枯萎病菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗生長(zhǎng)及生理的影響

劉 佳，柴改鳳，郭風(fēng)清，張樹(shù)武，徐秉良

（甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室·甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 蘭州 730070）

美洲南瓜（Cucurbita pepo）是葫蘆科南瓜屬一年生蔓性草本植物，因其營(yíng)養(yǎng)成分種類(lèi)多，藥用和食用價(jià)值極高，在我國(guó)很多地區(qū)都有種植[1-2]。甘肅省武威市是美洲南瓜重要的育種基地，美洲南瓜也是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)作物之一，生產(chǎn)的南瓜籽遠(yuǎn)銷(xiāo)海外[3]。

瓜類(lèi)枯萎?。‵usariumwilt）是由鐮孢菌引起的土傳病害，也是瓜類(lèi)生產(chǎn)中的毀滅性病害[4]。其中，以西瓜發(fā)病最為嚴(yán)重，其次是南瓜，一般發(fā)病率為20%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)80%[5]，有時(shí)在連作地甚至造成全田死亡。因此，瓜類(lèi)枯萎病是瓜類(lèi)生產(chǎn)上的一大難題，也是限制美洲南瓜生產(chǎn)的重要因素之一[6]。前人研究表明，引起甘肅省武威市美洲南瓜枯萎病的致病菌為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）[5]。

鐮孢菌引起植物發(fā)生枯萎病的生理水平上致病機(jī)制，一種是導(dǎo)管阻塞，另一種是致病毒素。鐮孢菌產(chǎn)生的毒素-鐮刀菌酸損傷宿主植物根系細(xì)胞膜，增強(qiáng)細(xì)胞的通透性，同時(shí)降低線粒體活性氧的含量、阻止ATP 合成，從而導(dǎo)致植物根系水分吸收受阻，生長(zhǎng)受到抑制[7]。目前發(fā)現(xiàn)的鐮孢菌可以產(chǎn)生最重要的3 類(lèi)真菌毒素（伏馬菌素、單端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮），也能夠產(chǎn)生包括恩鐮孢菌素、串珠鐮刀菌素和白僵菌素在內(nèi)的新型真菌毒素[8]。

同一種鐮孢菌在人工培養(yǎng)基和植物體內(nèi)的產(chǎn)毒種類(lèi)可能存在差異，同時(shí)在人工培養(yǎng)條件下的產(chǎn)毒能力也受到培養(yǎng)基成分、溫度、濕度等環(huán)境條件的影響[9-10]。如苦瓜枯萎病菌毒素發(fā)酵的最佳培養(yǎng)液為Czapek 培養(yǎng)液，最佳培養(yǎng)時(shí)間為14 d，裝液為100 mL。該毒素發(fā)酵濾液在高溫高壓下具有較好的穩(wěn)定性[11]。

也有研究結(jié)果表明，擬輪枝鐮孢菌毒素粗提液對(duì)玉米不同品種的發(fā)芽率、幼苗生長(zhǎng)均有顯著影響[12]?？浊扒暗萚13]研究表明，尖孢鐮孢菌QD3-2 產(chǎn)生的毒素對(duì)苜蓿種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)均具有抑制作用。莊敬華等[14]研究發(fā)現(xiàn)甜瓜枯萎病菌毒素粗提液對(duì)甜瓜胚根的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，誘發(fā)甜瓜幼苗表現(xiàn)典型的枯萎病萎蔫癥狀，推測(cè)該病原菌產(chǎn)生的粗毒素中含有甜瓜生長(zhǎng)的抑制性物質(zhì)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮孢菌侵入寄主后分泌的毒素物質(zhì)，改變了寄主植物細(xì)胞膜的透性、抑制植物根的生長(zhǎng)，而低量毒素又能誘導(dǎo)植物合成植保素[15]。陳慧杰等[16]研究表明，菊花枯萎病菌毒素可抑制切花菊幼苗根、莖的正常生長(zhǎng)，增加幼苗根系的細(xì)胞膜透性以及根系組織中可溶性糖、脯氨酸和MDA 的含量，在短時(shí)間內(nèi)提高根系保護(hù)酶POD、PAL 和PPO 活性。有關(guān)美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)生毒素的培養(yǎng)條件以及毒素粗提液對(duì)幼苗影響的研究相對(duì)較少。

因此，筆者通過(guò)探究影響美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)毒的各項(xiàng)培養(yǎng)條件，研究病原菌產(chǎn)生的毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗生長(zhǎng)和生理的影響，以期為探索美洲南瓜枯萎病菌致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥品及試劑盒 馬鈴薯、葡萄糖、自來(lái)水、KNO3、蔗糖、蛋白胨、無(wú)菌水、KH2PO4、MgSO4、NaNO3、KCl、FeSO4、瓊脂等。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.1.2 供試儀器和用具 超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、pH 計(jì)、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、滅菌鍋、電導(dǎo)儀、電子天平、搖床、烘箱、各種量程的移液器及吸頭、各種規(guī)格的離心管、研缽、錘形瓶、96 孔UV 板、圓形玻璃瓶等。

1.1.3 供試病原菌及品種 試驗(yàn)于2020 年6

月至2021 年5 月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。植物供試病原菌：美洲南瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum，尖孢鐮孢菌），是甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害及生物防治課題組前期從甘肅省武威市金蘋(píng)果有限責(zé)任公司種質(zhì)資源試驗(yàn)基地患枯萎病的美洲南瓜中分離得到，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定與保存。供試美洲南瓜品種：金蘋(píng)果2 號(hào)，由甘肅省武威市金蘋(píng)果有限責(zé)任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的純化 用接種針從菌種凍存管中挑取美洲南瓜枯萎病菌，在PDA 培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種接種，接種5～10 皿，轉(zhuǎn)移至25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌毒素粗提液的制備 取純化好的病原菌，用直徑為0.7 cm 的打孔器打取菌餅，用接種環(huán)接入150 mL 三角瓶80 mL 培養(yǎng)液中，進(jìn)行滅菌處理，滅菌后在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行操作，每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)用接種環(huán)接入8 個(gè)菌餅，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。將三角瓶放在28 ℃、180 r·min-1的恒溫?fù)u床中連續(xù)震蕩15 d 后，將培養(yǎng)液中的菌絲體用紗布過(guò)濾掉，接著用6 層紗布進(jìn)行過(guò)濾，準(zhǔn)備若干50 mL 離心管，將毒素濾液收集其中，3000 r·min-1離心30 min，最后棄去沉淀，將上清液裝在另一個(gè)離心管中，置于沸水浴中水浴10 min，得到毒素粗提液[17]。

1.2.3 培養(yǎng)液對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 設(shè)置3 種不同培養(yǎng)液：理查（Richard）培養(yǎng)液，硝酸鉀5.00 g，硫酸亞鐵5 mg、磷酸二氫鉀2.50 g、蔗糖2.50 g、硫酸鎂0.25 g、蒸餾水500 mL；改良察氏（Czapek）培養(yǎng)液，蔗糖15.00 g、硝酸鈉1.00 g、磷酸二氫鉀0.50 g、氯化鉀0.25 g、硫酸亞鐵5 mg、硫酸鎂5 mg、蒸餾水500 mL；察氏蛋白胨（PSC）培養(yǎng)液，蔗糖15.00 g、硫酸鎂0.25 g、蛋白胨5.00 g、磷酸二氫鉀0.50 g、硫酸亞鐵5 mg、氯化鉀0.25 g、蒸餾水500 mL；以馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液為對(duì)照培養(yǎng)液，即葡萄糖10.00 g、馬鈴薯100 g、蒸餾水500 mL。

將病原菌菌餅接種于上述3 種不同培養(yǎng)液和對(duì)照培養(yǎng)液（PD 培養(yǎng)液）中，振蕩培養(yǎng)（25 ℃，15 d），制備毒素粗提液，處理催芽的美洲南瓜種子，人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測(cè)定美洲南瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 在1.2.3 篩選出的最佳培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上（下同），將接有菌餅的培養(yǎng)液于25 ℃震蕩培養(yǎng)5、10、15、20、25 d，培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間時(shí)制備毒素粗提液，處理催芽的美洲南瓜種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測(cè)定美洲南瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.5 培養(yǎng)方式對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 將接有菌餅的培養(yǎng)液置于25 ℃搖床中，設(shè)置全天振蕩培養(yǎng)、振蕩12 h+靜置12 h、全天靜置3 種處理，每組培養(yǎng)15 d，制備毒素粗提液，處理催芽的美洲南瓜種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測(cè)定美洲南瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.7 光照對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 將接有菌餅的培養(yǎng)液在25 ℃下，分別在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光暗交替處理下振蕩培養(yǎng)15 d，制備毒素粗提液，處理催芽的美洲南瓜種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測(cè)定美洲南瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.8 毒素粗提液的熱穩(wěn)定性測(cè)定 將制備好的毒素粗提液設(shè)置高溫處理（121 ℃滅菌，20 min）和不進(jìn)行高溫處理兩種。處理后處理催芽的美洲南瓜種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（28 ℃，48 h），測(cè)定美洲南瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率，試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.9 胚根的生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定方法 美洲南瓜種子用清水充分沖洗干凈，然后用1%的次氯酸鈉溶液處理種子表面，清水充分沖洗，將種子裝在燒杯中，倒入超過(guò)種子2/3 的蒸餾水，設(shè)置水浴鍋溫度為55～60 ℃，種子在水浴鍋中水浴10 min，其間不斷攪拌，水浴后取出攪拌至水溫至室溫，將種子置于28 ℃恒溫箱浸泡4～5 h 后，將種子平鋪在底層鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃的人工氣候恒溫箱內(nèi)進(jìn)行催芽處理（芽長(zhǎng)長(zhǎng)度為2～3 mm 時(shí)），將美洲南瓜種子胚芽向下均勻放在鋪滿(mǎn)無(wú)菌濾紙且滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，用移液槍加5 mL 毒素粗提液于培養(yǎng)皿內(nèi)的美洲南瓜種子。以空白培養(yǎng)液處理為對(duì)照。25 ℃下培養(yǎng)，48 h 后測(cè)定并計(jì)算胚根生長(zhǎng)抑制率。每處理20 粒種子，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

胚根生長(zhǎng)抑制率/%=（對(duì)照胚根長(zhǎng)度－處理胚根長(zhǎng)度）/對(duì)照胚根長(zhǎng)度×100。（1）

1.2.10 病原菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗生長(zhǎng)及生理的影響 選取長(zhǎng)勢(shì)一致的美洲南瓜幼苗小心取出，清洗干凈，輕剪傷根，浸入設(shè)置的不同倍數(shù)毒素粗提液中，毒素粗提液設(shè)置5 個(gè)不同梯度：100%、80%、60%、40%、20%毒素粗提液各10 mL；以蒸餾水10 mL 為對(duì)照。在上述粗提液中處理24 h 后，將植株移栽入塑料杯中，分別于5、7、9、11、13 d 取樣測(cè)定美洲南瓜幼苗相關(guān)生理指標(biāo)。每個(gè)處理20株，3 次重復(fù)。

（1）美洲南瓜幼苗株高、莖粗、根長(zhǎng)的測(cè)定：用直尺測(cè)量美洲南瓜幼苗的株高和根長(zhǎng)，游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗的莖粗，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

（2）美洲南瓜幼苗葉片和根系電導(dǎo)率的測(cè)定：將幼苗的葉片和根系洗凈晾干，取1 g 葉片或者根系放入裝有10 mL 超純水的試管內(nèi)，靜置12 h，測(cè)定每管電導(dǎo)率，再在沸水浴30 min，之后測(cè)定每管的電導(dǎo)率，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

細(xì)胞膜透性=35 ℃水浴條件下外滲液的電導(dǎo)率值/沸水浴條件下外滲液的電導(dǎo)率值×100%。（2）

（3）美洲南瓜幼苗葉片PAL 酶活性和MDA 含量的測(cè)定：均參照相應(yīng)的活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

從國(guó)外電力市場(chǎng)運(yùn)行目標(biāo)來(lái)看：其總收益要補(bǔ)償所有需量機(jī)組的總成本。對(duì)應(yīng)到云南煤電機(jī)組，其在系統(tǒng)中的作用主要為保安全和枯水期備用，所以保安全的機(jī)組和枯水期備用容量機(jī)組的全成本需要得到補(bǔ)償。目前由于云南省內(nèi)能量市場(chǎng)尚不完善，能量市場(chǎng)不足以補(bǔ)償?shù)牟糠謶?yīng)設(shè)定一定的補(bǔ)償機(jī)制進(jìn)行補(bǔ)償，以彌補(bǔ)電能市場(chǎng)的不足。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，差異顯著性分析依據(jù)LSD 最小顯著性差異法，由SPSS 21.0 專(zhuān)業(yè)版完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)毒的影響

2.1.1 培養(yǎng)液對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 由圖1 可知，美洲南瓜枯萎病菌最適宜產(chǎn)毒的培養(yǎng)液是Czapek培養(yǎng)液，對(duì)美洲南瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率為67.51%，其次是PD 培養(yǎng)液，胚根生長(zhǎng)抑制率為47.71%。Czapek 培養(yǎng)液對(duì)胚根生長(zhǎng)抑制率與PD培養(yǎng)液、PSC 培養(yǎng)液和Richard 培養(yǎng)液對(duì)胚根生長(zhǎng)抑制率差異顯著。

圖1 培養(yǎng)液對(duì)美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)毒的影響

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 由圖2 可知，美洲南瓜枯萎病菌在Czapek 培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d時(shí)，毒素粗提液對(duì)美洲南瓜胚根生長(zhǎng)抑制率為19.78%，培養(yǎng)10 d 時(shí)胚根生長(zhǎng)抑制率上升至28.17%。培養(yǎng)15 d 時(shí)，毒素粗提液對(duì)美洲南瓜胚根生長(zhǎng)抑制率的影響最大，胚根生長(zhǎng)抑制率達(dá)到67.17%，此時(shí)的胚根抑制率是培養(yǎng)5 d 時(shí)的3.40倍。培養(yǎng)20 d 和25 d 時(shí)，毒素粗提液對(duì)美洲南瓜胚根生長(zhǎng)抑制率分別為41.45%和48.25%，不同處理間差異均顯著。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)毒的影響

2.1.3 培養(yǎng)方式對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 由表1 可知，美洲南瓜枯萎病菌在Czapek 培養(yǎng)液中，全天振蕩培養(yǎng)方式下，毒素粗提液對(duì)美洲南瓜種子具有明顯抑制作用，胚根生長(zhǎng)抑制率最高，為73.67%，振蕩12 h+靜置12 h 培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)下，胚根生長(zhǎng)抑制率依次降低。3 種培養(yǎng)方式的胚根生長(zhǎng)抑制率存在顯著差異。

表1 培養(yǎng)方式對(duì)美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)毒的影響

2.1.4 pH 值對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 由圖3 可知，pH 值為4～6 時(shí)，病原菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜的胚根抑制率分別為51.12%、48.40%、52.24%，3 個(gè)處理間差異不顯著。pH 值為7 時(shí)毒素粗提液對(duì)美洲南瓜胚根生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，胚根生長(zhǎng)抑制率為69.26%，與pH 值為4～6 的3 個(gè)處理差異顯著。

圖3 pH 值對(duì)美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)毒的影響

2.1.5 光照對(duì)病原菌產(chǎn)毒的影響 由圖4 可知，美洲南瓜枯萎病菌在連續(xù)黑暗、12 h 光暗交替和連續(xù)光照3 種方式下培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素粗提液均對(duì)美洲南瓜胚根有抑制作用。其中，在連續(xù)光照條件下最有利于產(chǎn)毒，胚根生長(zhǎng)抑制率為65.57%，相比連續(xù)黑暗和12 h 光暗交替培養(yǎng)時(shí)，胚根生長(zhǎng)抑制率分別提高109.22%和176.43%，連續(xù)光照和其他2 個(gè)處理差異顯著。

圖4 光照對(duì)美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)毒的影響

2.1.6 毒素粗提液的熱穩(wěn)定性 由表2 可知，高溫滅菌的病原菌毒素粗提液處理美洲南瓜胚根生長(zhǎng)抑制率為43.32%，未經(jīng)高溫滅菌處理的胚根生長(zhǎng)抑制率為44.75%。高溫滅菌的病原菌毒素粗提液和未經(jīng)高溫滅菌的毒素粗提液處理美洲南瓜種子胚根生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著差異，表明毒素粗提液的熱穩(wěn)定性較好。

表2 病原菌毒素粗提液的熱穩(wěn)定性

2.2 美洲南瓜枯萎病菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗生長(zhǎng)及生理的影響

2.2.1 病原菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗株高莖粗的影響 純毒素粗提液（100%）處理的美洲南瓜幼苗全部枯萎死亡，對(duì)其他4 個(gè)處理和對(duì)照進(jìn)行比較分析。由圖5-A 可知，幼苗株高均呈現(xiàn)隨著毒素粗提液處理濃度的增加逐漸下降趨勢(shì)。在處理第5天時(shí)，對(duì)照處理的美洲南瓜幼苗的株高最高，為124.52 mm，80%毒素粗提液處理下幼苗的株高最低，為102.34 mm，4 個(gè)毒素粗提液處理間株高存在顯著性差異。處理13 d 時(shí)，對(duì)照處理下幼苗株高最高，為146.22 mm，而80%毒素粗提液處理下株高僅為110.31 mm，相差35.91 mm，各處理間株高存在顯著差異。

由圖5-B 可知，幼苗莖粗均呈現(xiàn)隨著毒素粗提液處理濃度的增加呈逐漸下降趨勢(shì)，病原菌毒素粗提液濃度越大，對(duì)幼苗莖粗的影響也越大。在處理第5 天時(shí)，80%毒素粗提液處理下莖粗最小，為3.37 mm，對(duì)照處理幼苗莖粗最大，為4.28 mm，各處理間莖粗差異顯著。處理13 d 時(shí)，對(duì)照莖粗顯著高于4 個(gè)毒素粗提液處理，20%和40%毒素粗提液處理下莖粗差異不顯著，但均顯著高于60%和80%毒素粗提液處理。

由圖5-C 可知，幼苗根長(zhǎng)均呈現(xiàn)隨著毒素粗提液處理濃度的增加逐漸下降趨勢(shì)，且各處理間根長(zhǎng)差異顯著。處理第5 天時(shí)，80%毒素粗提液處理下的根長(zhǎng)為103.74 mm，與對(duì)照相比降低60.92 mm。處理第13 天時(shí)，80%毒素粗提液處理下幼苗根長(zhǎng)為119.14 mm，與對(duì)照相比降低了93.98 mm。

圖5 枯萎病菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗株高、莖粗及根長(zhǎng)的影響

2.2.2 病原菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗根系和葉片細(xì)胞膜透性的影響 由表3、4 可以看出，除40%毒素粗提液處理7 d 的美洲南瓜幼苗根系外，毒素粗提液濃度越大，幼苗根系或葉片的電導(dǎo)率越高，細(xì)胞膜透性也相對(duì)越高。處理11 d 時(shí)，80%毒素粗提液處理下，美洲南瓜幼苗根系和葉片的細(xì)胞膜透性分別達(dá)到了62.71%和62.31%，均顯著高于其他濃度毒素粗提液處理，且與對(duì)照差異顯著。

表3 枯萎病菌毒素對(duì)美洲南瓜幼苗根系細(xì)胞膜透性的影響%

表4 枯萎病菌毒素對(duì)美洲南瓜幼苗葉片細(xì)胞膜透性的影響%

2.2.3 病原菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗葉片丙二醛（MDA）含量的影響 由圖6 可知，在各處理時(shí)間，美洲南瓜葉片中MDA 含量均呈現(xiàn)隨毒素粗提液處理濃度的增大逐漸增高趨勢(shì)，在相同處理時(shí)間時(shí)，毒素粗提液濃度越大，MDA 含量越高。處理11 d時(shí)，60%和80%毒素粗提液下的葉片MDA 含量分別為29.57 μmol·g-1和31.49 μmol·g-1，分別為對(duì)照的2.45 倍和2.61 倍，均顯著高于其他濃度處理。

2.2.4 病原菌毒素粗提液對(duì)美洲南瓜幼苗葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響 由圖7 可以看到，隨著處理時(shí)間的增加，不同濃度毒素粗提液處理的美洲南瓜葉片中PAL 活性均呈現(xiàn)先逐漸升高后降低的趨勢(shì)，且均在11 d 時(shí)達(dá)到峰值。處理第11 天時(shí)，80%毒素粗提液處理下葉片PAL 活性最高，為84.25 U·g-1，是對(duì)照處理PAL 酶活性的2.09 倍。在相同處理天數(shù)時(shí)，毒素粗提液濃度越大，PAL 活性越高。

3 討論與結(jié)論

尖孢鐮孢菌毒素的粗提取和產(chǎn)毒條件的篩選，是研究枯萎病致病機(jī)制的理論基礎(chǔ)，也是致病毒素研究中的熱點(diǎn)[15]。最佳產(chǎn)毒條件的篩選，對(duì)于研究病原菌產(chǎn)毒至關(guān)重要，而影響病原菌產(chǎn)毒的關(guān)鍵因素是培養(yǎng)液的種類(lèi)[18]。前人研究表明培養(yǎng)液不同，產(chǎn)毒量也不同，如向日葵黃萎病菌在Czapek 培養(yǎng)液培養(yǎng)，以獲得毒素粗提液[19]；香蕉枯萎病菌在Richard 培養(yǎng)液中產(chǎn)毒能力最強(qiáng)[20]。

除了培養(yǎng)液影響產(chǎn)毒的多少外，其他因素如培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)液的酸堿度、培養(yǎng)溫度等對(duì)病原菌產(chǎn)毒也有很大的影響[21]。前人研究發(fā)現(xiàn)，大豆根腐病菌產(chǎn)毒的最適條件是在25 ℃、連續(xù)振蕩培養(yǎng)15 d，而培養(yǎng)基的種類(lèi)和光照影響不大[22]；玉米穗腐病菌產(chǎn)毒的最適條件是25 ℃、pH 值為5 的Richard 培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d[23]；玉米苗枯病菌的最佳產(chǎn)毒條件為25 ℃、pH 值為9 的PD 培養(yǎng)液、12 h 光暗交替培養(yǎng)10 d[24]；赤霉病菌在PD 培養(yǎng)液中，25～30 ℃培養(yǎng)15 d 具有較強(qiáng)的產(chǎn)毒能力，光照和連續(xù)振蕩培養(yǎng)有利于產(chǎn)毒，但pH 值對(duì)產(chǎn)毒影響不顯著[25]；27 ℃最有利于番茄枯萎病菌產(chǎn)毒[26]。番茄褐斑病菌最佳產(chǎn)毒條件為光照12 h、25 ℃、pH 值為6 時(shí)、振蕩培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)基對(duì)病原菌產(chǎn)毒能力影響不顯著[27]。由此可知，病原物的產(chǎn)毒條件根據(jù)病原菌的特性不同而異，相同的病原菌產(chǎn)毒的條件亦存在差異，發(fā)病寄主不同，產(chǎn)毒量也不同。筆者研究發(fā)現(xiàn)，美洲南瓜枯萎病菌在Czapek 培養(yǎng)液中，pH 值為7 時(shí)，連續(xù)光照條件下振蕩培養(yǎng)15 d，產(chǎn)生的毒素粗提液對(duì)美洲南瓜種子的胚根生長(zhǎng)抑制率最高。

田雪亮等[28]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜枯萎病菌粗毒素對(duì)黃瓜胚根生長(zhǎng)和側(cè)根分化均有抑制作用，且隨著毒素粗提液處理濃度的升高，抑制現(xiàn)象越明顯。黃銘慧等[29]研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮孢菌粗毒素對(duì)大豆不同抗性品種的胚根生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用，25%的毒素粗提液明顯抑制了大豆感病品種胚根的伸長(zhǎng)和側(cè)根的生長(zhǎng)。筆者的研究也得到相似的研究結(jié)果，美洲南瓜枯萎病菌毒素粗提液處理能夠抑制美洲南瓜幼苗根、莖的生長(zhǎng)，且抑制程度與病原菌毒素粗提液濃度呈正相關(guān)，80%的病原菌毒素粗提液對(duì)植株的抑制效果最強(qiáng)。

MDA 含量的變化與細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度的高低呈正相關(guān)，因此，MDA 含量常被作為膜脂過(guò)氧化指標(biāo)之一[30]。筆者的試驗(yàn)結(jié)果表明，美洲南瓜在受到枯萎病菌毒素粗提液處理時(shí)，葉片中MDA 含量上升，且毒素粗提液處理濃度越高，MDA 含量越高。說(shuō)明美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)生的毒素粗提液使寄主植物細(xì)胞的質(zhì)膜系統(tǒng)受到損傷，影響了植物正常的生理活動(dòng)。80%毒素粗提液處理下，美洲南瓜幼苗根系和葉片的細(xì)胞膜透性分別達(dá)到了62.71%和62.31%，均顯著高于對(duì)照，這與陳慧杰等[16]的研究結(jié)果一致。說(shuō)明病原菌毒素粗提液破壞了美洲南瓜根系和葉片的細(xì)胞膜，導(dǎo)致組織細(xì)胞膜透性增大，對(duì)幼苗造成了一定程度的傷害。40%毒素粗提液處理第7 天，美洲南瓜幼苗根系細(xì)胞膜透性短暫降低，第9 天細(xì)胞膜透性又迅速上升，分析原因可能是美洲南瓜幼苗對(duì)毒素粗提液影響的感應(yīng)略微滯后。

參與植物體內(nèi)多種生理代謝過(guò)程的苯丙氨酸解氨酶（PAL）與植物防衛(wèi)反應(yīng)及抗病性密切相關(guān)，是衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)的重要指標(biāo)[31]。孫淑琴等[32]研究表明草坪草高羊茅葉片經(jīng)草坪草褐斑病菌粗毒素液處理后，PAL 活性均有不同程度的提高，高濃度毒素處理酶活性較低，低濃度毒素處理的酶活性高。筆者的研究結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間的增加，不同濃度病原菌毒素粗提液處理下的美洲南瓜葉片中，PAL 的活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，均在11 d 時(shí)達(dá)到峰值，毒素粗提液的濃度越大，葉片中PAL 的酶活性越高，推測(cè)美洲南瓜枯萎病菌毒素在短期內(nèi)可以通過(guò)提高防御酶活性，提高寄主的抗性。對(duì)于美洲南瓜枯萎病菌產(chǎn)生毒素的類(lèi)型進(jìn)行分析是筆者下一步的主要研究方向。

筆者的研究結(jié)果表明，使用pH 值為7 的Czapek 培養(yǎng)液，在連續(xù)光照、振蕩培養(yǎng)15 d 的條件下，美洲南瓜枯萎病菌可以產(chǎn)生的毒素粗提液對(duì)美洲南瓜胚根的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，并且毒素粗提液有較好的熱穩(wěn)定性。隨著處理時(shí)間的增加，不同濃度的美洲南瓜枯萎病菌毒素粗提液可以抑制美洲南瓜幼苗的生長(zhǎng)，增加幼苗根系和葉片的細(xì)胞膜透性和葉片MDA 含量，一定程度上提升PAL 的酶活性。研究結(jié)果可為揭示美洲南瓜枯萎病菌的致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。