規(guī)?；Z場(chǎng)主要病毒核酸檢測(cè)結(jié)果與分析

邵震，刁有祥

規(guī)?；Z場(chǎng)主要病毒核酸檢測(cè)結(jié)果與分析

邵震，刁有祥

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000

【目的】經(jīng)長(zhǎng)期對(duì)中國(guó)國(guó)內(nèi)各省市的規(guī)模化鵝場(chǎng)常見病毒性疫病核酸檢出率進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)許多規(guī)模化鵝場(chǎng)均可同時(shí)檢出多種病毒核酸，并且這種現(xiàn)象非常普遍，鑒于目前國(guó)內(nèi)關(guān)于規(guī)?；Z場(chǎng)多種病毒性疫病核酸同時(shí)檢出的相關(guān)數(shù)據(jù)較為匱乏，論文旨在了解規(guī)?；Z場(chǎng)多種病毒性疫病核酸同時(shí)檢出的情況并進(jìn)行分析，為規(guī)模化鵝場(chǎng)病毒性疫病的防控提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。【方法】2021年5—10月，自山東、黑龍江、四川、吉林、廣西、河南、安徽、遼寧、河北、貴州、湖南及內(nèi)蒙古等省市的47個(gè)規(guī)?；Z場(chǎng)采集737份病料，對(duì)其采用普通PCR及RT-PCR方法進(jìn)行番鴨呼腸孤病毒（muscovy duck reovirus, MDRV）、鴨呼腸孤病毒（duck reovirus, DRV）、鵝星狀病毒(goose astroviruses, GAstV)、禽腺病毒（fowl adenovirus, FAdV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒（reticuloendotheliosis virus, REV ）、新城疫病毒（newcastle disease, ND）、鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus, GPV)、鵝圓環(huán)病毒(goose circovirus, GoCV)、鵝出血性多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus, GHPV)、坦布蘇病毒（tembusu virus, TMUV）及H9亞型禽流感病毒（avian influenza virus H9, H9-AIV）等11種規(guī)?；Z場(chǎng)常見病毒性疫病的檢測(cè)。每份病料剖取完整的肝臟、脾臟、肺臟及腎臟，利用Trizol 法提取總 RNA；以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的一條鏈，而后以cDNA為模板繼續(xù)擴(kuò)增獲得完整的cDNA，隨后以該cDNA為模板利用番鴨呼腸孤病毒、鴨呼腸孤病毒、鵝星狀病毒、禽腺病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生性病毒、新城疫病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝出血性多瘤病毒、坦布蘇病毒及H9亞型禽流感病毒的特異性引物，通過(guò)普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段；所有擴(kuò)增片段均進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)部分陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序；將所獲得的測(cè)序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的相應(yīng)病毒基因序列進(jìn)行比較，應(yīng)用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining, NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】番鴨呼腸孤病毒、鴨呼腸孤病毒、鵝星狀病毒、禽腺病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生性病毒、新城疫病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝出血性多瘤病毒、坦布蘇病毒及H9亞型禽流感病毒感染情況檢測(cè)結(jié)果顯示，GAstV核酸檢出率最高，為58.21%；REV及NDV核酸檢出率最低，分別為1.36%及1.50%；鵝群不同程度上均可同時(shí)檢出多種病毒核酸，尤其以2種或3種病毒核酸同時(shí)檢出的情況較為普遍，占樣品總數(shù)的67.44%。兩種病毒核酸同時(shí)檢出率中GAstV與GoCV同時(shí)檢出所占比例最大，為18.44%；3種病毒核酸同時(shí)檢出率中MDRV、GAstV及GPV同時(shí)檢出所占比例最大，為36.28%。【結(jié)論】明確了我國(guó)規(guī)?；Z場(chǎng)可以同時(shí)檢測(cè)到多種病毒核酸這一特征，這可能是我國(guó)規(guī)?；Z場(chǎng)病毒性疫病復(fù)雜化和防控難度加大的重要原因之一。

規(guī)?；Z場(chǎng)；核酸檢測(cè)；遺傳進(jìn)化分析

0 引言

【研究意義】中國(guó)是世界第一養(yǎng)鵝大國(guó)，2020年我國(guó)商品鵝出欄量達(dá)6.39億只， 2021年我國(guó)商品鵝出欄量達(dá)6.61億只。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的不斷增加，鵝病的發(fā)生率大幅上升，經(jīng)常可在病鵝體內(nèi)檢測(cè)出多種病毒核酸，鵝病的預(yù)防、診斷和控制面臨著重大挑戰(zhàn)。因此，加強(qiáng)對(duì)規(guī)?；Z場(chǎng)多種病毒性疫病核酸的檢測(cè)，可為了解鵝病的流行情況提供流行病學(xué)資料，為鵝病的防控提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】 CHEN等[1]為了解GAstV的流行情況，于2018年1月至2019年4月從湖北、安徽、河南等地的7個(gè)規(guī)模化鵝場(chǎng)中收集了165份病料。檢測(cè)結(jié)果顯示，GAstV檢出陽(yáng)性的病料中，均可以同時(shí)檢出鵝細(xì)小病毒（GPV）及番鴨呼腸孤病毒（MDRV）；TING等[2]調(diào)查了臺(tái)灣40個(gè)規(guī)?；Z場(chǎng)，結(jié)果顯示44.6%的雛鵝和66.7%的成年鵝群中均可同時(shí)檢出GPV與GoCV核酸；LIU等[3]對(duì)采集自中國(guó)12個(gè)規(guī)?；Z場(chǎng)的病料進(jìn)行了GPV、FAdV、TMUV、GHPV等病毒的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示這些雛鵝皆可同時(shí)檢測(cè)出GPV和GAstV病毒核酸，且GPV的存在會(huì)使痛風(fēng)加重。在此研究基礎(chǔ)上，WANG等認(rèn)為雛鵝痛風(fēng)是由GAstV與其他病毒共同作用導(dǎo)致的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前規(guī)模化鵝場(chǎng)大部分可同時(shí)檢出多種病毒核酸，對(duì)我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的危害較大。為了解當(dāng)前我國(guó)規(guī)?；Z場(chǎng)中病毒性疫病的流行情況，筆者從華東、華南、華中、東北、西南等地區(qū)的規(guī)?；Z場(chǎng)采集病料，對(duì)規(guī)?；Z場(chǎng)新型鵝星狀病毒（GAstV）、鴨呼腸孤病毒（DRV）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、鵝細(xì)小病毒[4]（GPV）、鵝圓環(huán)病毒（GoCV）、禽腺病毒（FAdV）、坦布蘇病毒[5-6]（TMUV）、禽流感H9亞型病毒（AIV-H9N2）、鵝多瘤病毒（GHPV）、新城疫病毒（NDV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒（REV）等常見病毒性疫病的核酸檢出情況進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)代表毒株測(cè)序、分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】確定規(guī)?；Z場(chǎng)常見病毒性疫病病毒核酸的同時(shí)檢出情況，為鵝病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

2021年5—10月自山東、黑龍江、四川、吉林、廣西、河南、安徽、遼寧、河北、貴州、湖南及內(nèi)蒙古等省市的47個(gè)規(guī)?；Z場(chǎng)采集737份病料。

1.2 主要試劑及儀器

Tris平衡酚、SDS、蛋白酶K購(gòu)自北京索來(lái)寶生物科技有限公司；RNA 提取試劑 Trizol Reagent 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼爾有限公司），PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank已發(fā)表的病毒基因序列設(shè)計(jì)特異性引物。GPV引物參考登錄號(hào)NC_001701.1的GPV毒株VP3基因設(shè)計(jì)；GoCV引物參考GoCV/375/GD/2020（登錄號(hào)MT831941.1）毒株的V1基因設(shè)計(jì)；GHPV引物參考JY141Ma（登錄號(hào)MG670535.1）毒株的Large T基因設(shè)計(jì)；MDRV引物參考ZJ99（登錄號(hào)AY619690.1）毒株的σC基因設(shè)計(jì)；H9-AIV引物參考HU10-1708（登錄號(hào)為L(zhǎng)C500398.1）毒株的Segment 4設(shè)計(jì)。引物序列見表1，引物由青島華大基因公司合成。

表1 引物序列

1.4 核酸提取

采用Trizol法進(jìn)行RNA的提?。喝〗M織置于離心管中加入Trizol；離心棄沉淀；加入氯仿靜置；離心吸取水相；加入異丙醇靜置；離心棄上清；加入乙醇，離心棄上清；晾管；加入30 μL RNA-free ddH2O溶解。

采用酚—氯仿法提取DNA：取組織液置于離心管中加入蛋白酶K，56 ℃水??；加入平衡酚與氯仿；離心吸取上清液；加入無(wú)水乙醇，-20 ℃沉淀；離心加入冷乙醇；離心，棄去乙醇；晾干后ddH2O溶解沉淀。

1.5 （RT-）PCR擴(kuò)增及序列分析

反轉(zhuǎn)錄體系按照下列比例配制：dNTP Mix，4 μL；Primer Mix，2 μL；RNA Template，7 μL；5×RT Buffer，4 μL；DTT，2 μL；HiFiScript，1 μL 。cDNA按照下列程序合成：42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。

PCR擴(kuò)增體系如下：DNA或cDNA 1 μl；上、下游引物各1 μl；2×Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，退火溫度見表1 30 s，72 ℃延伸、延伸時(shí)間根據(jù)各片段長(zhǎng)度設(shè)定，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸 10 min。取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并挑選PCR產(chǎn)物送至青島擎科公司測(cè)序。

1.6 遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果采用MEGA 6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining），p-distance算法，Bootstrap 1000次繪制遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

從12個(gè)省共采集病料737份，病料樣品信息見表2—4。

表2 病料樣品信息

2.1 不同病原檢測(cè)結(jié)果

不同病原檢測(cè)結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，GAstV檢出最多，為429份，陽(yáng)性檢出率達(dá)58.21%；其次為DRV和MDRV，檢出量分別為319份和288份，陽(yáng)性檢出率為43.28%和39.08%；REV檢出量最少，為10份，陽(yáng)性檢出率為1.36%。結(jié)果表明，GAstV、DRV及MDRV在規(guī)?；Z場(chǎng)中流行最為廣泛。

2.2 不同病原核酸的檢測(cè)結(jié)果

不同病原核酸同時(shí)檢出的結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，僅100份樣品只檢出唯一一種病毒核酸，所占比例13.7%；多達(dá)632份樣品同時(shí)檢測(cè)出2種或2種以上病毒核酸，所占比例高達(dá)85.75%，由此表明大部分規(guī)?；Z場(chǎng)均可同時(shí)檢出2種或2種以上病毒核酸。在多種病毒核酸同時(shí)檢出的病例中，同時(shí)檢出2種病毒核酸樣品數(shù)為282份，所占比例為38.26%；同時(shí)檢出3種病毒核酸樣品數(shù)為215份，所占比例為29.17%；同時(shí)檢出4種病毒核酸樣品數(shù)為111份，所占比例為15.06%。結(jié)果表明，大部分鵝場(chǎng)均可同時(shí)檢出兩種或3種病毒核酸。

表3 不同月份病料采集情況

表4 不同日齡段病料情況

表5 不同病毒檢測(cè)

表6 不同病原核酸的檢測(cè)

2.2.1 不同病原單一病毒核酸檢測(cè) 不同病原單一病毒核酸檢測(cè)結(jié)果見表7。結(jié)果顯示，以GAstV的檢出率最高，達(dá)42.00%，之后依次為GoCV和DRV，檢出率分別為27.00%和14.00%。

表7 不同病原單一病毒核酸檢測(cè)

2.2.2 不同病原雙重病毒核酸檢測(cè) 不同病原雙重病毒核酸檢測(cè)結(jié)果見表8。結(jié)果顯示，GAstV與GoCV 2種病毒的混合檢出率最高，為18.44%；其次是DRV與GoCV，檢出率為16.67%。由于GoCV是免疫抑制性病原，猜測(cè)當(dāng)鵝群感染GoCV后，鵝群免疫力下降，甚至疫苗免疫失敗，從而繼發(fā)感染其他病原，造成較大損失。

2.2.3 不同病原三重病毒核酸檢測(cè) 不同病原三重病毒核酸檢測(cè)結(jié)果見表9。結(jié)果顯示，MDRV、GAstV及GPV的檢出率最高，為25.28%。其中約94.88%的三重病毒核酸檢測(cè)出了MDRV或DRV，因此需要重視水禽呼腸孤類病毒對(duì)規(guī)模化鵝場(chǎng)的威脅。

2.2.4 不同病原四重病毒核酸檢測(cè) 不同病原四重病毒核酸檢測(cè)結(jié)果見表10。結(jié)果顯示，MDRV、DRV、FAdV及GPV檢出率最高，為22.52%。

2.2.5 不同病原五重病毒核酸檢測(cè) 不同病原五重病毒核酸檢測(cè)結(jié)果見表11。結(jié)果顯示，MDRV、DRV、GPV、GAstV及FAdV檢出率最高，為33.33%。

表8 不同病原雙重病毒核酸檢測(cè)

2.3 不同日齡鵝群病毒核酸檢測(cè)

不同日齡段鵝群病毒核酸檢測(cè)結(jié)果表明（圖1）。不同日齡段的鵝均可檢出病毒核酸，但情況各異。MDRV在不同日齡段鵝體內(nèi)的檢出率均較高，以青年鵝群最高；DRV、FAdV在青年鵝群檢出數(shù)最多，雛鵝和成年鵝的檢出量相近；GAstV在雛鵝中檢出量遠(yuǎn)高于青年鵝和成年鵝；REV、GHPV在不同日齡段鵝群中檢出量相似；NDV只在雛鵝中檢出；GPV主要在雛鵝和青年鵝中檢出，成年鵝檢出較少；GoCV主要從雛鵝中檢出，青年鵝和成年鵝也有檢出，但相對(duì)較少；TMUV病毒核酸主要從成年鵝體內(nèi)檢出。

2.4 不同季節(jié)鵝群的檢測(cè)結(jié)果

為調(diào)查規(guī)?；Z場(chǎng)流行病與季節(jié)的關(guān)系，對(duì)不同季節(jié)規(guī)?；Z場(chǎng)病毒性疫病進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明（表12），H9亞型禽流感病毒在氣溫變化幅度較大的季節(jié)（春季）檢出數(shù)量更多，呈現(xiàn)明顯的季節(jié)規(guī)律； TMUV感染主要發(fā)生在夏季。

表9 不同病原三重病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

2.5 不同病原主要基因遺傳變異分析

2.5.1 GPV VP3基因遺傳變異分析 GPV VP3基因在不同來(lái)源GPV毒株之間的變異情況較為保守。對(duì)GPV VP3基因進(jìn)行遺傳變異分析，由圖2可見，GPV分離株LC2021（分離自2021.07.19從山東省聊城市陽(yáng)谷縣采集的棉拭子中）和HD2021（分離自2021.05.13從河北省邯鄲市采集的脾臟中）與參考毒株GPV HB15株的遺傳關(guān)系最近，與MDPV DY株、PT株處于同一分支，但與中國(guó)大陸GPV疫苗株（GD，SYG61及SYG26-35）處于完全不同的分支[7]，有較遠(yuǎn)的遺傳距離[8]。

圖1 不同日齡段檢測(cè)結(jié)果

表10 不同病原四重病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

表11 不同病原五重病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

2.5.2 GoCV V1基因遺傳變異分析 由圖3可見，GoCV分離株ZB2021（分離自2021.09.18從山東省淄博市沂源縣采集的脾臟中）、YG2021（分離自2021.07.19從山東省聊城市陽(yáng)谷縣采集的棉拭子中）與鵝源GoCV大陸參考分離株處于同一個(gè)小分支，與鵝源中國(guó)臺(tái)灣參考分離株處于完全不同的分支上，表明大陸鵝源GoCV分離株之間親緣關(guān)系較近，但與臺(tái)灣GoCV鵝源分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表12 不同季節(jié)檢測(cè)結(jié)果

2.5.3 GHPV Large T基因遺傳變異分析 對(duì)GHPV Large T基因進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果見圖4，GHPV分離株XC2021（分離自2021.05.10從河南省項(xiàng)城市采集的脾臟中）與世界各地（中國(guó)、匈牙利、法國(guó)）水禽源GHPV分離株（鵝源、番鴨源、櫻桃谷鴨源、北京鴨源及鴨源）均處于同一分支，與非水禽源的GHPV毒株處于不同分支上。

圖2 基于GPV VP3基因的遺傳進(jìn)化圖

圖3 基于GoCV V1基因的遺傳進(jìn)化圖

2.5.4 MDRV σC基因遺傳變異分析 由圖5可見，分離株SDDZ2021（分離自2021.06.19從山東省德州市采集的肝臟中）與MDRV參考毒株匯為獨(dú)立分支，與DRV及ARV參考毒株處于不同分支，相互之間遺傳距離較遠(yuǎn)。SDDZ2021與MDRV中國(guó)經(jīng)典分離株ZJ2000M[9]遺傳距離最近。

3 討論

H9-AIV、NDV、TMUV、GoCV及GPV病毒是威脅規(guī)?；Z場(chǎng)的重要病原，給其帶來(lái)較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10-13]。這些病毒如果同時(shí)或先后感染可造成鵝群多樣的臨床癥狀和病理變化，使鵝病防控形勢(shì)日益嚴(yán)峻。因此，通過(guò)調(diào)查了解規(guī)?；Z場(chǎng)病毒性疫病的共感染情況，可為鵝病防控提供理論依據(jù)。

3.1 調(diào)查的規(guī)?；Z場(chǎng)以同時(shí)檢出2種或3種病毒核酸為主

本研究對(duì)我國(guó)部分地區(qū)規(guī)模化鵝場(chǎng)病毒性疫病核酸的同時(shí)檢出情況進(jìn)行了初步調(diào)查，結(jié)果表明，僅僅檢出一種病毒核酸的情況較少，以同時(shí)檢出多種病毒核酸為主且類型復(fù)雜。其中以同時(shí)檢出2種病毒核酸的情況居多，尤其以GAstV與GoCV所占比例最大（18.44%）；同時(shí)檢出3種病毒核酸以MDRV、GAstV、GPV居多；同時(shí)檢出4種病毒核酸以MDRV、DRV、GPV、FAdV較為常見；同時(shí)檢出5種病毒核酸的情況較少。

筆者認(rèn)為諸如GoCV、GHPV及MDRV等免疫抑制性病毒的感染是我國(guó)部分規(guī)?；Z場(chǎng)檢測(cè)到多種病毒核酸同時(shí)存在的主要原因之一。免疫抑制性病毒的存在會(huì)大大降低鵝群的群體免疫力，使鵝群更容易感染常見的流行病，同時(shí)增加了鵝群感染新發(fā)疫病的風(fēng)險(xiǎn)。免疫抑制性病毒癥狀通常易被繼發(fā)病毒癥狀掩蓋，造成診療人員的誤判、漏判，使診療的方案、物力、人力向繼發(fā)病毒傾斜，忽視對(duì)免疫抑制性病毒的診療，導(dǎo)致繼發(fā)感染難以凈化完全，鵝群反復(fù)感染、反復(fù)治療，體內(nèi)始終共存多種病毒核酸。其次，筆者查閱病料采集記錄詳情本后發(fā)現(xiàn)，有些病料的來(lái)源鵝場(chǎng)剛剛進(jìn)行過(guò)疫苗接種，疫苗毒株核酸的存在也可能是此次調(diào)查檢測(cè)出多種病毒核酸的原因之一。同時(shí)，筆者通過(guò)電話回訪發(fā)現(xiàn)，一些規(guī)?；Z場(chǎng)的種鵝來(lái)源于曾經(jīng)發(fā)生過(guò)多重病毒共感染的疫區(qū)或疫源國(guó)，垂直、交叉感染情況較為嚴(yán)重，一部分雛鵝出生即死，死亡雛鵝體內(nèi)可檢測(cè)到多種病毒核酸；一部分雛鵝通過(guò)加強(qiáng)免疫及治療勉強(qiáng)存活，剖檢后也可檢測(cè)到多種病毒核酸，筆者推測(cè)這也是本次調(diào)查檢測(cè)出多種病毒核酸的原因之一。

圖4 基于GHPV Large T基因的遺傳進(jìn)化圖

圖5 基于σC基因的遺傳進(jìn)化圖

據(jù)此，針對(duì)本次調(diào)查中鵝群檢測(cè)出多種病毒核酸共存這一事實(shí)，筆者認(rèn)為如果不能完全自繁自養(yǎng)，做好病毒凈化，首先應(yīng)做好引種檢疫關(guān)，堅(jiān)決不從發(fā)生過(guò)多種病毒流行的疫源地引種，避免垂直傳播和交叉感染的發(fā)生。其次，規(guī)?；Z場(chǎng)發(fā)生感染及死亡后，不能僅從癥狀推導(dǎo)疾病，應(yīng)盡可能進(jìn)行病毒核酸的檢測(cè)，有條件的情況下還應(yīng)針對(duì)檢測(cè)出的病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)及易感動(dòng)物的回歸實(shí)驗(yàn)，以此排除疫苗毒株病毒核酸的干擾。明確實(shí)際感染的病毒種類，以此制定科學(xué)合理的治療方案，循序漸進(jìn)，標(biāo)本兼治，避免遺漏、忽略任何一種病毒，尤其是免疫抑制性病毒。同時(shí)，筆者認(rèn)為良好的飼養(yǎng)管理、全進(jìn)全出及完善的消殺措施是重中之重，以此增強(qiáng)和保障鵝群的整體免疫力處于較高的水平。對(duì)于檢測(cè)出的多種共存病毒，應(yīng)針對(duì)性預(yù)防，如TMUV的重要傳播媒介是蚊蟲，則規(guī)?；Z場(chǎng)夏季應(yīng)做好滅蚊、防蚊工作；GAstV的重要傳播媒介是野生水禽、涉禽，則規(guī)?；Z場(chǎng)要做好隔離措施，選址盡量避開候鳥遷徙路線，水源盡可能潔凈、獨(dú)立，以此避免野生水禽、涉禽與鵝群發(fā)生直接或間接的接觸。

3.2 共同檢出多種病毒核酸與更嚴(yán)重的后果聯(lián)系密切

本研究未檢出只有GPV病毒核酸單一存在的情況，但GPV的檢出率卻高達(dá)35.55%，說(shuō)明GPV以與其他病毒核酸共同檢出為主，其中GPV與MDRV、GAstV、GoCV及FAdV共同檢出的情況居多。WU等[2]調(diào)查了臺(tái)灣規(guī)?；Z場(chǎng)GPV與GoCV的檢出情況，調(diào)查結(jié)果顯示約12 000只鵝被感染，GPV與GoCV的同步檢出率為53.26%，發(fā)病率為70%—80%，死亡率為20%—30%，遠(yuǎn)高于GPV或GoCV單一入侵所造成的發(fā)病率或死亡率[14]；LIU等[3]調(diào)查了中國(guó)12個(gè)規(guī)?；Z場(chǎng)，結(jié)果顯示GAstV與GPV的同步檢出率達(dá)到96.15%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)GAstV或GPV的單一檢出率，表明在GPV存在的條件下，規(guī)?；Z場(chǎng)鵝群檢出GAstV的概率大幅上升。NIU等[15]調(diào)查了中國(guó)11個(gè)省規(guī)?；Z場(chǎng)的GPV檢出情況，發(fā)現(xiàn)GPV與GoCV的同步檢出率為21.7%；同時(shí)許多被調(diào)查的規(guī)?；Z場(chǎng)并未流行過(guò)GPV，說(shuō)明這些鵝場(chǎng)或許存在著GPV的隱性感染或垂直感染。因此除了常規(guī)的疫苗防控外，對(duì)種鵝群進(jìn)行GPV的凈化同樣非常重要。此外，以往的研究報(bào)道了GPV與MDPV之間存在著明顯的基因重組，并且已經(jīng)出現(xiàn)了可導(dǎo)致鴨喙萎縮與侏儒癥（BADS）的新型鴨源GPV，這表明GPV已可以跨宿主感染鴨群[8, 16-18]。

H9亞型AIV對(duì)鵝為低致病性[19]，但當(dāng)H9-AIV與其他病原體共同入侵宿主時(shí)，會(huì)使鵝群的死亡率大大增加。LIN等[20]調(diào)查結(jié)果顯示鵝群?jiǎn)我粰z出H9-AIV時(shí)，發(fā)病率僅為10%，且無(wú)死亡現(xiàn)象，胸腺也未見明顯病理變化，但當(dāng)H9-AIV與MDRV共同檢出后，鵝群發(fā)病率驟升至90%，死亡率攀升至70%，胸腺萎縮且出現(xiàn)局部壞死，表明H9-AIV與MDRV協(xié)同配合降低鵝群免疫力；HASSAN等[21]調(diào)查了埃及H9-AIV的檢出情況，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)H9-AIV與傳染性支氣管炎病毒（IBV）同步檢出時(shí)，不僅H9-AIV的臨床癥狀加重[22]，IBV亦出現(xiàn)致死病例；GOWTHAMAN等[23]調(diào)查了印度南部37個(gè)農(nóng)場(chǎng)的NDV與H9-AIV的共同檢出情況，結(jié)果顯示H9-AIV與NDV的共同檢出率可達(dá)100%，死亡率比NDV、H9單一檢出的情況皆高出30%以上，疫病持續(xù)時(shí)間多出4—6周，并繼發(fā)大腸桿菌和支原體感染[24]；YU等[25]調(diào)查了山東省H9-AIV與I群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）共同檢出的情況，結(jié)果顯示H9-AIV與FAdV-4同步檢出率為24.30%，由此推測(cè)免疫抑制性疫病會(huì)破壞群體免疫，為其他病原入侵提供有利條件。本研究H9-AIV于春季檢出數(shù)量最多，原因可能與晝夜溫差過(guò)大、天氣寒冷導(dǎo)致鵝抵抗力下降有關(guān)。H9-AIV雛鵝檢出數(shù)量較多，但死亡率卻很低。成年鵝檢出數(shù)量和死亡率相對(duì)較低，可能由于成年鵝的免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟，可以抵抗H9-AIV的入侵[26]。但成年鵝可能出現(xiàn)隱性帶毒的情況，尤其當(dāng)H9-AIV與其他病毒共同入侵宿主機(jī)體時(shí)，可使鵝群的死亡率大幅增加。

NDV對(duì)鵝同樣具有致病性，且發(fā)病率和死亡率居高不下。雛鵝更容易檢出NDV，青年鵝和成年鵝NDV檢出數(shù)量較少，可能由于青年鵝和成年鵝免疫系統(tǒng)較為完善。NDV大部分是單一檢出，可能與其發(fā)病急、死亡率高有關(guān)；NDV多與H9-AIV共同檢出，兩者相互作用可使鵝群發(fā)病率升高。因此合理的免疫計(jì)劃、標(biāo)準(zhǔn)的飼養(yǎng)管理可以最大程度降低NDV的危害。

本研究GHPV檢出率僅為3.12%，尚未對(duì)我國(guó)鵝群構(gòu)成威脅[27]，但GHPV病毒在歐洲是非常重要的傳染病原體之一[28-29]。規(guī)?；Z場(chǎng)一旦檢出GHPV病毒核酸就很難徹底凈化[28, 30-31]。因此從國(guó)外引種、購(gòu)買活鵝或鵝制品時(shí)要做好檢驗(yàn)檢疫，從源頭上阻止GHPV傳入我國(guó)。同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，避免水禽混養(yǎng)、家禽野禽接觸，并進(jìn)行定期的徹底消毒，以上措施可在一定程度上防控GHPV對(duì)規(guī)?；Z場(chǎng)造成危害。

TMUV入侵宿主機(jī)體具有明顯的季節(jié)特征，夏季檢出數(shù)量較多，因?yàn)橄募疚孟x較多利于該種蟲媒病毒傳播[32]，因此在夏季規(guī)?；Z場(chǎng)應(yīng)注意滅蚊滅蟲，從傳播途徑上減少鵝群接觸TMUV的幾率。TANG等[33]在規(guī)?；Z場(chǎng)周邊的麻雀體內(nèi)檢測(cè)到TMUV，以此提出麻雀可作為TMUV的傳播媒介，這一點(diǎn)提示我們要做好規(guī)模化鵝場(chǎng)周邊的防鳥措施，嚴(yán)禁家鵝與野禽、野鳥接觸。本研究TMUV以與其他病毒核酸的共同檢出為主（92.11%），其中又以TMUV、MDRV雙重病毒核酸檢出數(shù)量最多，2種病毒之間可能存在協(xié)同配合作用。因此，對(duì)TMUV的防控不能局限于對(duì)鵝群進(jìn)行免疫接種，同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、建立健全生物安全綜合防控體系。

GoCV病毒是一種免疫抑制性病毒[34]，鵝感染GoCV后會(huì)繼發(fā)其他病原感染，使其臨床癥狀加重、復(fù)雜，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率急劇升高，是我國(guó)規(guī)?；Z場(chǎng)病毒性疫病反復(fù)感染、不易控制的主要原因之一。本研究的GoCV檢出率為32.43%，常與MDRV、GAstV、GPV、FAdV、H9等病毒核酸同時(shí)檢出，各季節(jié)、各日齡段的鵝均易檢出GoCV病毒核酸。雛鵝中GoCV檢出數(shù)量較多，可能與垂直傳播有關(guān)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)種鵝群GoCV的凈化。

3.3 規(guī)?；Z場(chǎng)同時(shí)檢出多種病毒核酸的現(xiàn)象需要得到更多的關(guān)注

本研究表明，我國(guó)部分地區(qū)規(guī)?；Z場(chǎng)可以持續(xù)同時(shí)檢測(cè)出多種病毒核酸，筆者猜測(cè)這或許是規(guī)模化鵝場(chǎng)病毒性疫病防控復(fù)雜化的原因之一。當(dāng)2種或2種以上病毒同時(shí)或先后感染鵝時(shí)，會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，常會(huì)導(dǎo)致臨床癥狀與病理變化復(fù)雜化，極易造成誤判與漏判，使鵝群感染率與死亡率升高，造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，除了常規(guī)的疫苗防控及藥物治療外，應(yīng)根據(jù)每種病毒性疫病的傳播特點(diǎn)及相互之間的作用規(guī)律制定合理的防控計(jì)劃，加強(qiáng)引種檢疫與種源凈化，減少垂直傳播。此外，切斷傳播途徑及媒介，對(duì)免疫抑制性病原加強(qiáng)監(jiān)控，定期監(jiān)測(cè)抗體水平，通過(guò)多種手段綜合保障規(guī)模化鵝場(chǎng)的生物安全。

4 結(jié)論

（1）解釋了多種病毒核酸共存的原因，提出了針對(duì)生產(chǎn)的意見。

（2）對(duì)規(guī)?；Z場(chǎng)進(jìn)行了11種病毒核酸的檢測(cè)，觀察到數(shù)種病毒核酸同時(shí)檢測(cè)出的現(xiàn)象（85.89%），以2種（38.26%）或3種（29.17%）病毒核酸同時(shí)檢出的情況居多。

（3）規(guī)?；Z場(chǎng)中GAstV、DRV、MDRV、GPV、GoCV、FAdV等病毒核酸的檢出率較高，均在30.00%以上。

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Investigation and Analysis of Nucleic Acid Detection Results of Viral Viruses in Large-Scale Goose Farms

SHAO Zhen, DIAO YouXiang

College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai′an 271000, Shandong

【Objective】The author’s research group has long investigated the nucleic acid detection rate of common viral diseases in scaled goose farms in various provinces and cities in China, and found that many large-scaled goose farms in China could detect multiple viral nucleic acids at the same time, and this phenomenon was very common. In view of the lack of relevant data on the simultaneous detection of multiple viral diseases in large-scale goose farms in China, the purpose of this paper was to understand and analyze the simultaneous detection of nucleic acids of multiple viral diseases in large-scaled goose farms, so as to provide the theoretical guidance and scientific basis for the prevention and control of viral diseases in scaled goose farms. 【Method】From May 2021 to October 2021, 737 diseased materials were collected from 47 scaled goose farms in Shandong, Heilongjiang, Sichuan, Jilin, Guangxi, Henan, Anhui, Liaoning, Hebei, Guizhou, Hunan and Inner Mongolia. These samples were detected for Muscovy duck reovirus (MDRV), duck reovirus (DRV), goose astroviruses (GAstV), fowl adenovirus (FAdV), reticuloendotheliosis virus (REV), Newcastle disease (NDV), goose parvovirus (GPV), goose circovirus (GoCV), goose hemorrhagic polyomavirus (GHPV), Tembusu virus (TMUV) and H9 subtype avian influenza virus (H9-AIV) by ordinary PCR and RT-PCR. The liver, spleen, lung and kidney were dissected from each sample, and total RNAs were extracted by Trizol method; a strand of cDNA was synthesized by reverse transcription with total RNA as the template, and then the complete cDNA was obtained by continuous amplification with cDNA as the template. Using these cDNA as template, the specific primers of MDRV, DRV, GAstV, FAdV, REV, NDV, GPV, GoCV, GHPV, TMUV and H9-AIV were used to amplify the target fragment by ordinary PCR reaction. All amplified fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis, and some positive samples were sequenced. The obtained sequencing results were compared with the corresponding virus gene sequences published on GenBank, and the phylogenetic tree was drawn by Neighbor-Joining (N-J) method in MEGA 6.0 software for analysis. 【Result】MDRV, DRV, GAstV, FAdV, REV, NDV, GPV, GoCV, GHPV, TMUV and H9-AIV showed that the detection rate of GAstV was the highest, with the value of 58.21%; the detection rates of REV and NDV were the lowest, with the value of 1.36% and 1.50%, respectively. A variety of viral nucleic acids could be detected simultaneously in geese to varying degrees, especially in two or three viral nucleic acids, accounting for 67.44% of the total samples. In the simultaneous detection rate of nucleic acids of the two viruses, GAstV and GoCV accounted for the largest proportion, which was 18.44%; MDRV, GAstV and GPV accounted for 36.28% of the simultaneous detection rates of the three virus nucleic acids. 【Conclusion】It was further confirmed that multiple viral nucleic acids could be detected simultaneously in large-scaled goose farms in China. It was speculated that this might be one of the important reasons for the complexity of viral diseases and the difficulty of prevention and control in large-scaled goose farms in China.

scaled goose farm; nucleic acid test; phylogenetic analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.016

2022-01-13；

2022-05-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-42-19）

邵震，Tel：15526836071；E-mail：1250101253@qq.com。通信作者刁有祥，Tel：13605386443；E-mail：yxdiao@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）