甜瓜未授粉子房超低溫保存方法初探

李海倫，高寧寧，李曉慧，康利允，常高正，梁 慎，王慧穎，徐小利，趙衛(wèi)星

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 鄭州 450002）

甜瓜（Cucumis meloL.）是葫蘆科甜瓜屬一年生草本植物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在全球范圍內(nèi)廣泛種植。甜瓜產(chǎn)業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中占據(jù)重要地位，具有廣闊的前景。目前，甜瓜優(yōu)異種質(zhì)資源更新滯后且無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，因此亟需加速育種工作的進(jìn)度。單倍體培養(yǎng)是創(chuàng)制新種質(zhì)的重要手段，利用甜瓜未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)獲得單倍體，將有效加速甜瓜育種進(jìn)程，其中，材料是培養(yǎng)成功的先決條件。同時(shí)甜瓜離體雌核培養(yǎng)獲取單倍體技術(shù)還處于初級(jí)階段，并未獲得較成熟的技術(shù)，加快培養(yǎng)進(jìn)度需大量的供試材料，而甜瓜未授粉子房的取材受生長(zhǎng)季節(jié)的限制。為解決材料供應(yīng)問(wèn)題，筆者通過(guò)在甜瓜生長(zhǎng)季節(jié)大量取樣，并進(jìn)行超低溫保存，增加供材量和延長(zhǎng)供樣期，從而加速甜瓜單倍體的培育進(jìn)程。

適宜的保存條件可以使細(xì)胞分裂和代謝暫時(shí)處于停滯狀態(tài)從而延長(zhǎng)生命周期，還可以最大程度保持材料的遺傳穩(wěn)定性。其中，超低溫保存方法是將植物的細(xì)胞、組織、器官等離體材料存放于液氮（-196 ℃）中保存[1]，該方法備受青睞，在花粉、莖尖、休眠芽、愈傷組織等離體組織中被廣泛應(yīng)用[2-6]，但對(duì)甜瓜子房的保存鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者的研究結(jié)合包埋法和玻璃化法對(duì)超低溫保存方法進(jìn)行改良，旨在探索最適合甜瓜子房的保存方法，最大限度減少材料損傷，并保持較高的活性，以期加速甜瓜單倍體育種的進(jìn)度，為創(chuàng)制新種質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試厚皮甜瓜品種為晚熟品種眾云18（網(wǎng)紋紅肉）和早熟品種錦繡（白皮紅肉），均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西瓜甜瓜課題室提供。

1.2 設(shè)計(jì)

眾云18 和錦繡于2019 年5 月在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)研究基地連棟大棚種植，采用常規(guī)管理。每個(gè)材料種植20 株。在甜瓜花期，于開(kāi)花前一天09：00—11：00 取長(zhǎng)勢(shì)健壯無(wú)損傷的未授粉子房，帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃暗處理2 d。2 種材料的每一批取樣的樣本數(shù)量相同，每個(gè)處理各取30 個(gè)甜瓜子房，每個(gè)處理每個(gè)材料分別設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3 方法

1.3.1 甜瓜子房消毒滅菌 把2 d 暗處理后的子房用流水沖洗0.5～1.0 h，去除子房表面茸毛，洗凈后在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇消毒30 s，再用無(wú)菌水清洗3 遍，接著用0.2%次氯酸鈉滅菌10 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5 遍，備用。

1.3.2 改良超低溫保存方法建立 （1）預(yù)處理：把子房分別進(jìn)行縱切和橫切，放入0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中，置于培養(yǎng)間中暗培養(yǎng)8、24、48、72、96 h。（2）包埋：取出預(yù)培養(yǎng)的子房，晾干表面液體，用3%海藻酸鈉將子房完全包裹，再用0.1 mol·L-1氯化鈣固定10 min，取出晾干。（3）加載：把包裹的子房放入加載液（1/2 MS+136 g·L-1蔗糖+180 g·L-1甘油）中，處理20 min，取出晾干。（4）脫水：用PVS2 玻璃化液（MS+300 ml·L-1甘油+150 ml·L-1乙二醇+150 ml·L-1二甲基亞砜+136 g·L-1蔗糖）給予30、60、90 min 處理，取出晾干。（5）低溫保存：用無(wú)菌鋁箔紙把處理過(guò)的子房包裹好迅速放入液氮（-196 ℃）中保存。

1.3.3 低溫保存后恢復(fù)培養(yǎng) （1）解凍：將保存0、20、40、60 d 的子房放入25、38、40、42 ℃恒溫的卸載液（MS+410 g·L-1蔗糖）中解凍5 min，最后再用新卸載液清洗一遍，晾干。（2）接種：將解凍的子房接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（MS+0.03 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1KT+150 mL·L-1椰汁+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂）。（3）培養(yǎng)：接種后的子房在黑暗條件下，培養(yǎng)箱中34 ℃熱激3 d，光照度1500～2000 lx、16 h/8 h 光暗周期的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。（4）恢復(fù)培養(yǎng)后甜瓜子房存活率：子房存活率/%=接入子房成活數(shù)/接入子房的總數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016 工具進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析和制圖，采用SPASS 21 軟件進(jìn)行One-way ANOVA 法單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)甜瓜子房存活率的影響

預(yù)培養(yǎng)可通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)含水量和提高細(xì)胞分裂分化能力來(lái)改善材料的生理狀態(tài)，提高材料的抗凍性。筆者通過(guò)高濃度蔗糖溶液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)來(lái)提高超低溫保存后材料的存活率。如圖1 所示，子房預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間不同，超低溫保存后子房的存活率也存在差異。隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，子房的存活率呈先增高后降低的趨勢(shì)。預(yù)培養(yǎng)8 h 時(shí)，冷凍20 d后子房的存活率只有55%左右；預(yù)培養(yǎng)24 h 時(shí)，眾云18 和錦繡的子房存活率分別高達(dá)82.30%和82.80%；預(yù)培養(yǎng)48 h 時(shí)，子房存活率開(kāi)始降到71%左右；預(yù)培養(yǎng)72 h 時(shí)，子房存活率持續(xù)降低到50%左右；預(yù)培養(yǎng)96 h 時(shí)，子房存活率低至45%左右。預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度脫水而造成損傷，進(jìn)而影響子房的存活率。在0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)24 h 和48 h 時(shí)子房存活率的差異不顯著，但24 h 的預(yù)培養(yǎng)極大地縮短了培養(yǎng)時(shí)間，所以預(yù)培養(yǎng)24 h 效果最佳。

圖1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)低溫保存子房存活率的影響

2.2 PVS2 玻璃化液處理時(shí)間對(duì)甜瓜子房存活率的影響

超低溫保存的程序中玻璃化過(guò)程是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，其中，玻璃化液處理時(shí)間也至關(guān)重要。由圖2可知，隨著PVS2 處理時(shí)間的增加，子房?jī)龊蟮拇婊盥手饾u降低。處理30 min 時(shí)存活率最高，2 個(gè)甜瓜品種的子房存活率均在82%以上。處理60 min時(shí)也均在81%左右，與處理30 min 時(shí)存活率無(wú)顯著差異，但都顯著高于處理90 min。隨著PVS2 脫水處理時(shí)間的增加，PVS2 的毒害作用也逐漸增強(qiáng)，從而導(dǎo)致子房存活率下降。為避免PVS2 玻璃液的毒害作用加劇，以30 min 為最佳處理時(shí)間。

圖2 PVS2 處理時(shí)間對(duì)低溫保存子房的影響

2.3 解凍溫度對(duì)甜瓜子房存活率的影響

解凍是材料恢復(fù)培養(yǎng)最關(guān)鍵的一步，迅速解凍可以避免細(xì)胞內(nèi)再次出現(xiàn)結(jié)冰而造成細(xì)胞死亡。采用MS+410 g·L-1 蔗糖卸載液解凍，分析不同解凍溫度對(duì)子房存活率的影響，由圖3 可知，當(dāng)解凍溫度為25 ℃時(shí)，子房的存活率遠(yuǎn)低于50%，隨著解凍溫度的升高，子房的存活率也隨之增高。解凍溫度在38 ℃時(shí)，子房存活率最高，晚熟品種眾云18 和早熟品種錦繡都在80%左右；解凍溫度在40 ℃和42 ℃時(shí)，子房存活率略低于38 ℃，但無(wú)顯著差異，以38 ℃為最佳解凍溫度。

圖3 解凍溫度對(duì)低溫保存子房的影響

2.4 超低溫保存時(shí)長(zhǎng)對(duì)甜瓜子房存活率的影響

理論上材料保存在液氮中保存時(shí)間的長(zhǎng)短不會(huì)影響其存活率。采用改良的超低溫保存方法把眾云18 和錦繡未授粉子房預(yù)培養(yǎng)24 h，經(jīng)過(guò)3%海藻酸鈉包埋，0.1 mol·L-1氯化鈣固定，加載液處理20 min，PVS2 脫水30 min，鋁箔紙包裹迅速放入液氮中保存。為分析保存時(shí)長(zhǎng)對(duì)材料存活率的影響，將保存了0、20、40、60 d 的子房在38 ℃的卸載液中處理5 min 進(jìn)行解凍，再接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果如表1 所示，0 d 時(shí)2 個(gè)甜瓜材料子房的存活率都在92%以上；隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，子房的存活率也開(kāi)始降低；保存20、40 d 和60 d 時(shí)存活率在80%～87%之間，子房存活率無(wú)顯著差異，表明液氮保存時(shí)長(zhǎng)對(duì)凍后子房的存活率無(wú)明顯影響，且保存60 d 時(shí)子房的存活率仍在80%以上。

表1 低溫保存不同時(shí)間未授粉子房的存活率%

3 討論與結(jié)論

超低溫保存法可以保持材料正常的細(xì)胞活性、全能性和遺傳性，且操作簡(jiǎn)單、成本低，并能長(zhǎng)期保存，適用于細(xì)胞、組織等離體材料的保存。筆者采用包埋法和玻璃化法結(jié)合的改良超低溫保存法對(duì)甜瓜離體子房進(jìn)行保存。經(jīng)過(guò)4 ℃暗處理2 d 的子房，先用0.4 mol·L-1蔗糖溶液預(yù)培養(yǎng)24 h，再用3%海藻酸鈉包埋并用0.1 mol·L-1氯化鈣固定，經(jīng)過(guò)加載液（1/2 MS+136 g·L-1蔗糖+180 g·L-1甘油）處理后，再用PVS2（MS+300 ml·L-1甘油+150 ml·L-1乙二醇+150 ml·L-1二甲基亞砜+136 g·L-1蔗糖）脫水，接著用鋁箔紙包裹迅速放入液氮中保存，最后用卸載液（MS+1.2 mol·L-1蔗糖）解凍接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。筆者使用改良超低溫保存法對(duì)甜瓜離體子房組織進(jìn)行保存，可解決甜瓜未授粉子房離體培養(yǎng)材料受生長(zhǎng)季節(jié)和生長(zhǎng)期的影響而導(dǎo)致的供應(yīng)不足的問(wèn)題。

材料的選擇對(duì)超低溫保存后植物的存活率起決定性作用[7]。已報(bào)道的超低溫保存的研究材料有胚性愈傷組織、原生質(zhì)體、體細(xì)胞胚、小孢子、花粉、不定芽、腋芽、休眠芽、莖尖、種子、幼苗等[6，8-17]，但還未發(fā)現(xiàn)對(duì)甜瓜子房保存研究的相關(guān)報(bào)道。甜瓜子房體積偏大，在超低溫保存的程序中需要先通過(guò)預(yù)處理來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)含水量，避免其在PVS2 脫水過(guò)程中細(xì)胞脫水死亡而影響存活率。預(yù)培養(yǎng)、低溫鍛煉等[18-19]是常用的預(yù)處理方法。預(yù)處理的目的是改善材料的生理狀態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)自由水含量減少以提高材料的抗凍性[20]。筆者采用0.4 mol·L-1的蔗糖保護(hù)液預(yù)培養(yǎng)24 h，眾云18 和錦繡子房的存活率均在82%以上。白建明等[21]在馬鈴薯莖尖研究中用0.3 mol·L-1的蔗糖溶液，李泳[22]在羅漢果莖尖中用0.7 mol·L-1蔗糖溶液，均預(yù)培養(yǎng)24 h，獲得最高的存活率。也有研究表明，高潔等[23]在紅掌腋芽中用0.4 mol·L-1蔗糖溶液預(yù)培養(yǎng)96 h 效果最佳，說(shuō)明不同種植物的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間可能與其保存的組織部位以及預(yù)培養(yǎng)液的濃度有關(guān)。

玻璃化液處理是將細(xì)胞內(nèi)的自由水從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡЩ癄顟B(tài)，避免細(xì)胞內(nèi)形成冰晶來(lái)提高細(xì)胞的抗凍能力[24]。PVS2 是最常使用且效果最佳的玻璃化保護(hù)液。筆者采用PVS2 玻璃化液處理30 min，眾云18 和錦繡子房存活率分別高達(dá)82.13%、83.40%，軟棗獼猴桃莖尖用PVS2 處理40～60 min，而休眠芽需要120 min 效果最好[4，14]；扁桃休眠芽則需要70 min[25]；羽狀雞冠花幼苗需要處理60 min[17]；越橘腋芽需要40 min[13]；九里香種子處理30 min[26]。但也有研究表明，PVS2 處理反而降低存活率[27]。不同材料的組織部位PVS2 處理存在較大的差異，因此，需要篩選適合的PVS2 玻璃化液處理時(shí)間。晉玲等[28]認(rèn)為PVS2 處理時(shí)間一般是在20～100 min。

解凍是超低溫保存過(guò)程中防止材料受到損傷的關(guān)鍵，在解凍過(guò)程中若不能快速解凍材料，容易使細(xì)胞內(nèi)再次結(jié)冰造成細(xì)胞死亡，所以要針對(duì)保存的材料選擇適合的解凍方式。理論上一般采用37～40 ℃恒溫解凍。梨莖尖在25 ℃水浴解凍效果好[29]；白菜小孢子37 ℃恒溫水浴40 s 解凍效果最佳[10]；柿子休眠芽在40 ℃時(shí)快速解凍的效果較好[30]；而密花石斛花粉在室溫和37 ℃解凍無(wú)明顯差異[27]。筆者的研究中甜瓜子房在卸載液中恒溫38 ℃解凍5 min 效果最好。在解凍時(shí)為避免PVS2在材料細(xì)胞內(nèi)的毒害作用，需要卸載液洗滌。筆者的試驗(yàn)使用的卸載液是MS+410 g·L-1蔗糖。有研究表明，在解凍時(shí)高濃度的蔗糖可防止水分的快速進(jìn)入，降低冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。軟棗獼猴桃休眠芽[14]和藍(lán)果忍冬莖尖[31]在卸載液MS+1.2 mol·L-1蔗糖中處理30 min 達(dá)到最好效果，與筆者試驗(yàn)的卸載液配方相同，但筆者的研究縮短了解凍時(shí)間。九里香種子[26]只要40 ℃溫水解凍2 min 就能達(dá)到理想效果，說(shuō)明解凍方式以及解凍的溫度和時(shí)間與物種及材料部位和大小密切相關(guān)。

材料在超低溫保存的過(guò)程中生理活動(dòng)處于近乎停止的狀態(tài)，理論上可以長(zhǎng)久保存。早在1997年對(duì)櫻桃莖尖超低溫保存1 d 和10 min 的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異[32]；芍藥花粉超低溫保存4 a 和美國(guó)山核桃花粉保存10 a 以上都還具有生活力[33-34]；秦艽休眠芽在超低溫保存1、14、28、46 d 存活率也沒(méi)差異[35]；軟棗獼猴桃莖尖在液氮中保存時(shí)間長(zhǎng)短并未對(duì)材料的存活力造成明顯區(qū)別[4]。這些報(bào)道與筆者的研究結(jié)果一致，甜瓜子房在超低溫保存20、40、60 d 后子房存活率并無(wú)顯著差異，說(shuō)明超低溫保存時(shí)長(zhǎng)對(duì)子房的存活率影響不明顯。本試驗(yàn)結(jié)果表明，甜瓜子房在超低溫保存60 d 后仍可維持較高的存活率，隨著低溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)，其存活率雖然開(kāi)始降低，但保存時(shí)長(zhǎng)之間的差異并不顯著。

筆者首次嘗試以子房作為保存材料進(jìn)行研究，甜瓜子房通過(guò)預(yù)培養(yǎng)24 h，用海藻酸鈉包埋，氯化鈉固定，經(jīng)加載液處理20 min，PVS2 脫水30 min，用鋁箔紙包裹放入液氮中保存，之后卸載液在38 ℃恒溫解凍5 min，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中即可恢復(fù)培養(yǎng)。初步得到甜瓜子房超低溫保存的條件，建立適合甜瓜子房超低溫保存及恢復(fù)培養(yǎng)的體系。該技術(shù)有效地解決了甜瓜大孢子培養(yǎng)供體不足且無(wú)法長(zhǎng)期持續(xù)供應(yīng)的問(wèn)題，為葫蘆科作物大孢子超低溫保存提供了可靠的技術(shù)參考。