藍(lán)莓3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆及生物信息學(xué)分析

劉 娜,田雨菁,馮哲瀚,李虎良,張 蕾,黃金海,華德平

(天津大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津 300072)

花青素來(lái)源于植物,水溶性良好,屬黃酮類化合物。植物被其賦予鮮艷的顏色,從而吸引昆蟲授粉[1-2]。此外,花青素在醫(yī)藥和工業(yè)生產(chǎn)中也具有很重要的作用,如預(yù)防糖尿病、肥胖、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等,甚至可能預(yù)防癌癥[3],被普遍用于食品著色劑,營(yíng)養(yǎng)品、化妝品添加劑等[4]。傳統(tǒng)獲得花青素的方法是從植物組織中提取[5],但植物中花青素的含量易隨季節(jié)和區(qū)域波動(dòng)、存在質(zhì)量很難控制、純度相對(duì)較低等問(wèn)題[6-7],這使得利用微生物進(jìn)行花青素生物合成具有潛在優(yōu)勢(shì)。

3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)是花青素合成通路中催化活化的糖分子從核苷二磷酸向低分子量底物上轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶,能將不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的彩色花色苷[8]。3GT作用于活化的糖分子作為供體底物在花青素的O(OH-和COOH-)、N、C、S原子上進(jìn)行花青素的糖基化,最常見(jiàn)的供體分子為UDP-葡萄糖[9]。

已有對(duì)3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的研究表明,3GT對(duì)于維持花青素含量至關(guān)重要,在研究牽?；ㄉ淖兓瘯r(shí)發(fā)現(xiàn),3GT缺陷的牽牛花花瓣顏色不如之前顏色鮮艷[10]。有研究發(fā)現(xiàn),花青素在3號(hào)位的糖基化對(duì)于葡萄漿果和葡萄酒的紅色色素沉著至關(guān)重要。對(duì)葡萄3GT進(jìn)行克隆與特征分析,發(fā)現(xiàn)紅色葡萄品種的果皮和果肉在轉(zhuǎn)紅期表達(dá)3GT,并且隨著3GT表達(dá)的上調(diào),果皮顏色逐漸加深,而白色葡萄品種中未見(jiàn)表達(dá)[11]。亦有研究證實(shí),3GT的活性增加導(dǎo)致花青素在蘋果和荔枝中積累增加[12]。深色葡萄3GT的表達(dá)受到多種因素的影響,僅在轉(zhuǎn)色期后進(jìn)行表達(dá),且隨時(shí)間的變化,表達(dá)水平也會(huì)改變[13]。這些研究都證實(shí)了3GT對(duì)花青素積累的重要性。

目前已經(jīng)在許多植物中克隆得到了糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、荷蘭鳶尾(Irishollandica)、草莓(Fragariaananassa)、矮牽牛(Petuniahybrida)和葡萄(Vitisvinifera)等。藍(lán)莓(Vacciniumcorymbosum)果實(shí)在成熟過(guò)程中會(huì)積累大量的花青素,然而對(duì)于藍(lán)莓中3GT基因的研究還未有報(bào)道,本研究克隆了藍(lán)莓3GT(Vc3GT)基因并利用在線分析網(wǎng)站和生物信息學(xué)軟件對(duì)Vc3GT及其編碼氨基酸進(jìn)行了理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)、酶和底物分子對(duì)接預(yù)測(cè)和啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)等,旨在研究該基因的特征和功能,為后續(xù)進(jìn)一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶的作用及花青素異源合成表達(dá)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

高叢藍(lán)莓(市場(chǎng)購(gòu)置),Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)試劑盒(上海翊圣生物科技股份有限公司,CAT:11139ES60),pClone007克隆載體(北京擎科生物科技有限公司,CAT:TSV-007S),質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化科技有限公司,CAT:DP103-03),大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天津大學(xué)黃金海教授實(shí)驗(yàn)室制備),LB培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓3GT克隆

1.2.1.1 藍(lán)莓mRNA的提取及cDNA的合成 利用TRIzol-KAc法提取藍(lán)莓mRNA,利用Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將其合成第一鏈cDNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2Vc3GT基因擴(kuò)增 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中藍(lán)莓3GT序列(Gene Bank:MH321467.1)設(shè)計(jì)引物,上游引物3GT-F:5′-ATGTCCAACTTCTCAAAAGACCGGC-3′;下游引物3GT-R:5′-GCGGCGTTCATTTCTAAATGTTGTACC-3′。反應(yīng)體系為20 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,模板1 μL,2×Hieff Robust PCR Master Mix 10 μL,ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序,95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增程序結(jié)束后,取4 μL PCR產(chǎn)物檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳,查看PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及特異性。

1.2.1.3Vc3GT基因T載體連接及測(cè)序 取上述Vc3GTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL,pClone007 0.5 μL,10×Topo Mix 1 μL,ddH2O 7.5 μL混勻,16 ℃過(guò)夜連接。第2天,準(zhǔn)備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入其中,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切及測(cè)序,確定已成功將3GT連接入T載。

1.2.2Vc3GT及其編碼蛋白的生物信息分析 根據(jù)測(cè)序獲得的Vc3GT序列及其翻譯的氨基酸序列,使用 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析Vc3GT開(kāi)放閱讀框數(shù)據(jù);利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast工具中的 Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析程序,獲得Vc3GT蛋白保守域分析數(shù)據(jù);利用DNAMAN軟件對(duì)Vc3GT氨基酸序列及其他植物3GT氨基酸進(jìn)行多重序列比對(duì)分析;運(yùn)用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT的理化性質(zhì)分析數(shù)據(jù);通過(guò) NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)在線分析網(wǎng)站,對(duì)Vc3GT的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè);使用ProtScal(http://web.expasy.org/protscale/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT親水性和疏水性分析的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù);利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT跨膜域的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù);利用 SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT信號(hào)肽的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù);運(yùn)用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=%20npsa_sopma.html)網(wǎng)站,獲得Vc3GT二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù);通過(guò)SWISS-MODLE(http://swissmodel.expasy.org/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)模型;利用MEGA 7.0對(duì)藍(lán)莓3GT氨基酸序列和選取的其他植物3GT氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;使用PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線網(wǎng)站,獲得Vc3GT啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 Vc3GT與底物矢車菊素分子對(duì)接模擬 3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶能將矢車菊素(C15H11O6)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的3-O-矢車菊花色苷。通過(guò)自動(dòng)化拓?fù)錁?gòu)建器和存儲(chǔ)庫(kù)小分子ATB網(wǎng)站(https://atb.uq.edu.au/index.py)直接獲得矢車菊素的三維結(jié)構(gòu),并保存為PDB格式,通過(guò)SWISS-MODLE獲得Vc3GT蛋白的三維結(jié)果。利用Auto Dock(https://autodock.scripps.edu/)軟件實(shí)現(xiàn)分子對(duì)接,將獲得結(jié)果利用Discovery Studio visualizer進(jìn)行圖形化展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓3GT基因的克隆

以藍(lán)莓cDNA為模板擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)在1 000～1 500 bp存在單一特異性條帶(圖1-A),與Vc3GT的大小相符(1 371 bp)。將PCR產(chǎn)物與T載體連接,經(jīng)菌落PCR與質(zhì)粒酶切鑒定,初步證明Vc3GT成功連接入T載體(圖1-B)。通過(guò)測(cè)序及序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)Vc3GT位于藍(lán)莓的4號(hào)染色體末端,含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子[14]。開(kāi)放閱讀框從ATG到TAG全長(zhǎng)1 371 bp,編碼456個(gè)氨基酸(圖 1-C),與NCBI公布的序列相比,擴(kuò)增獲得的Vc3GT在411 bp處的T突變?yōu)镃,對(duì)應(yīng)的氨基酸未發(fā)生改變。

A.Vc3GT基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)示意圖;B.Vc3GT連接入T載體質(zhì)粒圖譜;C.Vc3GT位于藍(lán)莓的4號(hào)染色體,含有3個(gè)外顯子與2個(gè)內(nèi)含子。A.The diagram of agarose gel electrophoresis for the PCR amplification of Vc3GT gene;B.The map of the Vc3GT-T vector;C.The Vc3GT localizes on chromosome IV and contains 3 exons and 2 introns.圖1 藍(lán)莓Vc3GT的克隆Fig.1 The cloning of Vc3GT from the cDNA of blueberry

2.2 Vc3GT基因的特征分析

2.2.1 不同物種3GT氨基酸同源性分析 Vc3GT蛋白保守域分析是利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) Blast程序中的Conserved Domains程序進(jìn)行的,Vc3GT屬于植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族,具有典型的GTB-型結(jié)構(gòu)域(圖2-A)。GTB-型糖基轉(zhuǎn)移酶能使活化的糖基供體轉(zhuǎn)移到特定的蛋白質(zhì)、脂肪、雜環(huán)化合物、碳水化合物或其他碳水化合物的殘基等這些受體分子上,形成糖苷鍵。受體分子多樣,所形成的糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)多樣且具有廣泛的生物學(xué)功能。利用DNAMAN軟件對(duì)Vc3GT氨基酸序列及其他4種植物3GT氨基酸進(jìn)行多重序列比對(duì)分析,結(jié)果表明,Vc3GT與獼猴桃(Actinidiachinensis, ADC34700.1)、桑樹(Morusalba, AOV62766.1)、矮牽牛(Petunia×hybrida, BAA89008.1)、玉米(Zeamays, ABF72120.1)的相似性分別為67.47%,50.76%,47.17%和36.21%(圖2-B)。

A.Vc3GT氨基酸保守域分析;B.多個(gè)物種中Vc3GT氨基酸序列比對(duì)。A.The diagram of conserved domain for Vc3GT;B.The amino acid sequence of Vc3GT protein in several species.圖2 Vc3GT氨基酸序列分析Fig.2 The amino acid sequence analysis of Vc3GT

糖基轉(zhuǎn)移酶家族的C-末端都含有PSPG結(jié)構(gòu)域(PSPG-box),是UDP-葡萄糖的結(jié)合區(qū)域[15],其中包含的高度保守的HCGWNS殘基(圖2-B黑框)[16],是與UDP-葡萄糖尿嘧啶殘基相互作用的區(qū)域。PSPG結(jié)構(gòu)域由44個(gè)氨基酸組成(圖2-A、B黑色下劃線部分),其最后一位氨基酸種類決定了糖分子供體的特異性,若第44位是谷氨酰胺(Gln),則糖基供體為UDP-葡萄糖,若是組氨酸(His),則糖基供體為UDP-半乳糖[17]。Vc3GT氨基酸序列中,PSPG結(jié)構(gòu)域中第44位是組氨酸(圖2-B星號(hào)標(biāo)識(shí)),預(yù)示Vc3GT的糖基供體可能為UDP-半乳糖。Vc3GT活性位點(diǎn)由14個(gè)氨基酸組成,分別為第19,20,22,178,181,182,186,211,281,351,353,355,356和359位氨基酸殘基(圖2-B箭頭、菱形和三角),包括TDP結(jié)合位點(diǎn)(TDP-binding site)(圖2-B箭頭)和受體底物結(jié)合位點(diǎn)(Acceptor substrate-binding pocket)(圖2-B菱形)

2.2.2 Vc3GT編碼蛋白的性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用ProtParam在線網(wǎng)站,分析Vc3GT的理化性質(zhì),發(fā)現(xiàn)Vc3GT含有456個(gè)氨基酸,其中亮氨酸(Leu)和絲氨酸(Ser)最多,均占總體的8.8%,其次為纈氨酸,占8.6%。蛋白的分子式為C2279H3521N595O650S15,相對(duì)分子質(zhì)量為50 136.52,理論等電點(diǎn)(pI)為6.14,帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)為48,帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)為42,不穩(wěn)定系數(shù)為43.16(>40),推測(cè)Vc3GT可能為不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白激酶催化的把ATP等的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)特定氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)上的過(guò)程,通過(guò)NetPhos 3.1預(yù)測(cè)Vc3GT的磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),Vc3GT可能含有37個(gè)磷酸化位點(diǎn),包括25個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn),8個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),和4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

對(duì)蛋白質(zhì)的親/疏水性的預(yù)測(cè)可以反映蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的折疊情況和蛋白質(zhì)中區(qū)域跨膜的傾向與結(jié)合蛋白傾向。利用ProtScal在線分析網(wǎng)站預(yù)測(cè)Vc3GT的親水性和疏水性,大于0.5的區(qū)域?yàn)槭杷畢^(qū),小于-0.5的區(qū)域?yàn)橛H水區(qū),在0.5和-0.5之間的區(qū)域?yàn)閮尚詤^(qū)域(圖3-A)。親水指數(shù)越大,說(shuō)明該氨基酸疏水性越強(qiáng),小于零為親水蛋白,Vc3GT蛋白總平均親水指數(shù)為-0.029,推測(cè)為親水蛋白。信號(hào)肽一般是由15～30個(gè)氨基酸組成的肽鏈,在蛋白的亞細(xì)胞定位中起重要的作用,采用在線工具SignalP 5.0預(yù)測(cè)Vc3GT的信號(hào)肽,結(jié)果顯示,該蛋白可能無(wú)信號(hào)肽(圖3-B)。利用TMHMM進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果顯示,Vc3GT無(wú)明顯跨膜域(圖3-C)。

A.預(yù)測(cè)Vc3GT為親水性蛋白;B.Vc3GT蛋白無(wú)信號(hào)肽;C.Vc3GT蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。A.Vc3GT is predicted to be a hydrophilic protein;B.Vc3GT has no signal peptide;C.Vc3GT has no transmembrane region.圖3 Vc3GT蛋白親/疏水性、蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Hydrophilic/hydrophobic analysis, signal peptide prediction and transmembrane region prediction of Vc3GT

2.2.3 Vc3GT蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA在線網(wǎng)站分析Vc3GT的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋(Hh)、延伸鏈(Ee)、β-轉(zhuǎn)角(Tt)和無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)4種結(jié)構(gòu)形式組成,其中α-螺旋占比最高,達(dá)40.13%,其次為無(wú)規(guī)則卷曲,占37.72%,延伸鏈占16.67%,β-轉(zhuǎn)角占5.48%,這些結(jié)構(gòu)散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中(圖4-A)。

A:藍(lán)色.α-螺旋,紅色.延伸鏈,綠色.β-轉(zhuǎn)角,黃色.無(wú)規(guī)則卷曲;B.葡萄3GT蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)(PDB ID:2C1X);C.Vc3GT蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。A:Blue.α-helix, Red.Extended chain, Green.β-turn, Yellow.Random coiling;B.Tertiary structure of grape 3GT(PDB ID: 2C1X);C.Prediction of tertiary structure for Vc3GT.圖4 Vc3GT蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Structure prediction of Vc3GT

利用SWISS-MODLE在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)Vc3GT的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4-B),Vc3GT蛋白模型未形成多聚體和配體結(jié)構(gòu),且與葡萄中的3GT蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(PDB ID:2C1X)(圖4-C)最為相似,相似性為 56.70%。

2.2.4 Vc3GT氨基酸聚類分析 通過(guò)MEGA 7.0軟件的鄰近結(jié)合法(Neighbor-Joining,NJ)比較不同植物中的3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)和5-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(5GT)之間的親緣關(guān)系,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap初始值設(shè)定為1 000。節(jié)點(diǎn)數(shù)字為自展值(Bootstrap value),用于評(píng)估該分支的可信度,數(shù)值越大表示可信度越高(圖5)。這些蛋白可以聚類為兩個(gè)大類:第一類為3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶,第二類為5-O-糖基轉(zhuǎn)移酶。另外,蘋果、馬鈴薯和水稻中3GT具有2個(gè)拷貝。結(jié)果顯示,Vc3GT與雙子葉植物中3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶同源性高于單子葉植物(水稻、玉米、大麥)。Vc3GT與獼猴桃同源關(guān)系最近,同源性為67%。蘋果和馬鈴薯中3GT的雙拷貝之間的同源性反而較低,說(shuō)明在部分物種中,3GT并不是通過(guò)直接復(fù)制實(shí)現(xiàn)的多拷貝。

圖5 Vc3GT氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 The phylogenetic tree was constructed using the amino acid sequence of Vc3GT in multiple species

2.2.5 分子對(duì)接模擬 通過(guò)ATB網(wǎng)站下載的矢車菊素構(gòu)象,將Vc3GT與矢車菊素進(jìn)行模擬對(duì)接,獲得兩者能量最低時(shí)的結(jié)合位點(diǎn)(圖6-A),該模型所對(duì)應(yīng)的模擬相互作用力二維平面結(jié)果顯示Vc3GT可能主要通過(guò)第17位苯丙氨酸(Phe)、第18位絲氨酸(Ser)、第51位蘇氨酸(Thr)、第84位天冬氨酸(Asp)、第85位異亮氨酸(Ile)和第282位纈氨酸(Val)殘基與矢車菊素對(duì)接(圖6-B)。從對(duì)接結(jié)果可以看出,Vc3GT與底物矢車菊素之間可能存在傳統(tǒng)的氫鍵作用力、Pi-Sigma神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作用力、Pi-Pi T-shaped相互作用力和Pi-Alkyl相互作用力。

A.Vc3GT酶和矢車菊素分子對(duì)接最低能量模型;B.Vc3GT酶和矢車菊素分子對(duì)接存在的模擬相互作用力及二維結(jié)果。A.The lowest energy model of molecular docking between Vc3GT and cyanidin;B.Simulated interaction and two-dimensional results were shown using molecule docking between Vc3GT and cyanidin.圖6 Vc3GT和矢車菊素分子對(duì)接模擬Fig.6 Simulation of docking between Vc3GT and cyanidin

2.2.6Vc3GT基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè) 利用PLANTCARE啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站,分析Vc3GT上游約1 500 bp內(nèi)的順式作用元件,發(fā)現(xiàn)Vc3GT上游區(qū)域含有啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子核心元件CAAT區(qū)和TATA區(qū)。另外,還含有MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), ACE、G-Box、GT1-motif、Box 4、TCCC-motif、Sp1和TCT-motif、I-box等光響應(yīng)元件,DRE1、WRE3與STRE等非脅迫響應(yīng)元件以及P-box、TCA-element、ABRE和TGA-element等脅迫相關(guān)激素的響應(yīng)元件。根據(jù)以上分析結(jié)果可以推測(cè),Vc3GT表達(dá)可能受到光、脅迫、激素等多種信號(hào)的調(diào)控,從而影響植物花青素的合成(表1)。

表1 Vc3GT啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)Tab.1 Prediction of cis-acting elements in the promoter region of Vc3GT

3 結(jié)論與討論

花青素屬黃酮類化合物,顏色鮮艷。植物中花青素的合成途徑涉及多種酶的功能,在苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸羥化酶(C4H)和4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)的連續(xù)催化下苯丙氨酸轉(zhuǎn)化形成香豆酰輔酶A[18-19]。查爾酮合成酶(CHS)催化香豆酰輔酶A,形成黃色的查爾酮[20],隨后在查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的作用下異構(gòu)化,形成黃烷酮[21]。黃烷酮在黃烷酮-3-羥化酶(F3H)的作用下生成二氫黃烷酮[22],二羥黃酮醇還原酶(DFR)隨后發(fā)揮作用,催化產(chǎn)生無(wú)色花青素,即原花青素[23]。原花青素在花色素合酶(ANS)的催化作用下,轉(zhuǎn)化為有色的花青素,但此時(shí)生成的花青素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。最后3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)發(fā)揮作用,花青素經(jīng)糖基化形成穩(wěn)定的花色苷[24-25],這時(shí)生成的花色苷會(huì)轉(zhuǎn)移到植物液泡中,這一步驟在增加花青素的穩(wěn)定性的同時(shí)也增加了水溶性。

本研究克隆獲得藍(lán)莓3GT基因,發(fā)現(xiàn)該基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,CDS全長(zhǎng)1 371 bp,編碼456個(gè)氨基酸。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè),Vc3GT可能含有37個(gè)磷酸化位點(diǎn),可能為親水性蛋白,無(wú)跨膜區(qū)和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域,二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等組成。Vc3GT具有植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族(GTB-型)的典型結(jié)構(gòu)域,GTB蛋白具有不同的N-和C-末端結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)典型的Rossmann折疊,這2個(gè)結(jié)構(gòu)域具有高度的結(jié)構(gòu)同源性,但序列同源性很低[26]。Vc3GT C-末端含有由44個(gè)氨基酸組成的PSPG-box特征性結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域的最后一位是組氨酸,推測(cè)Vc3GT的糖基供體是UDP-半乳糖。Vc3GT與獼猴桃中的3GT親緣關(guān)系最近,同源性為67%。通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)Vc3GT和矢車菊素之間可能存在傳統(tǒng)的氫鍵作用力,Pi-Sigma神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作用力,Pi-Pi T-shaped相互作用力和Pi-Alkyl相互作用力。

光照、脅迫等對(duì)植物花青素的合成具有調(diào)控作用。Vc3GT是藍(lán)莓花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶,基因的表達(dá)模式受啟動(dòng)子順式作用元件的調(diào)控,Vc3GT啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)存在14個(gè)光響應(yīng)元件,推測(cè)Vc3GT的表達(dá)受到光照的影響,已有研究證實(shí)光能夠誘導(dǎo)花青素的合成,一般來(lái)說(shuō),光照對(duì)花青素的積累具有正向調(diào)控作用,尤其是藍(lán)光和紫外光[27]。在花青素積累時(shí)期3GT基因的表達(dá)上調(diào)也間接表明,Vc3GT表達(dá)量的增加可能與光照有關(guān)。有研究表明,血橙在4 ℃貯藏時(shí)果皮中的UFGT基因表達(dá)量顯著增強(qiáng),花青素的含量也隨之增多[28]。對(duì)葡萄卷葉病的研究發(fā)現(xiàn),干旱情況下,MYBA1和UFGT的表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致感染葡萄卷葉病相關(guān)病毒3(GLRaV-3)后葉片變紫的癥狀增強(qiáng)。Vc3GT轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)有4個(gè)脅迫響應(yīng)元件,推測(cè)脅迫環(huán)境下可能會(huì)增強(qiáng)Vc3GT的表達(dá),與上述研究結(jié)果一致。有研究表明,脫落酸(ABA)處理能夠促進(jìn)蘋果果皮葉綠素降解和花青苷合成[29],而ABA合成抑制劑處理蘋果果實(shí)會(huì)抑制花青苷的積累[30]。適當(dāng)濃度的茉莉酸[31]和細(xì)胞分裂素[32]處理也能夠促進(jìn)花色苷的生物積累,高濃度的生長(zhǎng)素[33]抑制花青苷的合成。Vc3GT上游區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)有6個(gè)激素響應(yīng)元件,由此可見(jiàn)脫落酸、生長(zhǎng)素、赤霉素和水楊酸均能影響Vc3GT的表達(dá)。此外該啟動(dòng)子區(qū)序列還存在 MYB轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別位點(diǎn),在花青素生物合成途徑中,MYB轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是最重要的調(diào)控因子,所有花青素生物合成途徑中的基因均是其下游基因[34]。

3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶是催化活化糖基從UDP-葡萄糖(或UDP-半乳糖)轉(zhuǎn)移到花青素的3-羥基或5-羥基處的一類轉(zhuǎn)移酶。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明3GT是花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,該基因的表達(dá)強(qiáng)度嚴(yán)重影響花青素的生成,與控制其他酶相比,控制3GT活性更能調(diào)控花青素的積累。本研究克隆得到了藍(lán)莓3GT基因,通過(guò)在線網(wǎng)站和預(yù)測(cè)軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè),旨在為研究該基因的特征和功能,為后續(xù)進(jìn)一步研究糖基轉(zhuǎn)移酶的作用及花青素異源合成研究提供基礎(chǔ)。