核轉錄因子-κB在慢性間歇低氧大鼠各臟器的表達及其介導的炎癥因子變化

吳格怡 黃心蔚 鄭美喬 劉嘉慧

(廣東醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥學科,湛江,524000)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive Sleep Apnea-hypopnea Syndrome,OSAHS)是臨床常見而又容易忽略的疾病,可引起多臟器損害,可并發(fā)原發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心病、心腦血管意外等全身性疾病,其根本原因為夜間的慢性間歇低氧引起的損害[1-3]。核轉錄因子-κB(NF-κB)是一種核轉錄因子,有觀點認為OSAHS反復發(fā)作的呼吸暫停和低通氣可激活一系列炎癥相關機制,如慢性間歇缺氧條件下NF-κB的活化[4]。NF-κB與OSAHS之間的關系尚不十分明確。本研究觀察核轉錄因子-κB(NF-κB)在正常大鼠及慢性間歇低氧大鼠的表達差異及其信號通路介導的慢性間歇低氧大鼠機體多種炎癥因子變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選擇廣東醫(yī)科大學動物研究實驗中心提供標準SD雄性大鼠30只,體質量(210±20)g,實驗動物合格證號:SYXK(粵)2020-0034。所有大鼠均在正常環(huán)境中以普通飼料及飲用水喂養(yǎng)8周。

1.1.2 藥物 苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液(上海谷研實業(yè)有限公司,GOYK97200),10%水合氯醛(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號:mlsw-2012)。

1.1.3 試劑與儀器 間歇缺氧艙(S1008型,間歇氧濃度控制系統(tǒng),上海玉研科學儀器有限公司),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)血清單核細胞趨化蛋白-1試劑盒(MCP-1,上?；钌锟萍加邢薰?貨號:HBP37057R)、腫瘤壞死因子-α試劑盒(TNF-α,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司,貨號:T6674-10UG,)、白細胞介素-6試劑盒(IL-6,上?；钌锟萍加邢薰?貨號:HBP31372R)、IL-8試劑盒(上海化邦生物科技有限公司,貨號:HBP31375R)、C-反應蛋白試劑盒(CRP,深圳瑞清生物信息科技有限公司,貨號:RQ-P-R0128,),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒((克拉瑪爾)上海譜振生物科技有限公司),TBST洗滌緩沖液(深圳逗點生物技術有限公司,貨號:TBST-510),辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(南京沃博生物科技有限公司,貨號:A21020),超敏ECL化學發(fā)光檢測試劑盒WB顯影液(南京江苑生物科技有限公司,貨號:JY01051)。

1.2 方法

1.2.1 分組與干預方法 按隨機原則分為觀察組大鼠15只,對照組大鼠15只。對照組正常關燈睡眠。觀察組大鼠放養(yǎng)于間歇缺氧艙內,每日9:30—16:30開艙,每日共7h,間歇向艙內循環(huán)充入氮氣制造慢性間歇缺氧,8min為一個循環(huán),使艙內氧濃度維持在8.5%～21%之間,以模擬阻塞性睡眠呼吸暫停呼吸時患者的缺氧狀態(tài)。直視下抽取大鼠腹主動脈血檢測動脈血氣分析指標,直至提示達重度OSAHS表示造模成功。

1.2.2 檢測方法 暴露結束后，于第8周將各組大鼠心臟采血后注射10%水合氯醛麻醉后處死。血液4 ℃靜置、離心，上清液于-80 ℃凍存以備酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP含量。。處死后迅速整取其肺臟、心臟及腦組織，并將取出組織于液氮中冷卻迅速凍存以備蛋白質印跡法(Western Blotting)檢測NF-κB蛋白的表達。

1.2.3 檢測指標與方法 1)ELISA檢測:稀釋標準品后,嚴格按ELISA說明書操作,在樣品孔中加入待檢炎癥因子標本,封板膜封板,4 ℃過夜。取出后室溫2 h,洗板;37 ℃室溫下加入一抗孵育2 h,反復洗滌清除殘留物;37 ℃室溫下加入二抗孵育2 h,再洗滌。避光顯色后終止反應,加入酶標儀中比色,分別計算2組血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP含量。2)Western Blotting檢測:取出凍存的大鼠腦、心、肺組織,解凍后去血去污,液氮冰上研磨至粉末狀。加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液400 μL,于勻漿器中勻漿,冰上孵育30 min后移入離心管,4 ℃離心15 000 r/min,20 min,取上清細胞裂解液用BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣品沸水加熱5 min充分變性蛋白。制好十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠后加入1×上樣緩沖液,蛋白樣品冷卻后加樣進行電泳,電泳電壓100 V,時間為90 min,結束后轉膜,洗滌,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST洗滌緩沖液洗膜3次,加入1∶1 000比例一抗搖床上緩慢4 ℃孵育過夜,TBST洗滌緩沖液洗膜3次;加入1∶1 000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗搖床上緩慢4 ℃孵育過夜,再TBST洗滌緩沖液洗膜3次。ECL化學發(fā)光顯影液顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光,分析NF-κB蛋白的表達。

2 結果

2.1 2組大鼠腦、心、肺組織中NF-κB蛋白的表達 觀察組大鼠腦、心、肺組織中NF-κB蛋白表達均明顯高于對照組(見圖1、圖2、圖3);觀察組腦、心、肺組織NF-κB灰度值比較與蛋白表達相符,均高于對照組(均P<0.01)(見圖4,圖5、圖6);腦、心、肺組織NF-κB蛋白相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)(見表1)。本研究結果顯示,在慢性間歇低氧大鼠器官組織中,NF-κB蛋白均為高表達。

圖1 2組腦組織NF-κB蛋白表

圖2 2組心組織NF-κB蛋白表達

圖3 2組肺組織NF-κB蛋白表達

圖4 2組大鼠腦組織NF-κB蛋白比較

圖5 2組大鼠心組織NF-κB灰度值比較

圖6 2組大鼠肺NF-κB灰度值比較

表1 2組大鼠腦、心、肺組織中NF-κB蛋白相對表達量比較

2.2 2組大鼠動脈血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平比較 觀察組血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平均升高,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),慢性間歇低氧大鼠多種炎癥介質均升高。見表2。

表2 2組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平比較

3 討論

NF-κB是一種核蛋白,在基因轉錄中至關重要。同時,其生物學活性廣泛,主管著免疫和炎癥反應,調控炎癥介質和細胞因子的轉錄。當外界因素刺激時,inhibitor of NF-κB(IκB)磷酸化,原有的NF-κB/I-κB復合體解離,NF-κB游離出來并被轉運至細胞核內,啟動靶基因轉錄,生成相應的mRNA[5]。

MCP-1蛋白由單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞或細支氣管上皮細胞產生,作為單核細胞浸潤的主要因子,MCP-1與NF-κB關系密切,并受NF-κB調控。因此,慢性間歇低氧大鼠體內NF-κB可能是MCP-1增加的主因[6]。糖尿病患者體內可發(fā)現(xiàn)二者均有增高,而抑制了腎臟NF-κB活性后,NF-κB表達減少,MCP-1的產生及巨噬細胞浸潤也可隨之減少,腎臟炎癥狀態(tài)隨之緩解[7]。

慢性間歇低氧大鼠體內的多種炎癥介質、因子包括TNF-α、IL-6、IL-8等均由NF-κB調控、轉錄。在生理狀況下,NF-κB并不表達或表達很少,它與其抑制因子Inhibitor of NF-κB(IκB)結合,為無活性狀態(tài)存在于胞漿中。疾病中任何的物理及化學因素刺激均可導致這種結合的分離,如病毒、細菌內毒素、氧化應激反應以及OSAHS的特征性改變——慢性間歇低氧。在這些變化刺激中,NF-κB與靶基因、增強子或早期炎癥反應基因再結合,TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子大量產生。TNF-α是促炎因子,并且是機體免疫應答的重要因子,過度的應答聚集了大量中性粒細胞,繼續(xù)上調IL-8的表達,IL-8可進一步趨化中性粒細胞,炎癥反應更加嚴重[8]。

慢性間歇低氧大鼠的心肌細胞中NF-κB的表達對心臟炎癥也起著至關重要作用[9],并有可能參與了心臟疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。IL-6是一種糖蛋白,多種淋巴細胞和非淋巴細胞均可產生,其可以調節(jié)CRP的合成,增加心臟心肌黏附分子的表達,同時促進TNF-α釋放[11]。IL-6、CRP、TNF-α和NF-κB共同維持著心臟炎癥平衡,當炎癥介質IL-6、TNF-α增多時,會反饋作用于NF-κB,造成心肌惡性損害[12]。通過抑制NF-κB介導的炎癥反應有可能阻斷炎癥損害惡性循環(huán),減輕心肌損傷程度[13]。

慢性間歇低氧引起的損傷特征是缺血再灌注損傷。反復的缺氧,復灌注是心肌梗死、心力衰竭死亡的主要原因[14]。MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP共同參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展過程,對心肌的缺血再灌注損傷起重要作用[15]。在缺血再灌注早期炎癥細胞即可侵入心肌細胞,并釋放這些炎癥因子,誘導心肌損傷[16-17]。

本研究中,檢測到慢性間歇低氧大鼠腦、心、肺組織的NF-κB表達增強,同時MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP不同程度激活,提示慢性間歇低氧是改變發(fā)生的根源。慢性間歇低氧可使機體氧化應激反應加強[18-19],如果NF-κB被激活,在氧化應激狀態(tài)下,IL-6、TNF-α等因子隨之增加,成為OSAHS患者的炎癥反應基礎[20]。因此,找到適合OSAHS人群,應用同時能阻斷NF-κB過度激活帶來的機體反應的藥物,是我們治療OSAHS疾病的方向。

利益沖突聲明:無。