布魯菌Hfq蛋白研究進(jìn)展

董 浩，牛 慧，彭小薇，王曉英，孫 雨，宋曉暉*

(1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600；2.青島市腫瘤醫(yī)院放療二科，山東青島 266042；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

?

布魯菌Hfq蛋白研究進(jìn)展

董 浩1，牛 慧2，彭小薇3，王曉英1，孫 雨1，宋曉暉1*

(1.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600；2.青島市腫瘤醫(yī)院放療二科，山東青島 266042；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

布魯菌病(布病)是一種嚴(yán)重的人獸共患病。作為布病的病原，布魯菌能夠耐受宿主體內(nèi)的各種殺菌機(jī)制并持續(xù)的生存。當(dāng)布魯菌侵入宿主體內(nèi)后，必須適應(yīng)抗體免疫的環(huán)境，而這依賴于布魯菌對(duì)自身基因表達(dá)的巧妙調(diào)控。Hfq蛋白是一個(gè)RNA伴侶分子，對(duì)于介導(dǎo)sRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。在多種細(xì)菌中，對(duì)Hfq蛋白的功能都進(jìn)行了深入的研究，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該蛋白與細(xì)菌基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)菌對(duì)多種應(yīng)激環(huán)境的適應(yīng)能力以及致病菌的毒力均有著密切的關(guān)系。論文對(duì)Hfq蛋白的結(jié)構(gòu)，對(duì)sRNA的調(diào)控功能，特別是布魯菌Hfq蛋白調(diào)控功能的研究現(xiàn)狀及在布病疫苗研發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)的介紹，為布魯菌基因的表達(dá)調(diào)控和布病防控技術(shù)的研究提供參考。

布魯菌；Hfq蛋白；sRNA

Hfq蛋白最早源于大腸埃希菌中鑒定的一個(gè)RNA噬菌體Qβ有效復(fù)制所需要的宿主因子。隨后由于hfq基因缺失后會(huì)引起大腸埃希菌對(duì)紫外線、氧化劑、滲透壓的耐受能力降低，并且生長(zhǎng)速度也減慢，引起了研究者們極大的興趣?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為在細(xì)菌中其作為一個(gè)RNA伴侶分子，可以促進(jìn)RNA的互作從而催化快速且特異的調(diào)控反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，Hfq分子除了作為RNA伴侶分子外還可以與DNA分子形成復(fù)合體，改變DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的力學(xué)特性從而使DNA分子固縮。

1 Hfq蛋白

在真核生物、細(xì)菌和古生菌中，Hfq蛋白均屬于保守的RNA結(jié)合Lsm(like-Sm)/Sm樣蛋白家族成員[1]，其含有一個(gè)保守的Sm1基序，能夠形成環(huán)形的結(jié)構(gòu)，可以特異性的結(jié)合RNA。Hfq蛋白在溶液狀態(tài)下可以形成同源五聚體或者同源六聚體結(jié)構(gòu)，能夠優(yōu)先與富集A/U的RNA結(jié)合[2]。Hfq 能夠通過(guò)環(huán)的不同結(jié)合表面(近端、遠(yuǎn)端和圓周)與sRNA、靶蛋白轉(zhuǎn)錄單元相互作用，從而能夠幫助sRNA與靶點(diǎn)配對(duì)。在環(huán)的近端主要結(jié)合sRNA和mRNA 富集A/U的區(qū)域，而在遠(yuǎn)端處結(jié)合RNA的polyA尾[3]。

隨著越來(lái)越多的細(xì)菌sRNA被發(fā)現(xiàn)，Hfq蛋白在sRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控中起到重要的作用正逐步被揭開(kāi)[2]。在細(xì)菌sRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中，Hfq蛋白所發(fā)揮的功能可以歸納為以下4個(gè)方面：①Hfq蛋白可以保護(hù)sRNA免受核糖核酸酶的剪切；②通過(guò)與sRNA、mRNA結(jié)合增加sRNA的局部濃度，促進(jìn)sRNA與它們靶mRNA之間的配對(duì)；③Hfq蛋白調(diào)節(jié)細(xì)菌重要的mRNA衰減酶(poly(A)聚合酶，多核苷酸磷酸酶以及核糖核酸酶E24-26)的活性；④Hfq蛋白可以使RNA的3′末端易于多聚腺苷酸化，使得RNA被外切核苷酸的降解從而促進(jìn)RNA的周轉(zhuǎn)[4]。

由于Hfq蛋白是sRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的中心元件，缺失了hfq基因常常導(dǎo)致多種表型以及毒力顯著降低。研究結(jié)果表明hfq基因缺失后會(huì)引起多種致病菌(牛種布魯菌、沙門(mén)菌、霍亂弧菌、弗朗西斯土拉桿菌[5]、嗜血桿菌[6]、腦膜炎奈瑟菌、阪崎腸桿菌[7]、銅綠假單胞菌、根癌農(nóng)桿菌[8]、腸道病原性大腸埃希菌[9]、鼠疫耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[10]、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、福氏志賀菌[11]、痢疾志賀菌、嗜肺軍團(tuán)菌等)在細(xì)胞、小鼠以及特定的感染模型中毒力降低[12]。

2 布魯菌Hfq蛋白研究進(jìn)展

1999年，Robertson G T等[13]發(fā)現(xiàn)了在流產(chǎn)布魯菌中hfq基因缺失后會(huì)引起缺失株對(duì)于強(qiáng)氧化環(huán)境(H2O2)、酸性環(huán)境(pH 4.0)、營(yíng)養(yǎng)缺陷環(huán)境的耐受能力降低。崔明全等還發(fā)現(xiàn)羊種布魯菌16M的hfq基因缺失株和親本菌株相比對(duì)髙滲透壓環(huán)境(1.5mol/L NaCl)、高溫(50℃)、多黏菌素B的敏感性都增加[14]。除此之外，和親本菌株相比，hfq基因缺失株在巨噬細(xì)胞和小鼠感染模型中的生存和增殖能力均顯著降低。2002年Roop R M 等[15]揭示了羊種布魯菌16M的hfq基因缺失株與野生株相比對(duì)懷孕羊毒力顯著下降。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，布魯菌Hfq蛋白在布魯菌毒力中所發(fā)揮的重要作用逐步被揭開(kāi)。2011年Caswell C C等[16]指出在牛種布魯菌2308中，布魯菌的重要毒力因子Ⅳ型分泌系統(tǒng)(由virB操縱子編碼)的表達(dá)受到Hfq的影響。在hfq基因缺失株中，virB操縱子的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均降低。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Hfq可能是通過(guò)依賴于BabR(布魯菌群體感應(yīng)調(diào)控子，也稱(chēng)BlxR)和不依賴于BabR兩種不同的途徑對(duì)virB操縱子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。此前的研究還發(fā)現(xiàn)牛種布魯菌2308hfq基因缺失株中許多布魯菌的毒力基因表達(dá)水平異常，包括編碼周質(zhì)超氧化物歧化酶的sodC基因[17]、編碼酸性環(huán)境耐受相關(guān)蛋白的hdeA基因以及編碼LuxR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的babR基因[18]。

2013年，崔明全等采用基因芯片的方法對(duì)羊種布魯菌16M和hfq基因缺失株在酸性基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了研究，表明在該培養(yǎng)條件下羊種布魯菌16M中Hfq蛋白直接或間接影響著多達(dá)359個(gè)基因(約占布魯菌總基因數(shù)目的11%)的表達(dá)，和親本菌株相比，在hfq基因缺失株中194個(gè)基因的表達(dá)水平下降，而165個(gè)基因的表達(dá)水平升高。對(duì)差異表達(dá)基因的KEGG聚類(lèi)顯示多達(dá)104個(gè)基因是功能未知或者不參與到功能聚類(lèi)中的，而在有功能注釋的基因中，大部分與蛋白質(zhì)和酶類(lèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、代謝途徑密切相關(guān)。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)相同培養(yǎng)條件下hfq基因缺失株和親本菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明在羊種布魯菌16M的hfq基因缺失株中，有55個(gè)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生改變，包括18個(gè)表達(dá)水平上調(diào)的蛋白和37個(gè)表達(dá)水平下調(diào)的蛋白。通過(guò)對(duì)這些蛋白功能的分析表明有36個(gè)蛋白與轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)，這一結(jié)果也與基因芯片的結(jié)果相吻合[14]。以上研究表明布魯菌的Hfq蛋白的主要功能是影響細(xì)菌的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等相關(guān)的生物途徑。

作為一個(gè)RNA伴侶分子，Hfq的功能主要是通過(guò)介導(dǎo)sRNA與其靶點(diǎn)mRNA之間的相互作用來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。2012年Caswell C C等[19]發(fā)現(xiàn)在牛種布魯菌2308中發(fā)現(xiàn)Hfq蛋白可以直接結(jié)合2個(gè)與布魯菌毒力相關(guān)的sRNA(AbcR1和AbcR2)，而且當(dāng)hfq基因缺失后，這兩個(gè)sRNA無(wú)法表達(dá)。此外，Wang Y等[20]在2015年也發(fā)現(xiàn)在羊種布魯菌中有3個(gè)sRNA在hfq基因缺失株中轉(zhuǎn)錄水平顯著減少，這意味著布魯菌Hfq蛋白對(duì)于sRNA的轉(zhuǎn)錄或者穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用。

3 布魯菌Hfq的應(yīng)用

布魯菌病作為一種全球流行的人獸共患病對(duì)于畜牧業(yè)發(fā)展以及人類(lèi)的公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重的威脅。對(duì)家畜進(jìn)行疫苗免疫是在布病高發(fā)地區(qū)控制該病流行的一種重要措施[21]。目前在國(guó)內(nèi)外使用的各種活疫苗中存在著毒力偏強(qiáng)、無(wú)法免疫懷孕動(dòng)物、免疫持續(xù)期短、無(wú)法鑒別自然感染與疫苗免疫等多種問(wèn)題。2013年石河子大學(xué)的張俊波等發(fā)現(xiàn)使用羊種布魯菌16M的hfq基因缺失株免疫Balb/c小鼠后進(jìn)行同源攻毒可以產(chǎn)生與現(xiàn)有的M5-90和Rev.1疫苗株類(lèi)似的保護(hù)力。與此同時(shí)，由于Hfq蛋白具有良好的免疫原性，可以通過(guò)檢測(cè)血清中Hfq蛋白的抗體來(lái)區(qū)分hfq基因缺失疫苗免疫和野生株感染[22]。

研究表明在大腸埃希菌和沙門(mén)菌中約有一半的sRNA與Hfq蛋白密切相關(guān)。在大腸埃希菌中已經(jīng)有研究通過(guò)將Hfq蛋白的多克隆抗體與大腸埃希菌胞內(nèi)提取物共同孵育，通過(guò)免疫共沉淀成功富集了約1/3已經(jīng)的sRNA[23]。因此，在布魯菌中同樣可以制備Hfq蛋白的抗體通過(guò)免疫共沉淀的方法鑒定與Hfq蛋白結(jié)合的sRNA。

4 展望

布魯菌的Hfq蛋白對(duì)于調(diào)控Ⅳ型分泌系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)、耐受應(yīng)激環(huán)境相關(guān)蛋白、sRNA的正常表達(dá)，而這些分子與布魯菌的毒力密切相關(guān)，因此對(duì)布魯菌Hfq蛋白功能的研究對(duì)于揭示布魯菌的致病機(jī)制以及sRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有著重要的意義。此外，由于hfq基因缺失株具有毒力弱、能夠鑒別自然感染與疫苗免疫等方面的優(yōu)勢(shì)，其在開(kāi)發(fā)新型布病疫苗方面具有光明的前景。

[1] De Lay N,Schu D J,Gottesman S.Bacterial small RNA-based negative regulation: Hfq and its accomplices[J].J Biol Chem,2013,288(12):7996-8003.

[2] M?ller T,Franch T,H?jrup P,et al.Hfq:a bacterial Sm-like protein that mediates RNA-RNA interaction[J].Mol Cell,2002,9(1):23-30.

[3] Brennan R G,Link T M.Hfq structure,function and ligand binding[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(2):125-133.

[4] Vogel J,Luisi B F.Hfq and its constellation of RNA[J].Nat Rev Microbiol,2011,9(8):578-589.

[5] Lenco J,Tambor V,Link M,et al.Changes in proteome of the Delta hfq strain derived fromFrancisellatularensisLVS correspond with its attenuated phenotype[J].Proteomics,2014,14(21-22):2400-2409.

[6] Gangaiah D,Labandeira-Rey M,Zhang X,et al.Haemophilus ducreyi Hfq contributes to virulence gene regulation as cells enter stationary phase[J].Mbio,2014,5(1):e1081-1013.

[7] Kim S,Hwang H,Kim K P,et al.Hfq plays important roles in virulence and stress adaptation inCronobactersakazakiiATCC 29544[J].Infect Immun,2015,83(5):2089-2098.

[8] Moller P,Overloper A,Forstner K U,et al.Profound impact of Hfq on nutrient acquisition,metabolism and motility in the plant pathogenAgrobacteriumtumefaciens[J].PLoS One,2014,9(10):e110427.

[9] Vogt S L,Raivio T L.Hfq reduces envelope stress by controlling expression of envelope-localized proteins and protein complexes in enteropathogenicEscherichiacoli[J].Mol Microbiol,2014,92(4):681-697.

[10] Kakoschke T,Kakoschke S,Magistro G,et al.The RNA chaperone Hfq impacts growth,metabolism and production of virulence factors inYersiniaenterocolitica[J].PLoS One,2014,9(1):e86113.

[11] 劉翠翠，魏小娟，張繼瑜，等.志賀菌調(diào)控小RNA研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014,35(7):86-89.

[12] Chao Y,Vogel J.The role of Hfq in bacterial pathogens[J].Curr Opin Microbiol,2010,13(1):24-33.

[13] Robertson G T,Roop R M Jr.TheBrucellaabortushost factor I (HF-I) protein contributes to stress resistance during stationary phase and is a major determinant of virulence in mice[J].Mol Microbiol,1999,34(4):690-700.

[14] Cui M,Wang T,Xu J,et al.Impact of Hfq on global gene expression and intracellular survival inBrucellamelitensis[J].PLoS One,2013,8(8):e71933.

[15] Roop R M,Robertson G T,Ferguson G P,et al.Seeking a niche: putative contributions of the hfq and bacA gene products to the successful adaptation of the brucellae to their intracellular home[J].Vet Microbiol,2002,90(1-4):349-363.

[16] Caswell C C,Gaines J M,Roop R M.The RNA chaperone Hfq independently coordinates expression of the VirB type IV secretion system and the LuxR-type regulator BabR inBrucellaabortus2308[J].J Bacteriol,2012,194(1):3-14.

[17] Gee J M,Valderas M W,Kovach M E,et al.TheBrucellaabortusCu/Zn superoxide dismutase is required for optimal resistance to oxidative killing by murine macrophages and wild-type virulence in experimentally infected mice[J].Infect Immun,2005,73(5):2873-2880.

[18] Valderas M W,Alcantara R B,Baumgartner J E,et al.Role of HdeA in acid resistance and virulence inBrucellaabortus2308[J].Vet Microbiol,2005,107(3-4):307-312.

[19] Caswell C C,Gaines J M,Ciborowski P,et al.Identification of two small regulatory RNAs linked to virulence inBrucellaabortus2308[J].Mol Microbiol,2012,85(2):345-360.

[20] Wang Y,Ke Y,Xu J,et al.Identification of a novel small non-coding RNA modulating the intracellular survival ofBrucellamelitensis[J].Front Microbiol,2015(6):164.

[21] 付湘云，馬小菁，易新萍，等.羊用布魯菌疫苗研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015,36(5):91-94.

[22] Zhang J,Guo F,Chen C,et al.Brucellamelitensis16MΔhfq attenuation confers protection against wild-type challenge in BALB/c mice[J].Microbiol Immunol,2013,57(7):502-510.

[23] Sharma C M,Vogel J.Experimental approaches for the discovery and characterization of regulatory small RNA[J].Curr Opin Microbiol,2009,12(5):536-546.

Progress on Hfq Protein in Brucella spp.

DONG Hao1,NIU Hui2,PENG Xiao-wei3,WANG Xiao-ying1,SUN Yu1,SONG Xiao-hui1

(1.ChinaAnimalDiseaseControlCenter，Beijing，102600，China；2.NO.2RadiologyDepartment,QingdaoCancerHospital，Qingdao，Shandong,266042，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgricultureUniversity，Beijing，100193，China)

Brucellosis is a serious zoonosis.As the pathogen of brucellosis,Brucellaspp.could resist various bactericidal mechanisms and persist for a long time in the host cells.After invading the host cells,Brucellastrains need to adapt to the harsh intracellular environment by fine-tuning of their gene expression.Hfq protein is a RNA chaperone protein,which plays an important role in the sRNA mediated post-transcription regulation.In many bacteria,various studies have been performed about Hfq protein.At present,this protein has been found to be involved in bacterial gene expression,stress responses,and bacterial virulence.This paper summarized the structure of Hfq protein,its functions of regulating sRNA,and focused on the developments inBrucellaHfq protein.This paper provided valuable materials for studies ofBrucellagene expression and technology of brucellosis prevention and control.

Brucella; Hfq protein; sRNA

2015-06-07

董 浩(1985-)，男，山東威海人，獸醫(yī)師，博士，主要從事人畜共患病防控技術(shù)研究。*通訊作者

S852.614

A

1007-5038(2016)01-0093-03