靈芝破壁孢子粉中粗多糖含量測(cè)定的不確定度評(píng)估及控制

黃柳娟,王紅梅,邵 毅

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,上海 201403)

靈芝(Ganoderma lucidum)是多孔菌科真菌赤芝的干燥子實(shí)體,在我國(guó)具有悠久的藥用歷史[1],2018年產(chǎn)量達(dá)16.77 萬t[2]。 孢子粉是靈芝的生殖細(xì)胞,其功能活性物質(zhì)含量顯著高于靈芝子實(shí)體[3],是深受消費(fèi)者青睞的功能食品。 靈芝多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等生物活性,是靈芝的主要活性成分之一[4-5],且不同破壁方法處理后,孢子粉粗多糖抗氧化活性與多糖質(zhì)量濃度呈一定效量關(guān)系[6]。 因此不論是評(píng)價(jià)靈芝破壁孢子粉產(chǎn)品的品質(zhì)質(zhì)量,還是精準(zhǔn)評(píng)價(jià)孢子粉粗多糖的營(yíng)養(yǎng)功效,都需要對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。

目前,食品和農(nóng)產(chǎn)品中粗多糖的檢測(cè)還沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法,食用菌行業(yè)一般采用《NY∕T 1676—2008食用菌中粗多糖的測(cè)定》中規(guī)定的苯酚-硫酸比色法進(jìn)行測(cè)定[7]。 測(cè)量不確定度用以表征合理的賦予被測(cè)量值的分散性,以此來判斷測(cè)定值的可靠程度[8]。 通過不確定度評(píng)定,可以分析出對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響的關(guān)鍵因素。 有研究表明,分光光度法測(cè)定粗多糖的過程中,標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合對(duì)總不確定度影響最大,其次為重復(fù)性測(cè)定和分光光度計(jì)引入的不確定度[9-13],但關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖)在配制稀釋過程中引入的不確定度等因素未被涉及。 本研究根據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范《JJF 1059.1—2012 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[14],針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)NY∕T 1676—2008,對(duì)檢測(cè)過程中引入的不確定度分量進(jìn)行全面分析,從而為粗多糖檢測(cè)分析方法的改進(jìn)和檢測(cè)質(zhì)量的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

靈芝(Ganoderma lucidum)破壁孢子粉。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

葡萄糖(分析純,美國(guó)Sigma 公司);苯酚[分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司];濃硫酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇(分析純,上海泰坦科技股份有限公司)。

UV-5100B 紫外-可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);AL204-IC 電子分析天平(德國(guó)Mettler Toledo 公司);100—1 000 μL 單道可變量程移液器(德國(guó)Eppendorf 公司);Sorvall ST16R 離心機(jī)(美國(guó)Thermo 公司);1 000 mL 容量瓶和250 mL 單標(biāo)線容量瓶(A 級(jí),上海申玻儀器公司)。

1.3 粗多糖含量測(cè)定方法

依據(jù)《NY∕T 1676—2008 食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》[7]對(duì)靈芝破壁孢子粉中的粗多糖進(jìn)行測(cè)定。

1.4 不確定度計(jì)算

1.4.1 不確定度來源分析

根據(jù)檢測(cè)方法全過程,分析可能影響檢測(cè)結(jié)果的各操作步驟及相關(guān)設(shè)備。

1.4.2 不確定度分量計(jì)算

電子分析天平、移液器和紫外-可見分光光度計(jì)等設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(x)按其檢定證書標(biāo)示的擴(kuò)展不確定度U和包含因子k來計(jì)算,公式為;相對(duì)不確定度為標(biāo)準(zhǔn)不確定度與該儀器測(cè)量數(shù)值的比值[14]。

基準(zhǔn)物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)品)和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度影響溶液體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為被測(cè)量可能值區(qū)間的半寬度a和包含因子k的比值,公式為,包含因子k采用矩形分布,定值為[14]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度采用線性最小二乘法來評(píng)估[16]。

測(cè)定方法重復(fù)性引入的不確定度由貝塞爾公式來評(píng)估[14]。

1.4.3 合成不確定度及分量不確定度貢獻(xiàn)排序

用方和根方法計(jì)算合成不確定度,并根據(jù)各個(gè)不確定度分量的數(shù)值大小對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)進(jìn)行排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)NY∕T 1676—2008 中方法[7],粗多糖含量計(jì)算的數(shù)學(xué)模型:

公式(1)中,ω:樣品中粗多糖的含量,%;m1:從標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得的樣品溶液中粗多糖的質(zhì)量,μg;V1:樣品定容體積,mL;V2:吸取樣品試樣溶液的體積,mL;m2:樣品質(zhì)量,g;0.9:葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

靈芝破壁孢子粉的粗多糖含量測(cè)定過程中不確定度來源包括:(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配置和稀釋過程中引入的不確定度;(2)供試品處理過程中引入的不確定度;(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度;(4)樣品間的重復(fù)性引入的不確定度;(5)紫外-可見分光光度計(jì)的精度引入的不確定度(圖1)。

圖1 不確定度來源因果圖Fig.1 Causality diagram of uncertainty source

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度主要包括葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品純度P,質(zhì)量M0,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的定容體積V0和稀釋過程,以及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度對(duì)水體體積的影響T。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度

試驗(yàn)使用的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.5%±0.5%,按矩形分布計(jì)算(k=),則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為,其相對(duì)不確定度為。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度

根據(jù)粗多糖檢測(cè)方法,稱取100 mg 105 ℃烘干至恒重的葡萄糖,則標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度即電子天平精密度引入的不確定度。 電子天平校準(zhǔn)證書顯示其擴(kuò)展不確定度U=0.3 mg(k=2),則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為,其相對(duì)不確定度為-4。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液定容引入的不確定度

粗多糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:葡萄糖稱重后,用1 000 mL 容量瓶定容。 由JJG 196—2006[15]查得,該規(guī)格的容量瓶的容量允差為±0.40 mL,按三角分布(k=)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V0) ==1.633 ×10-1,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度稀釋時(shí)移液器引入的不確定度

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí),要求分別吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液至玻璃試管中,用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。 試驗(yàn)使用標(biāo)稱容量為100—1 000 μL 的移液器進(jìn)行移液操作。 移液器校準(zhǔn)證書顯示其擴(kuò)展不確定度U= 2.8 μL(k= 2),則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V2)=。 移取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或水時(shí),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:

標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度稀釋時(shí)移液器引入的不確定度為:

2.2.5 環(huán)境溫度變化引入的不確定度

試驗(yàn)環(huán)境溫度控制在20 ±2 ℃,此時(shí)水的膨脹系數(shù)為2.1 ×10-4,按矩形分布(k=)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不-4確定速度為。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度合成

將影響標(biāo)準(zhǔn)溶液的各個(gè)不確定度分量進(jìn)行合成,得到標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel1。

2.3 供試品引入的不確定度

供試品引入的不確定度主要包括供試品質(zhì)量M2,供試品溶液的定容V1和移取過程,以及試驗(yàn)環(huán)境溫度對(duì)水體體積的影響等。

2.3.1 供試品稱量引入的不確定度

同2.2.2,電子天平的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(M)=1.500×10-4。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法,稱取0.500 0 g 靈芝破壁孢子粉作為待測(cè)樣品,重復(fù)稱取10 次,平均質(zhì)量M2為0.500 4 g,則其相對(duì)不確定度為urel(M2)=。

2.3.2 供試品溶液定容引入的不確定度

樣品前處理后,將待測(cè)液全部轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中。 A 等品250 mL 容量瓶的容量允差為±0.15 mL[15],按三角分布(k=)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:。

2.3.3 供試品溶液移取時(shí)移液器引入的不確定度

同2.2.4,移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V2)=1.400×10-3。 檢測(cè)時(shí)使用標(biāo)稱容量為100—1 000 μL的移液器移取1 mL 待測(cè)樣品時(shí),供試品溶液移取中移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(V2)=。

2.3.4 供試品引入的不確定度合成

將影響供試品的各個(gè)不確定度分量進(jìn)行合成,得到供試品引入的不確定度urel3。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度

按照粗多糖檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C1為橫坐標(biāo),吸光度檢測(cè)值A(chǔ)1為縱坐標(biāo)(表1),求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y = 0.010 3x +0.006,R2=0.999 8。 利用該方程,求得吸光度的理論值A(chǔ)2= 0.010 3C1+0.006 ,進(jìn)而計(jì)算A1與A2的差值,根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差SR。 其中,公式中的n 為標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)測(cè)定的點(diǎn)數(shù),即為6。

按照線性最小二乘法擬合直線的不確定度評(píng)估公式,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度。 其中,N為供2試)品;溶為液標(biāo)的準(zhǔn)測(cè)品定溶次液數(shù)中,標(biāo)即準(zhǔn)為品1 0質(zhì);C量x平為均供值試,品即溶4液9.按88回7 歸μg方∕m程L(計(jì)表算1的),質(zhì)Cj量為濃第度j平次均測(cè)值量,標(biāo)即準(zhǔn)6 0溶.4液0 3中 μ葡g∕萄m L糖(表質(zhì)量,Aj為第j 次測(cè)量對(duì)照品溶液吸光度。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度Table 1 Absorbances and concentrations of standard solution in glucose standard curve

2.5 測(cè)定方法重復(fù)性引入的不確定度

對(duì)靈芝破壁孢子粉樣品進(jìn)行10 次粗多糖含量的測(cè)定,結(jié)果見表2。 用貝塞爾公式,求得靈芝破壁孢子粉粗多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為。 重復(fù)性的不確定度為u()==1.390×10-2,相對(duì)不確定度為。

表2 靈芝破壁孢子粉的粗多糖含量Table 2 Crude polysaccharide content in broken Ganoderma lucidum spore powder

2.6 紫外-可見分光光度計(jì)引入的不確定度

紫外-可見分光光度計(jì)引入的不確定度由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度和供試品溶液吸光度兩部分組成。由紫外-可見分光光度計(jì)檢定證書可知其透射比誤差U= 0.3% (k= 2),因此其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度平均值A(chǔ)0=0.519(表1),供試品溶液吸光度平均值A(chǔ)x=0.625(表2),其相對(duì)不確定度分別為:

由于相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為上述兩個(gè)合成,即

2.7 合成不確定度的評(píng)估

靈芝破壁孢子粉中粗多糖含量測(cè)定的相對(duì)不確定度為:

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

Urel = Urel總×樣品粗多糖含量=1.690×10-2×2.71% =0.045 8%

2.8 擴(kuò)展不確定度的表示

當(dāng)不確定度分布均勻且置信概率為0.95 時(shí),擴(kuò)展不確定度的包含因子k=2,其擴(kuò)展不確定度U =2Urel =2×0.045 8% =0.09%,靈芝破壁孢子粉的粗多糖含量可表示為2.71%±0.09%(k=2)。

2.9 不確定度分量排序

通過比較各分量不確定度的大小,發(fā)現(xiàn)最主要的不確定度來源是標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制稀釋過程中引入,其次為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入,然后是重復(fù)測(cè)量引入(表3)。

表3 靈芝破壁孢子粉的粗多糖含量測(cè)定各不確定度Table 3 Components of uncertainty in determination of crude polysaccharide content inbroken Ganoderma lucidum spore powder

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)一個(gè)靈芝破壁孢子粉樣品的粗多糖含量檢測(cè)過程的不確定度進(jìn)行全面評(píng)估,發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置稀釋過程中引入的不確定度所占比例最大(表3),值得關(guān)注。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制過程對(duì)不確定度的影響在其他參數(shù)的檢測(cè)方法不確定度評(píng)估中得到重視[17-19],但在粗多糖檢測(cè)不確定度評(píng)估研究中還未見報(bào)道。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)分兩步,第一步先配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,稀釋過程中引入的不確定度是該項(xiàng)不確定度來源的主要組成部分。 本試驗(yàn)使用移液器來進(jìn)行移液操作,而如果使用A 類1 mL 移液管,因其允差為±0.007,按三角分布(包含因子k=)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度(u),結(jié)果為,高于移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度1.400 ×10-3,即會(huì)增加不確定度。 當(dāng)采用“分別吸取0.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL 和10.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液至玻璃試管中并用蒸餾水補(bǔ)至10.0 mL,再吸取1.0 mL 的試液進(jìn)行后續(xù)的苯酚硫酸顯色反應(yīng)”的操作時(shí),即便使用移液管,也可將此步的不確定度由現(xiàn)有的1.198 ×10-2降至7.810 ×10-3。 由此可見,增加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制量,可以有效降低標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引進(jìn)的不確定度,在實(shí)際檢測(cè)中具有較強(qiáng)的操作性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度排名第二,這與此前的研究結(jié)果[9-10]有差異。 理論上,選擇精密度高的儀器,或增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定點(diǎn)數(shù),可降低標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度,從而提高方法的可靠性。 然而,使用高精密度設(shè)備會(huì)增加成本,而若將標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù)增加到7 個(gè)或8 個(gè),標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合Urel 標(biāo)曲由原來的9.418 ×10-3降為8.905 ×10-3或7.710 ×10-3,降幅并不顯著,在實(shí)際操作中可行性不強(qiáng)。

綜上,在用苯酚-硫酸分光光度法測(cè)定靈芝破壁孢子粉中粗多糖含量時(shí),標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合是影響不確定度的主要因素,增加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制量可有效降低方法的不確定度,提高方法可靠性。