CXCL4、MMP-9、miR-24 對急性腦梗死早期神經(jīng)功能惡化的預測價值

彭國斌 何健萍

周口市第一人民醫(yī)院（周口 466700）

近年來，我國急性心腦血管事件發(fā)生率逐年上升，急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）在心腦事件中屬于常見疾病，占腦卒中的70%左右，其發(fā)生主要是指腦供血中斷，致使腦組織出現(xiàn)死亡，致患者殘疾及死亡率均較高。雖然對于ACI治療藥物應用較為廣泛，預后情況得到明顯改善，但部分患者仍在治療過程中出現(xiàn)早期神經(jīng)功能惡化（early neurological deterioration，END），在發(fā)病后數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)，病情出現(xiàn)進行性加重，其發(fā)生率占總患者的5%～40%左右，導致患者死亡率直線上升［1-2］。有研究顯示［3］?；颊哳A后不良與EDN發(fā)生具有聯(lián)系，因此對ACI后早期EDN預測具有重要價值。CXC趨化因子配體4（CXC chemokine ligand 4，CXCL4）屬于趨化因子CXCL成員，其表達與多種心腦血管疾病具有聯(lián)系［4］。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）可破壞血管基底膜，對血-腦脊液屏障結構及功能產(chǎn)生影響。miR對機體多種生理病理反應可進行調(diào)控，微小RNA-24（miR-24）可通過對蛋白質編碼進行調(diào)控，參與機體多種疾病的發(fā)生進展［5］。目前，關于CXCL4、MMP-9、miR-24對ACI早期發(fā)生END的預測價值的相關報道較少?；谏鲜鲅芯勘尘?，本研究探討CXCL4、MMP-9、miR-24對ACI早期發(fā)生END的預測價值，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

分別選擇2020年1月—2021年6月我院收治的30例ACI早期END患者（ACI+END組），30例ACI患者（ACI組），同期30例健康人群作為對照組。納入標準：急性腦梗死患者均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南 2018》［6］中相關標準；發(fā)病時間＜3 d，精神狀態(tài)正常、免疫功能正常。排除標準：患有惡性腫瘤，感染性疾病，入院前接受過抗凝治療，全身重要器官功能性障礙，腦出血。本研究患者均知情，自愿參與，經(jīng)我院倫理會批件號通過。

END評估標準：入院3 d內(nèi)，美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分（National Institutes of Health Neurological Deficit Score，NHISS）［7］上升2分及以上，出現(xiàn)新的功能缺損。輕度指評分≤16，中度指評分＞16。

1.2 臨床資料收集

收集受試者一般資料［年齡、性別、體質量指數(shù)（body mass indax，BMI）］、病史（糖尿病、高血壓病史、冠心病、高脂血癥、房顫、腦卒中等）、顱內(nèi)動脈狹窄、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、吸煙史、飲酒史、NHISS評分、實驗室指標［總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（total triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high desity cholesterol，高密度脂蛋白膽固醇）、低密度脂蛋白（low desity cholesterol，低密度脂蛋白膽固醇）、空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、超敏C反應蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）］。

1.3 指標檢測

所有受試者采集靜脈血5～10 mL，采集條件為清晨空腹狀態(tài)下，進行離心分離血清，離心條件（3 000 r/min，時間10 min，半徑5 cm），置于低溫冰箱保存。CXCL4檢測方式采用乳膠增強免疫比濁法。MMP-9檢測方式采用酶聯(lián)免疫吸附試驗。miR-24檢測采用RT-PCR，將標本與TRIzol試劑進行混合、裂解，提取總RNA，引物片段進行擴增，內(nèi)參基因為U6，進行反轉錄，反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。獲取cDNA標本，儲存條件為-20 ℃冰箱內(nèi)，PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min，1個循環(huán)；95℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共進行40個循環(huán)，均進行3次試驗，采取平均值，測Ct值。引物序列：miR-24：正向5'-TGTTCCTGCTGAACTGAGCC-3'，反向5'-CTCTGCCTCCCGTGCCTA-3'；U6：正向5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向5'-CAGGGCCATGCTAATCTT-3'。計算方式選取2-△△Ct法進行。

1.4 統(tǒng)計學處理

SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，應用Kolmogorov-Smirnov檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）描述，多組間比較采用F檢驗，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布，經(jīng)自然對數(shù)轉換后采用M（Qn）表示采用非參數(shù)檢驗。以率（%）表示計數(shù)資料采用χ2檢驗。CXCL4、MMP-9、miR-24之間相關性采用Pearson分析，采用受試者工作特征（receiver operator characteristics，ROC）曲線分析CXCL4、MMP-9、miR-24急性腦梗死早期神經(jīng)功能惡化的預測價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基線資料

3組受試者男性比例、年齡、BMI、比較均無差異（P＞0.05），具有可比性。ACI+END組、ACI組患者白細胞計數(shù)、TC、LDL-C、hs-CRP、Fg高于對照組（P＜0.05）。與DM組比較，ACI+END組患者合并糖尿病、吸煙史、NHISS評分、白細胞計數(shù)、TC、LDL-C、hs-CRP、Fg水平更高，比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），2組性別、年齡、BMI、高血壓病史、高血脂、腦卒中、冠心病、房顫、中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、PFG、顱內(nèi)動脈狹窄、TG、HDL-C、飲酒史比較均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表1。

表1 基線資料 ［n=30，n（%），±s ］

表1 基線資料 ［n=30，n（%），±s ］

注：與對照組比較 aP＜0.05，與ACI組比較 bP＜0.05

項目 ACI+END 組 ACI 組 對照組 F/t/ χ2 P男性 21（70.00） 18（60.00） 19（63.33） 0.439 0.626平均年齡/歲 60.32±7.71 60.06±6.18 60.99±7.52 0.590 0.463 BMI/（kg/m2） 25.24±2.01 25.50±1.85 25.16±1.37 0.337 0.715高血壓病史 17（56.67） 16（53.33） / 0.067 0.795糖尿病病史 19（63.33） 8（26.67） / 8.148 0.004高血脂 12（40.00） 10（33.33） / 0.287 0.592腦卒中 14（46.67） 15（50.00） / 0.067 0.796冠心病 6（20.00） 5（16.67） / 0.111 0.099房顫 12（40.00） 13（43.33） /白細胞計數(shù)/（×109/L） 9.65±1.21ab 6.21±1.02a 2.21±0.74 49.770 0.001中性粒細胞計數(shù)/（×109/L） 4.74±0.32 4.51±0.36 4.32±0.33 8.669 0.001淋巴細胞計數(shù)/（×109/L） 1.99±0.32 2.01±0.36 2.13±0.30 3.029 0.031 FPG/（mmol/L） 4.01±0.12 4.16±0.15 4.12±0.23 4.023 0.006顱內(nèi)動脈狹窄 13（43.33） 11（36.67） / 0.069 0.123 TC/（mmol/L） 5.09±0.36ab 4.54±0.41a 3.23±0.51 28.260 0.001 TG/（mmol/L） 1.19±0.21 1.16±0.20 1.13±0.31 1.520 0.209 HDL-C/（mmol/L） 1.12±0.25 1.10±0.29 1.16±0.32 0.935 0.357 LDL-C/（mmol/L） 3.36±0.56ab 2.29±0.15a 1.35±0.09 33.615 0.001吸煙史 19（63.33） 8（26.67） / 8.148 0.004飲酒史 12（40.00） 14（46.67） / 0.271 0.602 hs-CRP/（mg/L） 4.84±0.45ab 1.57±0.38a 0.54±0.11 88.065 0.001 NHISS/分 11.68±2.42b 6.53±1.41 / 11.630 0.001 Fg/（g/L） 3.32±0.51a 3.30±0.58a 1.54±0.31 28.290 0.001

2.2 CXCL4、MMP-9、miR-24表達比較

CXCL4、MMP-9水平在對照組、ACI組、ACI+END組中依次升高，miR-24相對表達量依次降低，各組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同分組CXCL4、MMP-9、miR-24表達差異 （±s ）

表2 不同分組CXCL4、MMP-9、miR-24表達差異 （±s ）

注：與對照組比較 aP＜0.05，與ACI組比較 bP＜0.05

組別 n CXCL4（ng/mL） MMP-9（μg/L） miR-24對照組 30 5.22±1.35 403.83±23.25 3.26±0.11 ACI 組 30 11.12±2.65a 854.62±36.31a 1.62±0.57a ACI+END 組 30 16.56±3.62ab 1021.64±44.49ab 1.06±0.19ab F 24.450 103.83 84.960 P 0.001 0.001 0.001

2.3 不同神經(jīng)功能缺損程度CXCL4、MMP-9、miR-24表達比較

血清CXCL4、MMP-9、miR-24表達在輕度、重度患者中呈升高趨勢，miR-24相對表達呈降低趨勢，各組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同神經(jīng)功能缺損程度CXCL4、MMP-9、miR-24表達差異 （±s ）

表3 不同神經(jīng)功能缺損程度CXCL4、MMP-9、miR-24表達差異 （±s ）

組別 n CXCL4（ng/mL） MMP-9（μg/L） miR-24輕度 17 14.22±1.37 995.83±31.26 1.46±0.14重度 13 17.86±3.52 1121.64±47.89 1.01±0.12 t 3.911 7.646 9.267 P 0.001 0.001 0.001

2.4 ACI患者發(fā)生END的因素分析

以ACI患者是否發(fā)生END為因變量（0=否，1=是），吸煙史、糖尿病史、NHISS評分、白細胞計數(shù)、TC、LDL-C、hs-CRP、Fg、CXCL4、MMP-9、miR-24為自變量，建立Logistic回歸模型，并校正年齡、性別等混雜因素影響，最終LDL-C、TC、NHISS評分、CXCL4、hs-CRP、MMP-9、miR-24是ACI患者并發(fā)END的危險因素，見表4。

表4 ACI患者發(fā)生END的Logistic回歸分析

2.5 CXCL4、MMP-9、miR-24之間相關性分析

經(jīng)過Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，CXCL4與MMP-9之間呈正相關（r=0.584，P=0.001）；CXCL4、miR-24之間呈負相關（r=-0.569，P=0.001）；MMP-9、miR-24之間呈負相關（r=-0.567，P=0.001），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 CXCL4、MMP-9、miR-24 之間相關性分析

2.6 血清CXCL4、MMP-9、miR-24對急性腦梗死早期神經(jīng)功能惡化的預測價值

ROC曲線顯示，與CXCL4、MMP-9、miR-24單項預測相比，三項聯(lián)合檢測對急性腦梗死早期神經(jīng)功能惡化的預測價值較高（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 血清CXCL4、MMP-9、miR-24 對急性腦梗死早期神經(jīng)功能惡化的預測價值

表5 血清CXCL4、MMP-9、miR-24診斷急性腦梗死早期神經(jīng)功能惡化的效能分析

3 討 論

保證ACI患者預后情況，需對END的發(fā)生進行早期判斷，盡早進行干預，可有效阻止不良腦血管惡性事件的發(fā)生。血清指標在多種疾病的診斷、預測中具有重要價值，準確性較為理想，方便快捷。隨著對ACI發(fā)病機制不斷進行研究實驗，炎癥反應在ACI后神經(jīng)損傷有著較為重要的影響，可促進腦損傷的進展，可能發(fā)展為END［8-9］。

趨化因子可對不同種類的細胞進行趨化效應，在機體多種生理病理過程中發(fā)揮作用，可作為動脈粥樣硬化斑塊形成的介質，CXCL4所屬CXC亞家族，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生及發(fā)展中扮演重要角色，CXCL4可隨著血小板活化，釋放進入血液［10］。有學者研究顯示［11］，CXCL4在動脈粥樣硬化早期形成已沉積，其表達水平與其病變程度具有顯著關聯(lián)，在ACI發(fā)病進程中具有一定價值。MMP-9屬于金屬依賴性蛋白酶，由于ACI致使機體炎癥反應加劇，促進MMP-9大量形成，患者血清中MMP-9水平呈現(xiàn)異常升高的趨勢，加重疾病進展，破壞屏障的完整性，出現(xiàn)神經(jīng)功能損害［12-13］。miR可對mRNA降解進行加強，對編碼RNA翻譯進行抑制，調(diào)控基因相對表達量，與器官組織發(fā)育關系密切［14］。有研究顯示［15］，腦灌注缺血再灌注模型大鼠miR-24表達呈現(xiàn)異常升高的趨勢，miR-24可通過對一氧化氮合酶等指標進行調(diào)控，減小梗死面積。miR-24可以對低氧致神經(jīng)細胞凋亡進行抑制，若細胞凋亡不充足，有可能會出現(xiàn)腦梗死等疾病，需避免缺血、缺氧，減輕神經(jīng)細胞凋亡。

本研究結果顯示，CXCL4、MMP-9水平在對照組、ACI組、ACI+END組中依次升高，miR-24相對表達量依次降低，且CXCL4、MMP-9、miR-24表達在神經(jīng)功能惡化程度輕度、重度患者中呈升高趨勢，miR-24相對表達呈降低趨勢。Logistic回歸分析得出，血清CXCL4、MMP-9、miR-24異常表達是ACI患者并發(fā)END的危險因素，上述研究結果得出，CXCL4、MMP-9表達與患者病程嚴重程度呈正相關，miR-24表達呈負相關，共同參與參與ACI的發(fā)生發(fā)展，其原因可能是CXCL4在動脈粥樣硬化中發(fā)揮促進作用，通過cAMP/PKAI信號傳導途徑及多種信號通路，影響動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定度，可能會出現(xiàn)斑塊破裂的情況，使得ACI病情加重，神經(jīng)功能出現(xiàn)損傷，誘發(fā)END的出現(xiàn)［16-17］。另外，NHISS評分升高及hs-CRP表達異常也是造成ACI后END的相關因素，與以往學者研究結果一致。因此ACI組患者CXCL4、MMP-9表達的升高及miR-24的表達反映了神經(jīng)缺損嚴重程度，具有較高的預測價值。相關性分析顯示，CXCL4與MMP-9之間呈正相關（r=0.584，P=0.001）；CXCL4、miR-24之間呈負相關（r=-0.569，P=0.001）；MMP-9、miR-24之間呈負相關（r=-0.567，P=0.001）。進一步實施R O C 曲線分析，結果顯示，與CXCL4、MMP-9、miR-24單項預測相比，三項聯(lián)合對ACI的關系及對患者發(fā)生的早期END的預測價值較高，三項聯(lián)合診斷的AUC為0.800，說明聯(lián)合監(jiān)測CXCL4、MMP-9、miR-24表達對預測早期END的發(fā)生有較好臨床價值，對及時干預治療和改善預后具有正面影響［18］。

綜上可知，CXCL4、MMP-9、miR-24在ACI患者發(fā)生早期END中表達出現(xiàn)異常變化，三者之間具有一定的相關性，檢測CXCL4、MMP-9、miR-24水平對ACI早期END具有一定預測價值，盡早制定相關措施干預，降低不良預后的發(fā)生概率。