柑橘抗逆基因MYB96的克隆與表達(dá)分析

李 瀟,郭文芳,楊 莉,胡 威,匡柳青,劉德春,劉 勇

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,江西 南昌 330045)

柑橘的栽植面積及產(chǎn)值在我國(guó)果樹(shù)產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著非常重要的地位,但其分布范圍和生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫的制約[1]。植物體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以通過(guò)將轉(zhuǎn)錄因子與下游基因順式作用元件結(jié)合從而調(diào)控下游基因表達(dá),在植物適應(yīng)不同逆境脅迫的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。因此,對(duì)柑橘響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。

MYB家族轉(zhuǎn)錄因子均含有保守的MYB結(jié)構(gòu)域,根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)域N端所包含的R結(jié)構(gòu)的數(shù)量,MYB轉(zhuǎn)錄因子可以分為4個(gè)亞家族:1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[4-5]。近年來(lái)研究表明,R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控脂質(zhì)[6]、木質(zhì)素[7]、花青素[8]以及黃酮醇[9]等多種代謝物合成的功能。同時(shí),R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)高鹽[10]、干旱[11]、高溫[12]和低溫[13]脅迫過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用。

研究表明,擬南芥AtMYB96轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合在編碼脂肪酸延伸酶(如KCS、KCR和ECR)的基因啟動(dòng)子上,調(diào)控植物表皮蠟質(zhì)的生物合成,從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物抗旱性,并保護(hù)其免受病理性和機(jī)械性損傷[14-15]。目前,月季(Rosahybrida)[16]、蘋(píng)果(Maluspumila)[17]、山茶(Camelinasativa)[18]等植物的MYB96在基因表達(dá)和抗逆功能上的研究已有報(bào)道。

在柑橘中,關(guān)于MYB96轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在調(diào)控甜橙外果皮蠟質(zhì)生物合成以及減少采后甜橙果實(shí)失水的功能上[19]。為探索柑橘M(fèi)YB96基因在響應(yīng)逆境脅迫中的功能,本研究從不同的柑橘種類:甜橙、檸檬、金柑和蘆柑中克隆得到4個(gè)MYB96基因,對(duì)其生物信息學(xué)以及在不同種類的柑橘和不同逆境脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行分析,為闡明MYB96基因在柑橘中響應(yīng)非生物脅迫應(yīng)答的作用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

參照盧婷等[20]的方法,培養(yǎng)甜橙(Citrussinensis(L.)Osbeck.)、檸檬(Citruslimon(L.)Burm.f.)、金柑(Fortunellamargarita(Lour.)Swingle.)、蘆柑(CitrusreticulataBlanco.)等4種柑橘材料的實(shí)生幼苗。幼苗培養(yǎng)28 d左右后,再用Hoagland液體營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)3 d,之后進(jìn)行非生物脅迫處理。將幼苗分別移置含有20% PEG6000和含有250 mmol/L NaCl的Hoagland液體營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行干旱和高鹽處理。低溫處理則是將4種柑橘幼苗材料轉(zhuǎn)移到干凈的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液后,置于4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種處理用柑橘幼苗25株,以室溫(25 ℃)Hoagland 液體培養(yǎng)未做處理植株做對(duì)照(0 h),分別在3種處理1,3,6,12,24 h取其葉片,液氮速凍,-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。試?yàn)均進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 葉片總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

葉片總RNA提取、純度檢查和完整性評(píng)估按照郭文芳等[21]描述的方法進(jìn)行。按照日本TOYOBO公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,存放于-20 ℃,備用。

1.3 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因克隆

在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)甜橙基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查找獲得甜橙CsMYB96基因cDNA序列,使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物CsMYB96-F和CsMYB96-R(表1),以甜橙、檸檬、金柑和蘆柑葉片第一鏈cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因擴(kuò)增產(chǎn)物,插入pMD18-T 載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,菌液PCR鑒定為陽(yáng)性后進(jìn)行測(cè)序。引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增程序參照郭文芳等[21]的方法。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站中的ORF Finder程序中獲取4個(gè)柑橘M(fèi)YB96基因cDNA序列編碼區(qū)長(zhǎng)度與氨基酸數(shù)量。在NCBI網(wǎng)站中的Blast程序進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)查找同源蛋白,利用SMART在線軟件進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析,并利用MEGA 7.0軟件中NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。蛋白理化性質(zhì)利用ExPASy ProtParam在線分析工具分析預(yù)測(cè);蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分別利用SOPMA和SWISS MODEL完成;亞細(xì)胞定位用在線網(wǎng)站CELLO完成。甜橙CsMYB96基因上的啟動(dòng)子分析利用Plant CARE在線網(wǎng)站完成。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

基于完成測(cè)序的CsMYB96基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件,設(shè)計(jì)CsMYB96基因?qū)崟r(shí)定量引物qCsMYB96-F和qCsMYB96-R,內(nèi)參基因?yàn)楦涕貯ctin基因(表1)。反應(yīng)體系和程序參照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū),每個(gè)樣品3次重復(fù),利用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因克隆及序列分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增,分別從甜橙、檸檬、金柑和蘆柑的cDNA中克隆出MYB96序列,并分別命名為CsMYB96、ClMYB96、FmMYB9和CrMYB96。測(cè)序結(jié)果和序列分析結(jié)果表明,CsMYB96和CrMYB96的cDNA全長(zhǎng)分別為1 215,1 214 bp,均含有1 032 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼343個(gè)氨基酸。ClMYB96和FmMYB96的cDNA全長(zhǎng)均為1 218 bp,含有1 035 bp的開(kāi)放閱讀框,都編碼344個(gè)氨基酸。

2.2 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白序列分析

對(duì)CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,CsMYB96和CrMYB96蛋白分子量分別約為38.16,38.13 ku,理論等電點(diǎn)均為6.31;ClMYB96和FmMYB96蛋白分子量分別約為38.27,38.22 ku,理論等電點(diǎn)均為6.35。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,4個(gè)MYB96蛋白核定位的預(yù)測(cè)分值均顯著高于非核定位預(yù)測(cè)分值,可以預(yù)測(cè)CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白定位于細(xì)胞核(表2)。一般認(rèn)為總平均親水性系數(shù)小于0屬于親水性蛋白,預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,這4個(gè)蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)分別為51.48,50.78,49.38,52.15,總平均親水性系數(shù)分別為-0.751,-0.766,-0.757,-0.762,所以推測(cè)它們都是不穩(wěn)定親水性蛋白。再通過(guò)ProtScale在線軟件對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白親疏水性預(yù)測(cè),結(jié)果表明平均得分小于0,進(jìn)一步證明它們均為親水性蛋白質(zhì)(圖1-A)。

A.親疏水性分析;B.三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型;C.磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。A.Hydrophilicity and hydrophobicity analysis;B.Three dimensional structure prediction model;C.Phosphorylation site prediction.圖1 CsMYB96蛋白預(yù)測(cè)分析Fig.1 Prediction and analysis of CsMYB96

對(duì)CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示,這4個(gè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似,主要含有α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲。因此,以CsMYB96蛋白為例,使用SWISS-MODEL在線工具獲得了CsMYB96蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,發(fā)現(xiàn)CsMYB96蛋白主要由螺旋和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成(圖1-B),與SOPMA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。

表2 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及二級(jí)結(jié)構(gòu)信息Tab.2 Subcellular localization prediction and secondary structure information of CsMYB96,ClMYB96, FmMYB96 and CrMYB96

對(duì)CsMYB96蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,CsMYB96中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多,約27個(gè),蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)約13個(gè)以及6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖1-C)。因此,推測(cè)該基因主要通過(guò)絲氨酸磷酸化修飾調(diào)控其功能。

2.3 不同種類柑橘M(fèi)YB96蛋白的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件將CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96蛋白與其他植物MYB蛋白氨基酸序列比對(duì),結(jié)果顯示,這4條氨基酸序列有5個(gè)位點(diǎn)存在差異,序列一致性達(dá)99.56%,且與擬南芥AtMYB96、AtMYB94、山茶CsMYB96、蕪菁BrMYB96和鹽藻EuMYB96蛋白同源性較高,均具有高度保守的R2和R3結(jié)構(gòu)域(圖2短線標(biāo)出)。在R2和R3結(jié)構(gòu)域中,均含有3個(gè)分別間隔19個(gè)堿基和間隔18個(gè)堿基的保守色氨酸(W)殘基,但在R3結(jié)構(gòu)域中,第一個(gè)色氨酸(W)被苯丙氨酸(F)所取代(圖2中用▲標(biāo)出)。利用SMART在線軟件對(duì)這4個(gè)柑橘M(fèi)YB96蛋白序列的分析結(jié)果顯示,它們的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致很高,即氮端13—63位氨基酸和66—114位氨基酸的位置上含有2個(gè)SANT保守結(jié)構(gòu)域;在碳端233—249位和258—274位氨基酸處含有2個(gè)低復(fù)合物區(qū)域,圖3中以甜橙CsMYB96蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果為例。

圖2 多種植物MYB蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment of MYB proteins in several plants

圖3 CsMYB96保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 CsMYB96 conserved domain analysis

同時(shí)利用MEGA 7.0對(duì)甜橙CsMYB96、檸檬ClMYB96、金柑FmMYB96、蘆柑CrMYB96 蛋白與其他藻類、苔蘚、單子葉和雙子葉植物的MYB類似蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。結(jié)果表明,CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白與同為蕓香科柑橘屬的克萊門(mén)氏小柑橘CcMYB96蛋白(XP 006440595.1)親緣關(guān)系最近;與擬南芥AtMYB96同屬于雙子葉植物分支,親緣關(guān)系較近;與其他不同種類的植物MYB類似蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系符合植物由藻類到苔蘚再到被子植物(單子葉植物、雙子葉植物)的進(jìn)化歷程(圖4)。

圖4 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96與其他植物MYB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of CsMYB96,ClMYB96,FmMYB96,CrMYB96 and MYB proteins in other plants

2.4 CsMYB96基因啟動(dòng)子順式元件分析

利用PlantCARE對(duì)CsMYB96基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析,結(jié)果表明,CsMYB96基因的啟動(dòng)子除了含有TATA-box和CAAT-box這些基本的啟動(dòng)子核心啟動(dòng)元件外,還含有光響應(yīng)元件如G-Box、AT1-motif、TCCC-motif等,以及多種非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件,主要有脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、厭氧響應(yīng)元件(ARE)、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)等(表3),這說(shuō)明CsMYB96基因可能在柑橘抵御非生物脅迫時(shí)發(fā)揮作用。

2.5 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96在非生物脅迫處理后的表達(dá)分析

對(duì)甜橙、檸檬、金柑和蘆柑分別進(jìn)行4 ℃低溫、20% PEG6000和250 mmol/L NaCl處理,取其葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析(圖5)。

A—C.甜橙葉片;D—F.檸檬葉片;G—I.金柑葉片;J—L.蘆柑葉片。不同小寫(xiě)字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。A—C.Sweet orange leaves;D—F.Lemon leaves;G—I.Kumquat leaves;J—L.Ponkan leaves.Different lowercase showed significant difference among treatments(P<0.05).圖5 柑橘M(fèi)YB96在低溫、干旱、高鹽處理下的表達(dá)模式Fig.5 Expression pattern of citrus MYB96 under low temperature, drought and high salt treatment

4 ℃低溫脅迫下,葉片中甜橙CsMYB96和蘆柑CrMYB96基因表達(dá)趨勢(shì)一致,均為先下降后上升再下降,兩基因表達(dá)量最高值均為處理后6 h。其中甜橙CsMYB96基因表達(dá)量在4 ℃低溫處理后變化更顯著,約為對(duì)照的2.5倍;同時(shí),蘆柑CrMYB96在葉片中表達(dá)量也上升至最高值,略大于對(duì)照;這2個(gè)基因的表達(dá)量在除處理6 h外的其他處理時(shí)段均低于對(duì)照。而檸檬ClMYB96、金柑FmMYB96的表達(dá)量在低溫脅迫處理后均低于對(duì)照,說(shuō)明這2個(gè)基因的表達(dá)受到了低溫脅迫的抑制。

20% PEG6000模擬干旱脅迫處理時(shí),葉片中甜橙CsMYB96和檸檬ClMYB96基因表達(dá)在處理0～12 h趨勢(shì)一致,均為先下降后上升再下降,且兩基因表達(dá)量最高值均為處理后6 h。其中,甜橙CsMYB96在處理6 h的表達(dá)量約為對(duì)照的3倍;處理后24 h,其表達(dá)量恢復(fù)到處理前的水平。檸檬ClMYB96在處理6 h的表達(dá)量為對(duì)照的2倍左右;之后在處理12 h其表達(dá)量下降至與對(duì)照無(wú)顯著差異,但在處理24 h表達(dá)量再次出現(xiàn)小高峰,約為對(duì)照的1.5倍。而金柑FmMYB96和蘆柑CrMYB96基因表達(dá)量在模擬干旱脅迫處理后總體下降。

250 mmol/L NaCl 脅迫處理時(shí),甜橙CsMYB96在葉片中的表達(dá)量在處理1～3 h顯著下降;處理6 h,甜橙CsMYB96被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),表達(dá)量達(dá)到最大值,之后表達(dá)量又逐漸降低。高鹽處理下,檸檬ClMYB96在葉片中的表達(dá)量被誘導(dǎo)表達(dá),整體表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。金柑FmMYB96的表達(dá)量在高鹽處理的短時(shí)間內(nèi)被抑制,處理6 h,其表達(dá)量顯著上升,且高鹽處理24 h,其表達(dá)量達(dá)到最大值,約為對(duì)照的2.6倍。蘆柑CrMYB96基因表達(dá)量在高鹽處理下整體受到抑制。

3 結(jié)論與討論

在植物響應(yīng)非生物脅迫的過(guò)程中,MYB轉(zhuǎn)錄因子處于調(diào)控中心位置,能夠調(diào)控大量下游抗逆基因表達(dá),進(jìn)而保護(hù)自身免受各種逆境脅迫的危害[22]。近年來(lái),對(duì)MYB家族轉(zhuǎn)錄因子,尤其是R2R3-MYB亞家族轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫調(diào)控中的作用機(jī)制有了較為深入的研究,越來(lái)越多的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子被證實(shí)參與了植物非生物脅迫的調(diào)控。為探究MYB96基因在柑橘中是否也參與逆境調(diào)控過(guò)程以及在不同品種中是否存在差異,從甜橙、檸檬、蘆柑、金柑中分別克隆出CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因,并利用生物信息學(xué)方法對(duì)這4個(gè)柑橘M(fèi)YB96基因序列進(jìn)行了保守性和系統(tǒng)進(jìn)化分析,以及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。氨基酸序列分析結(jié)果顯示,這4個(gè)柑橘M(fèi)YB96蛋白都具有R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子特有的2個(gè)高度保守SANT結(jié)構(gòu)域(R2和R3),這與趙先炎等[17]研究結(jié)果一致,表明克隆結(jié)果真實(shí)可靠。同時(shí),蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明,這4個(gè)蛋白均為不穩(wěn)定親水蛋白,易溶解。這與馬尾松[23]和菠蘿[24]中R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果一致。此外,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明,4個(gè)柑橘品種間遺傳關(guān)系較近,位于同一分支。并與同屬植物CcMYB96親緣關(guān)系最近,與擬南芥AtMYB96同位于雙子葉植物這一大分支上,親緣關(guān)系較近。而與苔蘚和藻類植物MYB蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這符合植物系統(tǒng)分類學(xué)的進(jìn)化趨勢(shì)。

有研究表明,MYB轉(zhuǎn)錄因子可以同時(shí)參與多種脅迫信號(hào)響應(yīng),例如,過(guò)表達(dá)MdSIMYB1基因可以同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因煙草和蘋(píng)果對(duì)干旱、低溫和鹽脅迫的耐受性[25]。在本試驗(yàn)中,CsMYB96基因啟動(dòng)子序列中包含多個(gè)植物逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)作用元件,如脫落酸響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)。非生物脅迫處理表達(dá)分析結(jié)果也表明,經(jīng)過(guò)4 ℃低溫、PEG模擬干旱脅迫處理6 h后,甜橙CsMYB96基因表達(dá)量上升。由此推測(cè),CsMYB96基因可能同時(shí)受這2種非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá),參與植物非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程。

近年來(lái),已報(bào)道的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子大多作為正調(diào)控因子參與非生物逆境響應(yīng),例如,擬南芥AtMYB96能夠響應(yīng)干旱脅迫[14];番茄中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子LeAN2會(huì)受低溫氧化脅迫誘導(dǎo)表達(dá),過(guò)表達(dá)該基因能夠促進(jìn)花青素的積累,增強(qiáng)了其對(duì)低溫和氧化脅迫的抵抗力[26];水稻OsMYB55和OsMYB91能夠分別響應(yīng)高溫和高鹽脅迫。與野生型相比,過(guò)表達(dá)OsMYB55和OsMYB91植株分別表現(xiàn)出較強(qiáng)的高溫和高鹽耐受性[27-28]。本研究中實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,檸檬ClMYB96、金柑FmMYB96與蘆柑CrMYB96對(duì)于相同逆境脅迫做出的響應(yīng)有所差異。檸檬ClMYB96和金柑FmMYB96基因在經(jīng)250 mmol/L NaCl脅迫處理后,葉片中的表達(dá)量都有明顯提高。由此推測(cè),檸檬ClMYB96和金柑FmMYB96可能作為正調(diào)控因子,參與高鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。但是,低溫、干旱和高鹽脅迫后,蘆柑CrMYB96基因的表達(dá)量在較短時(shí)間內(nèi)受到了抑制。這與甘蔗R2R3-MYB基因Sc2RMyb1在受到NaCl脅迫后,表達(dá)量被抑制而明顯下調(diào)的結(jié)果相似[29]。植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí),往往有許多基因參與調(diào)控,同一個(gè)基因發(fā)揮的作用也不相同。馮瑩瑩等[30]研究表明,在鹽脅迫處理下,白木香AsMYB2表達(dá)量顯著上升;而在低溫脅迫處理下,AsMYB2表達(dá)量顯著降低。因此,可能是檸檬ClMYB96、金柑FmMYB96與蘆柑CrMYB96在不同的脅迫處理下發(fā)揮的作用不同,導(dǎo)致其表達(dá)量受到誘導(dǎo)或抑制;而這3個(gè)MYB96基因?qū)ο嗤拿{迫處理做出的響應(yīng)表現(xiàn)有所差異,則可能與檸檬、金柑和蘆柑這3個(gè)柑橘種類自身遺傳特性差異有關(guān)。

綜上所述,本研究克隆獲得了4個(gè)不同種類柑橘的MYB96基因,對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并預(yù)測(cè)到CsMYB96啟動(dòng)子含有多個(gè)脅迫相關(guān)元件。然后,進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn)證明了這些基因受低溫、干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)或抑制表達(dá)。本研究為進(jìn)一步鑒定柑橘中MYB96基因的抗逆功能奠定了基礎(chǔ)。