征及分類地位

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

苧麻炭疽病菌在PDA 培養(yǎng)基上菌落呈圓形，菌落邊緣整齊。 菌絲匍匐狀，稀疏至茂密，大部分菌株菌絲最初為白色，隨著培養(yǎng)時間的延長慢慢變?yōu)榈疑械氖呛稚?、墨綠色(圖4-A1、B1、C1、D1)。 分生孢子橘紅色，有的點狀分布，有的成片分布，分生孢子單胞，無色透明，卵圓形，有的內(nèi)含油球(圖4-A2、B2、C2、C3、D2)。 有的菌株具黑色或者褐色剛毛，有分隔，頂端尖銳(圖4-D3)。 分生孢子梗簇生或單生，無色或淡褐色，直或彎曲，具分隔，基部略膨大。 菌絲有隔，直徑2.55～3.83 μm，平均3.01 μm。 孢身大小及孢子長寬比例見表1。 查閱真菌鑒定手冊，根據(jù)病菌形態(tài)特征，初步判定苧麻炭疽菌病原為膠孢炭疽菌C. gloeosporioides(膠孢炭疽菌剛毛少，分生孢子圓筒形，(11～18)μm×(4～6)μm)和希金斯炭疽菌C. higginsianum(希金斯炭疽菌分生孢子盤上有剛毛數(shù)根，分生孢子長橢圓或圓筒形，兩端鈍圓，無色，單胞，(15～21)μm×(3.0～5.5)μm)。

圖4 苧麻炭疽病病原菌形態(tài)特征Fig.4 Morphylogy of pathogens of ramie anthracnose

表1 苧麻炭疽菌代表性菌株分生孢子大小測定Table 1 Conidia sizes of pathogens of ramie anthracnose

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

選取具有正常致病力且經(jīng)過柯赫氏法則驗證的14 個菌株進(jìn)行ITS基因克隆和測序，將分離菌株的測序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對。 比對結(jié)果顯示，菌株與膠孢炭疽菌C. gloeosporioides、果生炭疽菌C. fructicol、暹羅炭疽菌C. siamense和希金斯炭疽菌C. higginsianum的同源性達(dá)97%～99%(Accession number:FJ515005、FJ459930、HM016798、AB042317.1、GU935872.1)。 而且序列比對中發(fā)現(xiàn)，C. gloeosporioides、C. fructicola、C. siamense和C. higginsianum這4 類植物炭疽菌病原的ITS序列本身同源性高達(dá)99%，單通過ITS基因無法將菌株鑒定到種。

進(jìn)一步對測試菌株進(jìn)行β-tubulin基因的克隆。 表2 中列舉了菌株的來源和β-tubulin基因在NCBI 上的登錄號。 將分離菌株的β-tubulin基因測序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對，查找相似物種的β-tubulin序列，使用MEGA 7.0 最大似然法對相似性較高的菌株及同屬不同種菌株進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析(圖5)。 結(jié)果顯示，從湖南采集的菌株中鑒定出3 個炭疽菌屬的病菌:C. fructicola、C. siamense和C. gloeosporioides；湖北武漢的材料中包括種C. fructicola和C. gloeosporioides；江西的菌株中，并未分離到C. gloeosporioides，分離的菌株為C. fructicola和C. siamense。 采自湖北咸寧的材料，通過β-tubulin比對，與人參生刺盤孢C. panacicola和希金斯炭疽菌C. higginsianum的同源性都為99%，而這兩個病原菌屬于C. destructivumspecies complex 復(fù)合群，所以分子序列上同源性很高。 真菌鑒定手冊記載希金斯炭疽菌C. higginsianum分生孢子盤上有剛毛數(shù)根，分生孢子圓筒形，(15～21)μm×(3.0～5.5)μm。 本試驗中分離自咸寧的菌株其分子孢子特性(圖4-D1～D3，表1)與C. higginsianum的描述一致，再結(jié)合分子檢測的結(jié)果，判定分離自咸寧的菌株屬于C. higginsianum。

圖5 基于β-tublin 基因序列構(gòu)建的苧麻炭疽菌菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ramie anthracnose strain based on β-tublin genes sequences

表2 基于β-tubulin 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析所用菌株信息Table 2 Informations used for phylogenetic analysis based on β-tubulin genes

3 討論與結(jié)論

苧麻炭疽病由植物炭疽菌屬(Colletothrichcumspp.)真菌引起。 該屬真菌是一類全球性分布的重要植物病原菌，被列為全球第八大植物病原真菌[19]。 目前已報道約176 屬190 余種植物可被炭疽菌侵染[20]。 炭疽菌類真菌命名方式和系統(tǒng)分類方法發(fā)生過數(shù)次重大的變更，存在種間性狀交叉和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不清的問題。 1831—1957 年，其分類依據(jù)主要以寄主范圍為主，即只要從一種尚未報道的寄主上分離獲得該屬真菌，即被視為新種。 該時期至少750 個新種被描述，導(dǎo)致許多物種同物異名。 Von Arx 發(fā)現(xiàn)該屬真菌分類混亂，依據(jù)分生孢子和產(chǎn)孢細(xì)胞等顯微形態(tài)特征，并結(jié)合純培養(yǎng)特征，將750 多個種合并為11 個種[21]。 Sutton 在Von Arx 的分類基礎(chǔ)上，于1962—1992 年，以分生孢子和附著胞形態(tài)特征，結(jié)合純培養(yǎng)物特征和寄主范圍，把該屬擴展到包含部分復(fù)合種的39 個種[22]。 2009—2019 年，Damm 等[23-24]分別對存在爭議的種的混亂問題又進(jìn)行整理。 目前，炭疽菌屬共包括14 個復(fù)合種，其中C. gloeosporioides復(fù)合種包括38 個近似的物種[25]，近年又?jǐn)U展至22 個復(fù)合種[26]。

準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定病害的病原菌是制定病害有效防御策略的基礎(chǔ)。 對病原真菌的鑒定，常以純培養(yǎng)物上產(chǎn)生的分生孢子、附著胞、分生孢子梗和產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)和大小等特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[27]。 對于特征明顯的炭疽菌種采用形態(tài)學(xué)能夠容易被鑒定出來，但是某些近似炭疽菌種卻難以準(zhǔn)確區(qū)分，比如Liu 等[28]認(rèn)為膠孢炭疽菌C. gloeosporioides、暹羅炭疽C. simense和果生炭疽菌C. fruticola等一些近種，其菌落形態(tài)存在細(xì)微差異，單依據(jù)分生孢子形態(tài)和大小很難明顯區(qū)分，并且一些菌株形態(tài)學(xué)特征不夠穩(wěn)定，易受培養(yǎng)條件的影響。 真菌的分子鑒定是從基因水平上反映菌株間遺傳特性，DNA 序列特征不會隨環(huán)境的改變而變化，特異性高，準(zhǔn)確可靠，借助分子手段進(jìn)行輔助鑒定可以彌補形態(tài)學(xué)鑒定的不足[29]。 除病毒以外，所有生物都具有核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS序列)區(qū)段的基因，該序列種間高度保守，可作為研究生物系統(tǒng)進(jìn)化及分類的依據(jù)[30]。 另外基于膠孢炭疽菌C. gloeosporioides復(fù)合種的病原種類多，單選用ITS序列可能無法對小種進(jìn)行有效的區(qū)分。 目前，基于多基因序列分析，將ITS基因、肌動蛋白基因(Actin gene，ACT)[30]和β-微管蛋白基因(β-tubulin，TUB2)[31]、幾丁質(zhì)合成酶A 基因(chitin synthase A gene，CHS1)等[32]序列進(jìn)行聯(lián)合分析用于炭疽菌的分子鑒定，能較好地區(qū)分炭疽菌屬真菌的大部分種。

本研究對采集自我國苧麻主產(chǎn)區(qū)的苧麻炭疽病病株進(jìn)行病原菌的分離，首先通過形態(tài)學(xué)對分離的病菌進(jìn)行分析，初步判定引起苧麻炭疽病病原是刺盤孢菌屬中的膠孢炭疽菌C. gloeosporioides。 通過對ITS序列的克隆發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌C. gloeosporioides、果生炭疽菌C. fructicol、暹羅炭疽菌C. siamense和希金斯炭疽菌C. higginsianum4 類炭疽菌的ITS序列本身有很高的同源，甚至同源性達(dá)99%，單通過ITS基因無法將菌株進(jìn)行鑒定到種。 所以通過本研究可以推斷ITS序列無法對引起苧麻炭疽病的病原菌鑒定到種。 進(jìn)一步通過微管蛋白β-tubulin基因的克隆和肌動蛋白基因(Actin gene，ACT)(結(jié)果未顯示)的克隆多基因聯(lián)合分析，結(jié)果確定引起苧麻炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌C. gloeosporioides[33]、果生炭疽菌C. fructicola、暹羅炭疽菌C. siamense和希金斯炭疽菌C. higginsianum[34]。 微管蛋白β-tubulin基因的克隆和肌動蛋白基因(Actin gene，ACT)可以對苧麻炭疽菌進(jìn)行小種間的鑒定。 依據(jù)新的炭疽菌種的分類方法，膠孢炭疽菌C. gloeosporioides、果生炭疽菌C. fructicola、暹羅炭疽菌C. siamense隸屬于膠孢炭疽菌復(fù)合群C. gloeosporioidescomplex，希金斯炭疽菌C. higginsianum屬于毀滅炭疽菌C. destructivumcomplex 復(fù)合群。

本研究對我國苧麻主產(chǎn)區(qū)湖北省、湖南省和江西省的苧麻炭疽病病原菌進(jìn)行了分離和鑒定，為病菌生物學(xué)特性及其致病基因的研究奠定了基礎(chǔ)。 鑒定出的4 類病原菌在苧麻上引起病害的發(fā)生規(guī)律以及各苧麻生長地區(qū)中優(yōu)勢種群和病菌的致病基因、致病力分化、遺傳多樣性等還需要進(jìn)一步研究和分析。 對病原菌進(jìn)行基因組測序，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行組學(xué)序列分析、基因功能注釋和比較基因組學(xué)分析，是研究植物病原菌間基因變異重組、突變以及插入/缺失、遺傳多樣性、致病力分化機制的有效方法[35]。 全基因組分析已用于柑橘潰瘍病菌、水稻稻瘟病菌、芽孢桿菌、芒果炭疽菌等多種病原菌的基因組分析。 大量病原菌全基因組測序及比較基因組研究文獻(xiàn)和炭疽菌全基因組序列數(shù)據(jù)，將有助于苧麻炭疽菌基因組測序、組裝和功能基因的預(yù)測。