MiR-103a通過TAK1介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路保護(hù)炎癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的研究

李璐斐，金培印，王磊

心血管疾病是目前引起人類疾病死亡第二多的疾病，包括心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、心律失常以及高脂血癥等，而這些心血管疾病通常伴隨心肌炎癥[1,2]。心肌細(xì)胞長(zhǎng)期處于這種炎癥環(huán)境下，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，最終引起心肌細(xì)胞凋亡；心肌細(xì)胞凋亡不僅會(huì)直接影響正常的心臟功能，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致患者死亡，而炎癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡主要受細(xì)胞內(nèi)的基因調(diào)控[1,2]。因此，探究炎癥環(huán)境下心肌細(xì)胞的凋亡機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療心血管疾病具有重要意義。

微小RNA（miRNA）是一段長(zhǎng)為22個(gè)核苷酸左右的非編碼小RNA，它們雖然不能直接編碼蛋白質(zhì)，但可通過對(duì)與編碼蛋白的基因序列3'端非編碼區(qū)結(jié)合而影響其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)特征[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過對(duì)其靶基因的調(diào)控而參與惡性腫瘤[4]、心肌缺血再灌注損傷[5]以及腦缺血損傷[6]等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在急性心肌梗死患者外周血表達(dá)異常，包括miR-150[7]和miR-124-3p[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)[9]，miR-103a在敗血癥患者外周血中表達(dá)降低，并可通過抑制HMGB1的表達(dá)而抑制外周血單核細(xì)胞炎癥。此外之前有研究表明[10]，miRNA-103a通過抑制Atg5而抑制心肌細(xì)胞自噬和凋亡。然而，miR-103a的表達(dá)對(duì)炎癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究在體外通過腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷建立炎癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷體外模型，通過過表達(dá)miR-103a來研究miR-103a表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其調(diào)控分子機(jī)制，為開發(fā)靶向miR-103a治療心血管疾病提高理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料H9C2心肌細(xì)胞購(gòu)買自武漢普諾賽生命科技有限公司；RIPA裂解液、Steady-Lumi? Ⅱ螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、caspase 3、caspase 8及caspase 9活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)買自上海碧云天生物科技有限公司；PrimeScript? RT reagent kit和qPCR Master Mix購(gòu)買自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Lipofectamine 2000、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、miR-nc和miR-103a-mimic（miR-103a）購(gòu)買自賽默飛世爾科技有限公司；PCR引物、si-nc和si-TAK1由生工生物工程（上海）股份有限公司官方設(shè)計(jì)合成；TAK1抗體、NF-κB抗體和p-NF-κB抗體、GAPDH抗體及HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體均購(gòu)買自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與炎癥誘導(dǎo)模型H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃+5%CO2。在H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中添加20 μg/ml TNF-α后，正常培養(yǎng)24 h以建立炎癥誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷體外模型。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染運(yùn)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染將miR-nc、miR-103a、si-nc以及si-TAK1單獨(dú)轉(zhuǎn)入到H9C2心肌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染8 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后通過檢測(cè)miR-103a和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1（TAK1）表達(dá)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，轉(zhuǎn)染48 h后參考1.2.1所述建立心肌細(xì)胞炎癥誘導(dǎo)損傷模型。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCRH9C2細(xì)胞經(jīng)處理后被收集，加入trol以提取細(xì)胞總RNA，然后使用PrimeScript? RT reagent kit試劑盒合成cDNA，參考qPCR Master Mix試劑盒說明書制備20 μl RT-qPCR系統(tǒng)，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀器檢測(cè)miR-103a的相對(duì)表達(dá)量。miR-103a引物為：正向：5'- ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACA GGG-3'；反向：5'- TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；以U6作為內(nèi)容，U6引物為：上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；下游引物5'-AA CGCTTCACGAATTTGCG-3'。

1.2.4 Western BlotH9C2細(xì)胞經(jīng)處理后被收集，加入RIPA裂解液以提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，使用10%SDSPAGE蛋白分離膠分離50 μg總蛋白，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉2 h，4℃孵育一抗過夜，室溫孵育二抗1 h后顯影。以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度值比值表示TAK1、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)H9C2細(xì)胞經(jīng)處理后被收集，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心以收集細(xì)胞裂解液上清，最后運(yùn)用caspase 3、8或9活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解液中caspase 3、8或9蛋白濃度，以caspase 3、8或9蛋白濃度與總蛋白濃度的比值表示caspase 3、8或9蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 細(xì)胞活性與凋亡檢測(cè)H9C2細(xì)胞經(jīng)處理后被收集，參考CCK8試劑盒說明書檢測(cè)H9C2細(xì)胞活性，運(yùn)用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)通過Target Scan網(wǎng)站（結(jié)合NCBI查找TAK1基因3'-UTR與miR-103a結(jié)合的部位，將這段3'-UTR的野生型（WT）和突變型（MUT）克隆到經(jīng)Sac I和Sal I雙酶切后的pmirGLO質(zhì)粒上，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒與miR-103a-mimic或者miR-nc共轉(zhuǎn)到H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞通過Dual-Luciferase系統(tǒng)（Promega，中國(guó)）檢測(cè)熒光素酶熒光強(qiáng)度。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異由Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多組間差異通過單因素方差分析進(jìn)行比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α誘導(dǎo)對(duì)心肌細(xì)胞miR-103a和TAK1蛋白表達(dá)的影響經(jīng)免疫印跡法檢測(cè)H9C2細(xì)胞中TAK1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，經(jīng)TNF-α處理的TNF-α組H9C2心肌細(xì)胞中TAK1蛋白表達(dá)顯著升高（圖1）。經(jīng)qRT-PCR法檢測(cè)心肌細(xì)胞中miR-103a表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，經(jīng)TNF-α處理的TNF-α組H9C2心肌細(xì)胞中miR-103a表達(dá)顯著降低，表1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 TNF-α處理后心肌細(xì)胞中TAK1蛋白的表達(dá)

表1 TNF-α處理后心肌細(xì)胞中miR-103a和TAK1蛋白表達(dá)

2.2 miR-103a過表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染miR-nc的TNF-α+miR-nc組H9C2心肌細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05）；且TNF-α+miR-103a組H9C2心肌細(xì)胞活性顯著高于TNF-α+miR-nc組（P＜0.05）。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染miR-nc的TNF-α+miR-nc組H9C2心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；且TNF-α+miR-103a組H9C2心肌細(xì)胞活性顯著低于TNF-α+miR-nc組（P＜0.05），表2。此外，與TNF-α+miR-nc組相比，TNF-α+miR-103a組中caspase 3、8和9蛋白在H9C2心肌細(xì)胞表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表3。

表2 miR-103a過表達(dá)抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性和凋亡

表3 miR-103a過表達(dá)抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白活性

2.3 miR-103a靶向抑制心肌細(xì)胞TAK1蛋白表達(dá)在Target Scan 網(wǎng)站（www.targetscan.org）上可查詢到miR-103a與TAK1蛋白存在互補(bǔ)序列（圖2）。與miR-nc組相比，miR-103a組H9C2心肌細(xì)胞TAK1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）（圖3）。雙熒光素酶基因報(bào)告細(xì)胞檢測(cè)顯示：與miR-nc組相比，miR-103a組WT處理的H9C2細(xì)胞熒光活性顯著降低（P＜0.05），而MUT處理的H9C2細(xì)胞熒光活性并未顯著降低（P＞0.05），表4。

表4 miR-103a對(duì)心肌細(xì)胞熒光素酶活性的影響

圖2 miR-103a與TAK1基因互補(bǔ)序列

圖3 miR-103a過表達(dá)抑制心肌細(xì)胞TAK1蛋白表達(dá)

2.4 TAK1敲低對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，TNF-α+si-nc組和TNF-α+si-TAK1組H9C2心肌細(xì)胞活性顯著降低（P＞0.05）；而與TNF-α+si-nc組相比，TNF-α+si-TAK1組H9C2心肌細(xì)胞活性顯著升高（P＞0.05）。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，TNF-α+si-nc組和TNF-α+si-TAK1組H9C2心肌細(xì)胞活性顯著升高（P＞0.05）；而與TNF-α+si-nc組相比，TNF-α+si-TAK1組H9C2心肌細(xì)胞活性顯著降低（P＞0.05），表5。此外，與TNF-α+si-nc組比較，TNF-α+si-TAK1組中caspase 3、8和9蛋白在H9C2心肌細(xì)胞表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表6。

表5 TAK1敲低抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

表6 TAK1敲低對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 TAK1敲低對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響運(yùn)用免疫印跡法檢測(cè)NF-κB蛋白及其磷酸化情況，結(jié)果顯示：三組間H9C2心肌細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)無顯著變化（圖4）；與TNF-α+si-nc組相比，TNF-α+si-TAK1組中p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低（P＞0.05），表7。

表7 TAK1敲低抑制TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活

圖4 TAK1敲低抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活

2.6 TAK1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-103a過表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：與TNF-α+miR-103a組相比，TNF-α+miR-103a+AAV-TAK1組H9C2心肌細(xì)胞細(xì)胞活性顯著降低（P＞0.05），而細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＞0.05），表8。

表8 過表達(dá)TAK1逆轉(zhuǎn)miR-103a過表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用

2.7 TAK1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-103a過表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中NF-κB通路的抑制作用運(yùn)用免疫印跡檢測(cè)NF-κB蛋白及其磷酸化情況，結(jié)果顯示：四組NF-κB蛋白表達(dá)無顯著差異。而與TNF-α+miR-103a組相比，TNF-α+miR-103a+AAV-TAK1組H9C2心肌細(xì)胞p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高（P＞0.05），圖5及表9。

表9 TAK1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-103a過表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中NF-κB通路的抑制作用

圖5 TAK1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-103a過表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中NF-κB通路的抑制作用

3 討論

心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的一系列疾病的統(tǒng)稱，心肌梗死、缺血心肌病、心力衰竭、心肌炎以及心律失常等都是常見的心血管疾病，這類疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前還未被完全揭示，但可明確的是炎癥引起的心肌細(xì)胞損傷是心血管疾病主要的發(fā)病機(jī)制之一[1,2]。本研究使用TNF-α處理H9C2心肌細(xì)胞建立炎癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷體外模型。TNF-α是一種由單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及粒細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，不僅參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，而且在炎癥反應(yīng)調(diào)控過程中發(fā)揮重要的抑炎作用[11,12]。研究表明[11,12]，TNF-α是炎癥誘導(dǎo)心肌損傷中重要的誘導(dǎo)因子，其不僅可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，且會(huì)降低心肌細(xì)胞的增殖活性。本文研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理的H9C2心肌細(xì)胞miR-103a表達(dá)降低，而TAK1蛋白表達(dá)升高，這與Chen[10]和Zhang等[13]的研究結(jié)果一致。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞中miR-103a-3p表達(dá)降低；Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導(dǎo)滑膜成纖維樣細(xì)胞miR-103a表達(dá)降低，而促進(jìn)TAK1蛋白表達(dá)。進(jìn)一步分析可知：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶 1（TAK1）被鑒定出是miR-103a的靶基因，而TAK1作為絲裂原活化蛋白激酶（MAP3K）家族的成員，是一種重要的NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的分子，可被多種炎癥介質(zhì)如TNF-α和 IL-1β通過MyD88/TRAFs 激活[14,15]。

miRNA是一種非編碼小RNA，被發(fā)現(xiàn)在各種組織器官中廣泛表達(dá)，并且由于其結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定、不易被降解而被認(rèn)為是疾病診斷的優(yōu)質(zhì)生物標(biāo)志物[3]。大量研究表明，miRNAs參與調(diào)控體內(nèi)外心肌細(xì)胞的生存，比如H-F等[16]發(fā)現(xiàn)MiRNA-488-3p通過靶向ZNF791抑制急性心肌梗死誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡；Li等[17]發(fā)現(xiàn)microRNA 340-5p通過調(diào)節(jié)Act1/NF來抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-103a不僅可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡，而且抑制TAK1蛋白表達(dá)，這與Zhang等的研究結(jié)果一致。Zhang等[13]在人滑膜成纖維樣細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，miR-103a靶向抑制TAK1蛋白表達(dá)，并由此抑制炎癥誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

為進(jìn)一步研究miR-103a是否通過靶向調(diào)控TAK1表達(dá)而誘導(dǎo)炎癥環(huán)境下心肌細(xì)胞的凋亡，我們通過比對(duì)miR-103a和TAK1基因序列以查詢其結(jié)合的部位，并通過雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)：miR-103在H9C2心肌細(xì)胞中靶向抑制TAK1表達(dá)。之前的研究表明，TAK1作為MAP3K家族的成員，是一種重要的炎癥誘導(dǎo)因子，當(dāng)其被TNF-α和IL-1β等炎癥介質(zhì)激活后，可通過磷酸化IKKs降解IKBα以促進(jìn)NF-kB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，最終促進(jìn)炎癥[14,15]。而本研究發(fā)現(xiàn)，敲低TAK1不僅抑制TNF-α誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡，而且抑制NF-κB蛋白的磷酸化。NF-κB信號(hào)通路是一個(gè)不僅與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及分化等均密切相關(guān)，而且是與炎癥調(diào)控密切相關(guān)的信號(hào)通路，其在多種心血管系統(tǒng)疾病中被過度激活[18,19]。研究指出，NF-κB蛋白被乙酰化或磷酸化修飾后進(jìn)入細(xì)胞核是NF-κB信號(hào)通路被激活的重要標(biāo)志，結(jié)合本文研究表明敲低TAK1可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活而減輕炎癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

此外，本文研究還發(fā)現(xiàn)，TAK1過表達(dá)不僅逆轉(zhuǎn)miR-103a過表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中NF-κB通路的抑制作用，而且逆轉(zhuǎn)miR-103a過表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中NF-κB通路的抑制作用。綜上可知，TNF-α處理H9C2心肌細(xì)胞下調(diào)miR-103a和上調(diào)TAK1蛋白表達(dá)，miR-103a可通過靶向抑制TAK1而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，最終抑制TNF-α誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡。