姜曲海豬ATP2B1基因克隆、生物信息學及組織表達分析

徐盼 趙為民 倪黎綱 張君勝 閆偉 劉家興 陶勇

摘要：克隆姜曲海豬質膜鈣轉運ATP酶1（ATPase Plasma Membrane Ca2+Transporting 1，ATP2B1）基因CDS區(qū)序列，對其進行生物信息學分析，并探究ATP2B1基因在不同日齡姜曲海豬子宮組織的表達水平，以期為研究ATP2B1基因在姜曲海豬繁殖性能方面的作用提供參考依據(jù)，采用RT-PCR技術擴增姜曲海豬子宮ATP2B1基因CDS區(qū)序列，利用生物信息學軟件對其進行分析，利用實時熒光定量PCR檢測ATP2B1基因在1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量。結果顯示，姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)全長3 663 bp，編碼1 220個氨基酸，與野豬同源性最高、親緣關系最近。姜曲海豬ATP2B1蛋白分子質量約為134 737.94 u，原子總數(shù)為19 102個，理論等電點（pI）為5.63，帶正電荷、負電荷的氨基酸數(shù)分別為141、161個。該蛋白最可能位于細胞膜上，為跨膜、非分泌型疏水蛋白質，有159個磷酸化位點和5個N-糖基化位點，無規(guī)則卷曲在預測的二級結構中占比最大。實時熒光定量PCR結果顯示，ATP2B1基因在8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量顯著低于1月齡姜曲海豬子宮組織（P<0.05）。本試驗為探明ATP2B1基因對豬繁殖性狀的影響提供了分子理論依據(jù)。

關鍵詞：姜曲海豬；ATP2B1基因；克??；生物信息學；組織表達

中圖分類號：S828.2；S828.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0150-07

基金項目：國家自然科學基金（編號：31702089）；江蘇高?！扒嗨{工程”；江蘇農牧科技職業(yè)學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：202112806093Y）；江蘇農牧科技職業(yè)學院科技創(chuàng)新團隊項目（編號：NSF2021TC04）。

作者簡介：徐 盼（1988—），男，江蘇南京人，博士，講師，從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：panxu_nj@hotmail.com。

通信作者：陶 勇，男，江蘇揚州人，博士，教授，從事畜禽品種資源保護與遺傳育種的教學及科研工作。E-mail：tyrsm1975@126.com。

近年來，受非洲豬瘟的影響，我國生豬生產(chǎn)無法滿足市場的需求，提高豬的繁殖性能對提高豬肉產(chǎn)量具有重要意義。作為豬最重要的經(jīng)濟性狀之一，繁殖性狀受遺傳、品種、營養(yǎng)、環(huán)境及年齡等因素的影響，其中遺傳是主要的影響因素。因此，對影響豬繁殖性狀的候選基因的挖掘與鑒定成為豬遺傳育種領域的熱點。

姜曲海豬具有耐粗飼、性成熟早、繁殖力高、肉質細嫩、肉味鮮美、皮骨比例較低、早熟易肥等特點，該品種與江蘇省的其他5個品種（二花臉豬、淮豬、梅山豬、米豬、沙烏頭豬）已被列入國家保護計劃。Xu等使用GeneSeek GGP Porcine 80K SNP芯片對來自國家級姜曲海豬保種場的105頭姜曲海豬進行基因分型，通過計算LSBL（locus-specific branch length）值鑒別到包括質膜鈣轉運ATP酶1（ATPase Plasma Membrane Ca2+Transporting 1，ATP2B1）基因在內的9個與姜曲海豬繁殖性狀相關的受選擇的候選基因［1］。

作為P型離子轉運ATP酶家族中的一員，ATP2B1基因與鈉/鈣交換體協(xié)同作用，將細胞內的Ca2+轉運至細胞外，維持靜息狀態(tài)下細胞內Ca2+濃度處于較低水平，對維持細胞內外鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用［2］。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，與低產(chǎn)二花臉母豬相比，高產(chǎn)二花臉母豬的子宮中鈣離子濃度更高［3］。由上述研究發(fā)現(xiàn)，ATP2B1基因可能對豬的繁殖性能有影響。目前，對地方豬ATP2B1基因的研究鮮見報道。本研究以姜曲海豬為研究對象，對子宮組織ATP2B1基因CDS區(qū)序列進行克隆及相關生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR技術檢測不同日齡子宮組織中ATP2B1基因的表達，以期為進一步研究ATP2B1基因在豬繁殖性能方面的作用機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2021年3—6月在江蘇農牧科技職業(yè)學院和江蘇姜曲海豬種業(yè)有限公司進行。

1.2 樣品采集

1月齡和8月齡姜曲海母豬各3頭，由國家級姜曲海豬保種場（江蘇姜曲海豬種業(yè)有限公司）提供，采集其子宮組織放入-80 ℃冰箱中保存。

1.3 主要試劑

UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV反轉錄酶、2×SG Fast qPCR Master Mix （High Rox）定量試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；LA Taq酶購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1.4 基因克隆

使用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA；使用M-MuLV反轉錄酶反轉錄合成cDNA；根據(jù)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站Sus scrofa ATP2B1基因（登陸號：NM_214352.3）的cDNA序列設計克隆引物、定量引物和內參引物（表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；以姜曲海豬子宮組織cDNA為模板進行ATP2B1基因PCR擴增，產(chǎn)物用柱式DNA膠回收試劑盒回收，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，得到姜曲海豬ATP2B1基因的cDNA序列。

1.5 生物信息學分析

利用MegAlign軟件比對姜曲海豬與其他物種ATP2B1基因CDS區(qū)序列的同源性并構建系統(tǒng)進化樹；利用ProtParam分析姜曲海豬ATP2B1蛋白理化性質；利用PSORT預測姜曲海豬ATP2B1蛋白亞細胞定位；利用SignalP 5.0預測姜曲海豬ATP2B1蛋白信號肽；利用TMHMM 2.0預測姜曲海豬ATP2B1蛋白跨膜結構域；利用ProtScale預測姜曲海豬ATP2B1蛋白疏水性；利用NetPhos 3.1預測姜曲海豬ATP2B1蛋白磷酸化位點；利用NetNGlyC 1.0預測姜曲海豬ATP2B1蛋白糖基化位點；利用SOPMA和SWISS-MODEL分別預測姜曲海豬ATP2B1蛋白二級結構和三級結構（表2）。

1.6 姜曲海豬ATP2B1基因子宮組織表達分析

利用實時熒光定量PCR檢測1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中ATP2B1基因的表達量。PCR反應體系20.0 μL：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，cDNA 2.0 μL。PCR反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。每個樣品重復3次，以GAPDH基因為內參，使用2-ΔΔCT法分析結果。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析，結果采用“平均值±標準差”，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 姜曲海豬ATP2B1基因克隆及序列分析

姜曲海豬ATP2B1基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1）顯示，在322、1 182、1 168、1 257、390 bp處分別有單一條帶，與預期相符。測序結果顯示克隆所得的姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)長度為3 663 bp，編碼1 220個氨基酸。由圖2可知，姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)序列與野豬同源性最高（99.9%），與雞同源性最低（83.0%）；由系統(tǒng)進化樹（圖3）可知，姜曲海豬與野豬、牛、綿羊、山羊親緣關系較近，與雞、鴨親緣關系較遠。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 理化性質

姜曲海豬ATP2B1蛋白分子式為C6 009H9 633N1 611O1 805S44，分子質量約為 134 737.94 u，原子總數(shù)為19 102個，理論等電點（pI）為5.63，偏酸性。由表3可知，在組成姜曲海豬ATP2B1蛋白序列的20種氨基酸中，亮氨酸占比最高，為9.2%；色氨酸占比最低，為1.1%；141個氨基酸帶正電荷，161個氨基酸帶負電荷。姜曲海豬ATP2B1蛋白理論半衰期為30 h（哺乳動物網(wǎng)織紅細胞、體外）、>20 h（酵母、體內）、>10 h（大腸桿菌、體內）；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.97，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為95.57，表明該蛋白為脂溶性蛋白且流動性好；平均親水系數(shù)（GRAVY）為 -0.156，推測該蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 亞細胞定位

利用PSORT對姜曲海豬ATP2B1蛋白亞細胞定位進行預測，結果（表4）表明，該蛋白分布于細胞膜、高爾基體、細胞核和內質網(wǎng)（膜），概率分別為0.600、0.400、0.320和0.300。

2.2.3 信號肽和跨膜結構域

利用SignalP 5.0 server預測姜曲海豬ATP2B1蛋白信號肽，結果（圖4）表明，該蛋白無信號肽，說明該蛋白是非分泌蛋白；利用TMHMM預測姜曲海豬ATP2B1蛋白跨膜結構域，由圖5可知，該蛋白為跨膜蛋白，有7個跨膜螺旋區(qū)，分別位于377～399、419～441、855～877、931～950、970～989、1 002～1 024、1 039～1 061 位氨基酸之間。

2.2.4 疏水性

利用Expasy ProtScale對姜曲海豬ATP2B1蛋白進行疏水性預測，結果（圖6）表明，最大分值是3.444，為第390位的亮氨酸（Leu），代表其疏水性最強，最小分值是-3.811，為第308位的賴氨酸（Lys），代表其親水性最強，親水性氨基酸殘基多于疏水性氨基酸殘基。

2.2.5 磷酸化位點和N-糖基化位點

利用NetPhos 3.1和NetNGlyC 1.0分別對姜曲海豬ATP2B1蛋白磷酸化位點和糖基化位點進行預測分析，結果（圖7、圖8）表明，該蛋白有159個磷酸化位點，存在5個N-糖基化位點，分別位于第6、468、543、834、1 201 位氨基酸處。

2.2.6 二級結構和三級結構

利用SOPMA預測姜曲海豬ATP2B1蛋白二級結構，結果（圖9）表明，α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占36.80%、5.74%、39.26%和18.20%。利用SWISS-MODEL構建姜曲海豬ATP2B1蛋白可能的三級結構模型，結果（圖10）表明，全局模型質量估計（global model quality estimation，GMQE）值為0.73，且與模板的相似性為99.34。

2.3 ATP2B1基因在1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量

利用實時熒光定量PCR技術檢測ATP2B1基因在1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量，結果（圖11）表明，ATP2B1基因在8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量顯著低于1月齡姜曲海豬子宮組織（P<0.05）。

3 討論

豬的繁殖性狀主要包括產(chǎn)仔數(shù)、初生體質量、斷奶體質量等，其中產(chǎn)仔數(shù)最為重要。排卵率、受精率、子宮容積、胚胎成活率等是影響產(chǎn)仔數(shù)的主要因素，子宮是胚胎發(fā)育生長的場所，因此子宮對母豬高產(chǎn)意義重大。鈣是哺乳動物骨骼形成、肌肉收縮和胞吐等生理過程中的必要成分，同時，它也是細胞內信號傳遞的第二信使和細胞黏附分子的激活劑［4-7］，在胚胎植入期對滋養(yǎng)外胚層和母體子宮內膜之間的細胞黏附至關重要［8-10］。ATP2B1基因在細胞內鈣動態(tài)平衡中起關鍵作用。

本研究以高繁殖力的姜曲海豬子宮組織為材料，克隆出ATP2B1基因的CDS區(qū)，進行了相關生物信息學分析和組織表達分析。同源性比對結果顯示，姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)序列與野豬、牛、羊等哺乳動物同源性較高，與雞、鴨等非哺乳動物同源性較低；系統(tǒng)進化樹顯示，姜曲海豬與野豬、牛、羊等哺乳動物親緣關系較近，與雞、鴨等非哺乳動物親緣關系較遠，驗證了同源性比對的結果。潘鵬丞等研究發(fā)現(xiàn)，陸川豬與野豬、牛、綿羊同源性較高、親緣關系較近，與原雞同源性較低、親緣關系較遠［11］。這2項研究結果相似，其原因是地方豬與野豬屬于同一個物種，豬和牛、羊均屬于偶蹄目。亞細胞定位顯示姜曲海豬ATP2B1蛋白分布于細胞膜的概率為0.600，且跨膜結構域預測結果顯示該蛋白為跨膜蛋白，有7個跨膜螺旋區(qū)。Yang等通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)ATP2B1基因在子宮內膜上皮層和腺上皮細胞中大量表達［12］；Choi等通過原位雜交分析表明，ATP2B1基因主要定位于子宮內膜腔上皮、腺上皮和基質細胞［13］。由此可推測，ATP2B1基因可能通過調節(jié)子宮內膜鈣離子濃度而在妊娠的建立和維持中發(fā)揮重要作用。

除了在細胞內鈣動態(tài)平衡中起關鍵作用，ATP2B1基因還對血管平滑肌收縮及血壓起重要作用［14］。ATP2B1基因是高血壓的重要候選基因，是第一個在針對高血壓的不同全基因組關聯(lián)分析研究中交叉驗證的基因。Levy等通過全基因組關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)ATP2B1基因多態(tài)與收縮壓、舒張壓和高血壓顯著相關［15］，該結果也在歐洲和亞洲人群中得到驗證［16-20］。子癇是一種妊娠期嚴重的高血壓疾病，是胎兒死亡的重要原因之一。該疾病可能與肥胖、高齡、外部環(huán)境和其他因素有關［21-22］。此外，遺傳性慢性高血壓也可能是該病的重要原因。多項研究表明，ATP2B1基因多態(tài)性與子癇的發(fā)生密切相關［23-24］。Kobayashi等使用Cre-loxP系統(tǒng)培育了血管平滑肌細胞特異性敲除ATP2B1基因小鼠，相比野生型小鼠，ATP2B1基因敲除小鼠的血管平滑肌細胞內鈣離子水平及收縮壓上升［25］。這些結果表明，ATP2B1基因通過改變血管平滑肌細胞的鈣轉運和血管收縮來調節(jié)血壓。此外，ATP2B1基因的2個拷貝丟失會導致胚胎死亡［26］。本研究中ATP2B1基因在8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量顯著低于1月齡姜曲海豬子宮組織，提示ATP2B1基因可能影響姜曲海豬繁殖性狀。

4 結論

本研究以姜曲海豬子宮組織為材料，成功克隆了姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)，長度為3 663 bp，編碼1 220個氨基酸，與野豬同源性最高、親緣關系最近。姜曲海豬ATP2B1蛋白分子質量約為 134 737.94 u，原子總數(shù)為19 102個，理論等電點（pI）為5.63，帶正電荷和負電荷的氨基酸數(shù)分別為141個和161個。該蛋白最可能位于細胞膜上，為跨膜、非分泌型疏水蛋白質，有159個磷酸化位點和5個N-糖基化位點，無規(guī)則卷曲在預測的二級結構中占比最大。ATP2B1基因在8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量顯著低于1月齡姜曲海豬子宮組織，說明該基因可能影響姜曲海豬繁殖性狀。

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