SCF/c-Kit 信號通路通過抑制肥大細胞增殖調控影響病理性瘢痕形成的研究

吳海燕，王永軍，段志娟，王娟，羅宏

（郴州市第一人民醫(yī)院，湖南 郴州 423000）

病理性瘢痕即疙瘩瘢痕和增生性瘢痕，由于皮膚創(chuàng)傷過度愈合，是一種以成纖維細胞過度增生、細胞外基質長期異常積累為特征的臨床和病理實體[1]，因其臨床侵襲性、引起攣縮和病理上出現透明膠原/真皮結節(jié)而臭名昭著[2]。一直以來，大部分研究都關注在成纖維細胞在創(chuàng)面愈合過程中的增殖對病理性瘢痕形成的影響[3]。迄今為止，有效和具體的治療方法很少，即使是手術切除也被高復發(fā)率所阻礙。有臨床數據發(fā)現，肥大細胞數量在病理性瘢痕組織中增加，但其對病理性瘢痕形成的作用仍不清楚且研究頗少[4]。因此，深入研究病理性瘢痕形成的過程，有助于闡明病理性瘢痕的發(fā)病機制。

酪氨酸激酶受體c-Kit 及其唯一已知的配體干細胞因子（Stem cell factor，SCF）是促進細胞生長、存活、分化、遷移和分泌等基本細胞功能的重要關鍵因子[5]。尤其在胚胎發(fā)育過程中，SCF/c-Kit 軸介導了造血、中樞神經系統(tǒng)、腸道黑色素生成的重要信號[6]。激活的SCF/c-Kit 通路也經常出現在腫瘤和癌前病變中，識別出c-Kit 是原癌基因[7-8]。臨床研究發(fā)現，c-Kit 陽性肥大細胞在人瘢痕組織中顯著增多，人皮膚瘢痕組織中肥大細胞糜蛋白酶、胰酶和c-Kit 表達也顯著改變[9]。此外，還有報道SCF/c-Kit 參與了肥大細胞增生的炎性過程[10]。而病理性瘢痕組織肥大細胞數目比正常皮膚增多[4]。這些數據提示SCF/c-Kit 信號通路可能參與了病理性瘢痕的形成。

本研究旨在闡明SCF/c-Kit 信號通路與病理性瘢痕之間的作用關系以及可能的調節(jié)途徑，進一步為闡明病理性瘢痕的發(fā)病機制提供了實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 所有臨床樣本均來自我院，病理性瘢痕標本（主要來自燒傷、創(chuàng)傷、外科手術患者）35 例，正常皮膚標本（主要來整形外科手術切除的健康人皮膚）30 例。獲取標本后立即冷凍。所有涉及人體皮膚標本均已獲得患者本人書面知情同意進行，所有研究均獲得本醫(yī)院倫理委員會的批準與監(jiān)督。

1.1.2 動物 選取30 只4～6 周齡巴比賽（BALB/c）裸鼠，體質量15～22 g，小鼠被置于特定的無病原體環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。

1.1.3 試劑 甲苯胺藍染色試劑盒購于北京Solarbio 公司；人的SCF ELISA 試劑盒購自美國R&D 公司；磷酸酶抑制劑購自美國Sigma-Aldrich 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國Millipore 公司；抗體SCF、c-Kit、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購自美國Invitrogen 公司；辣根過氧化物酶（HRP）鼠抗購自美國Abcam 公司；si-NC 和si-SCF 質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司（上海生工）構建；水合氯醛購自寶雞市國康生物科技有限公司；膠原纖維（V.G）染色劑購自上海美軒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甲苯胺藍染色 稱取甲苯胺藍0.5 g，定容至100 mL 蒸餾水中配制成甲苯胺藍染色液。將收集的臨床標本和裸鼠瘢痕組織進行石蠟組織切片（4 μm），脫蠟至水，用甲苯胺藍染色液染色10 min，蒸餾水洗2 次。冰醋酸分化液浸潤30 s 左右，至顆粒清晰為止（顯微鏡控制）；再用蒸餾水洗2 次，無水乙醇快速脫水，濾紙吸干，最后用二甲苯透明和中性樹膠封片。

1.2.2 酶聯免疫吸附測定（ELISA） 收集病理性瘢痕患者和健康者的血清，使用ELISA 試劑盒檢測SCF 的濃度，所有步驟嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行。所有的檢測均做3 個復孔，最后取平均值。

1.2.3 蛋白質印記法（Western blotting） 將收集的標本用含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解緩沖液和磷酸酶抑制劑進行裂解提取蛋白。使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）進行電泳，并將蛋白轉移到PVDF 膜。用含5%BSA 的Tris 鹽酸緩沖液封閉1 h 后，用anti-SCF、anti-c-Kit 抗體在4 ℃孵育過夜。然后，膜與相應的氧化物酶（HRP）共軛二抗室溫孵育1 h。用anti-GAPDH 抗體作為內參。采用增強型化學發(fā)光（ECL）檢測蛋白，使用Image J 軟件分析蛋白強度。

1.2.4 質粒的構建 使用小干擾核糖核酸（siRNA）沉默SCF。設計SCF 上下游引物，正向序列為：si-SCF：UGAAGAGGAUAAUGAGAUA；si-NC：UAGCGACUA ACAUCAA。在國家生物技術信息中心（NCBI）上進行核對，然后送至公司進行合成測序，再按照si-RNA的構建方法進行質粒重構[11]，即可得到si-NC 和si-SCF 質粒。

1.2.5 瘢痕裸鼠模型的建立[12]及分組 取瘢痕患者的瘢痕組織，切成0.8 cm×0.8 cm×0.5 cm 的組織塊備用。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在裸鼠背部切開1 cm×2 cm 的切口，將瘢痕組織塊移植到裸鼠皮下，進行常規(guī)縫合包扎。16 d 后隨機將造模成功的裸鼠隨機分為模型+si-NC 組和模型+si-SCF 組，每組10 只，分別于裸鼠瘢痕內注射si-NC、si-SCF 質粒和脂質體混合液0.25 mL[每個EP 管內含質粒30 g、脂質體75 μL 及磷酸鹽緩沖液（PBS）共0.25 mL]，另設對照組，只在裸鼠背部切開等體積切口，注射等體積PBS 再進行常規(guī)縫合。7 d 后將各組裸鼠斷頸處死進行瘢痕組織檢測。

1.2.6 瘢痕體積大小測量 分別于注射質粒前后用游標卡尺測量各組裸鼠瘢痕體積，記錄瘢痕的長、寬、高。再根據公式計算瘢痕體積，瘢痕體積（mm3）=長×寬×高。

1.2.7 裸鼠標本的收集 在測量完各組裸鼠的瘢痕體積后立即取各組裸鼠的瘢痕標本，一部分標本浸泡在4%的甲醛中并進行石蠟切片（厚5 μm），待后續(xù)各組切片染色使用，一部分標本放置在無菌的EP 管中，保存在-80 ℃待做Western blotting。

1.2.8 瘢痕組織Ⅰ型膠原含量檢測 用V.G 染色檢測各組裸鼠瘢痕組織Ⅰ型膠原含量。將組織石蠟切片先常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水清洗。切片上滴染V.G液，蒸餾水洗2 次。無水乙醇脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad 7 軟件進行數據分析，至少取3 次獨立實驗結果，2 組間統(tǒng)計學差異分析采用雙尾無配對或配對T-test。相關分析采用Pearson 相關檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病理性瘢痕患者肥大細胞增多 筆者通過甲苯胺藍染色對臨床病理性瘢痕患者的皮膚瘢痕組織進行肥大細胞的檢測，結果顯示與健康者皮膚組織相比，病理性瘢痕患者的瘢痕組織出現大量肥大細胞浸潤，見圖1。

圖1 患者瘢痕組織的肥大細胞數量（甲苯胺藍染色×400，黑色箭頭指向肥大細胞）

2.2 病理性瘢痕患者瘢痕組織中SCF/c-Kit 高表達 ELISA 結果顯示，相比于健康者，病理性瘢痕患者血清中SCF 含量異常升高（P<0.001），見圖2A。Western blotting 結果顯示，相比于健康者皮膚組織，病理性瘢痕患者瘢痕組織中SCF/c-Kit 表達顯著上調（P<0.001），見圖2B、C。因此，SCF/c-Kit 在病理性瘢痕患者瘢痕組織中高表達。

圖2 SCF/c-kit 在瘢痕患者血清和瘢痕組織中的表達

2.3 沉默SCF 對病理性瘢痕裸鼠模型瘢痕組織中c-Kit 的影響 筆者建立了病理性瘢痕裸鼠模型，移植人瘢痕組織塊后小鼠體內基本無免疫排斥，見圖3A。同時構建了si-SCF 質粒注射入模型裸鼠的瘢痕內。將動物分為對照組、模型組、模型+si-NC 組和模型+si-SCF 組。Western blotting 結果顯示，相對于對照組，模型組裸鼠瘢痕組織內SCF/c-Kit 蛋白表達顯著升高；相對于模型組，模型+si-NC 組SCF/c-Kit 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，說明注射si-NC質粒對裸鼠SCF/c-Kit 蛋白表達無影響；而相對于模型+si-NC 組，模型+si-SCF 組顯著降低了裸鼠瘢痕組織內SCF/c-Kit 蛋白表達，說明si-SCF 質粒構建成功，同時也降低了c-Kit 蛋白表達（P<0.05），見圖3B、C。因此，SCF/c-Kit 蛋白表達在病理性瘢痕裸鼠模型中高表達，與臨床數據一致；當在模型裸鼠的瘢痕組織中沉默SCF 時，c-Kit 蛋白表達被顯著下調。

圖3 各組裸鼠模型瘢痕組織中SCF/c-Kit 的蛋白表達

2.4 沉默SCF 對病理性瘢痕裸鼠瘢痕體積的影響 模型裸鼠注射PBS 或si-NC、si-SCF 質粒前后瘢痕體積大小檢測，相對于模型組，模型+si-NC 組注射前后裸鼠的瘢痕體積無明顯變化；而相對于模型+si-NC 組，模型+si-SCF 組注射后裸鼠的瘢痕體積顯著減?。≒<0.05）。因此，沉默SCF 抑制了病理性瘢痕裸鼠模型瘢痕體積的增大，見表1。

表1 模型裸鼠瘢痕體積大小 （mm3，±s）

表1 模型裸鼠瘢痕體積大小 （mm3，±s）

注：注射后相對于模型組+si-NC 組，*P<0.05。

組別模型組模型+si-NC 組模型+si-SCF 組n 10 10 10注射前 注射后256.77±26.01 252.23±30.12 253.61±29.23 255.12±27.34 254.65±24.78 167.98±22.05*

2.5 SCF 對病理性瘢痕裸鼠瘢痕組織中Ⅰ型膠原含量的影響 各組裸鼠瘢痕組織中Ⅰ型膠原含量通過V.G 染色進行檢測，Ⅰ型膠原（紅色）主要分布在真皮的細胞間質。相比于對照組，模型組裸鼠瘢痕組織中Ⅰ型膠原含量增多；相對于模型組，模型+si-NC 組裸鼠瘢痕組織中Ⅰ型膠原含量無變化；而相對于模型+si-NC 組，模型+si-SCF 組裸鼠瘢痕組織中Ⅰ型膠原含量顯著降低。因此，沉默SCF 抑制了病理性瘢痕裸鼠模型瘢痕組織中Ⅰ型膠原含量的增多，見圖4。

圖4 各組裸鼠瘢痕組織的Ⅰ型膠原含量（V.G 染色×200）

2.6 SCF 對病理性瘢痕裸鼠肥大細胞的影響 各組裸鼠瘢痕組織中肥大細胞數目的變化通過甲苯胺藍染色進行評估。相比于對照組，模型組裸鼠瘢痕組織中肥大細胞數目增多；相對于模型組，模型+si-NC 組裸鼠瘢痕組織中肥大細胞數目無變化；而相對于模型+si-NC 組，模型+si-SCF 組裸鼠瘢痕組織中肥大細胞數目減少得多（P<0.001），見圖5。因此，沉默SCF 抑制了病理性瘢痕裸鼠模型瘢痕組織中肥大細胞的增多。

圖5 各組裸鼠瘢痕組織的肥大細胞（甲苯胺藍染色×400）

3 討論

病理性瘢痕通常被認為是長時間的、異常的傷口愈合的結果，表現為成纖維細胞異常增殖參與和分泌大量的細胞外基質[3]。病理性瘢痕可分為疙瘩瘢痕和增生性瘢痕，是由皮膚損傷和刺激引起的，包括創(chuàng)傷、蟲咬、燒傷、外科手術、接種疫苗、皮膚穿孔、痤瘡、毛囊炎、水痘和帶狀皰疹感染[13]。疙瘩瘢痕典型的病理特征是存在增厚和透明的“瘢痕”膠原[14]，增生性瘢痕的典型特征是過度纖維化而產生膠原紊亂[15]。由于疙瘩瘢痕和增生性瘢痕的臨床和病理表現重疊，且沒有合適的動物模型，其病因尚不清楚。一旦疤痕組織成熟，周圍組織就不可能再生出正常的真皮組織。因此，了解病理性瘢痕形成的基本機制，將有助于臨床和組織病理學對這些重要病變的分類和治療。

SCF 是酪氨酸激酶Ⅲ家族的一員，由c-Kit 基因編碼，SCF 可以與c-Kit 受體結合嚴格調控幾個復雜的生物程序，包括造血、肥大細胞發(fā)育、皮膚色素沉著和配子生成[16]。肥大細胞是重要的免疫細胞，分布在全身的各個部分，包括皮膚。研究表明，在創(chuàng)面愈合過程中，肥大細胞能夠促進急性炎性反應、刺激創(chuàng)面上皮化與血管再生直至貫穿整個瘢痕形成過程中[17]。所以肥大細胞的異常與增生性瘢痕的形成有密切聯系。SCF 最初被認為是肥大細胞的生長因子，SCF/c-Kit 信號通路可能是影響肥大細胞數量、表型和功能的最重要因素之一，可以通過調控肥大細胞和黑色素細胞增殖來改善乳腺癌和肝炎等疾病[18-19]。SCF/c-Kit 信號通路還對細胞的遷移、增殖和分化至關重要[5]。最新研究發(fā)現，SCF 和c-Kit在疙瘩瘢痕組織中表達上調，同時在瘢痕樣成纖維細胞和瘢痕樣角質形成細胞中表達也上調，SCF/c-Kit 信號通路還通過調控成纖維細胞和角質形成細胞增殖來治療疙瘩瘢痕的形成和創(chuàng)面愈合[20]。但未有報道說明肥大細胞中的SCF/c-Kit 信號通路對病理性瘢痕的影響。因此，筆者探究了SCF/c-Kit 信號通路通過調控肥大細胞增殖來改善病理性瘢痕的機制。筆者的研究結果表明，病理性瘢痕患者的瘢痕組織中存在大量肥大細胞，SCF 作為肥大細胞的生長因子，被發(fā)現在病理性瘢痕患者的血清中高表達，同時SCF/c-Kit 的蛋白表達在患者瘢痕組織中也高表達。為了進一步探究其中的分子機制，筆者建立了病理性瘢痕裸鼠模型，注射si-NC 和si-SCF質粒至瘢痕組織，Western blotting 結果顯示模型組上調了SCF/c-Kit 的蛋白表達，而沉默SCF 下調其受體c-Kit 表達；游標卡尺測量瘢痕體積發(fā)現，模型組裸鼠的瘢痕體積大，而沉默SCF 可以抑制病理性瘢痕裸鼠瘢痕體積的增大；V.G 染色發(fā)現，模型組裸鼠瘢痕組織中Ⅰ型膠原含量顯著增多，而沉默SCF抑制了Ⅰ型膠原含量的增多；甲苯胺藍染色發(fā)現，模型組裸鼠瘢痕組織中肥大細胞大量累積，與臨床患者體內一致，當沉默SCF 后肥大細胞的數目顯著降低。以上數據說明SCF/c-Kit 信號通路對病理性瘢痕組織中瘢痕體積、Ⅰ型膠原含量和肥大細胞數目有調控性。

綜上所述，筆者的研究揭示SCF 和c-Kit 蛋白表達在病理性瘢痕患者的血清和瘢痕組織中高表達，且肥大細胞異常增殖；通過沉默SCF 可以下調c-Kit 表達，抑制病理性瘢痕體積的增大和瘢痕組織中Ⅰ型膠原含量的增多，并且抑制了肥大細胞的增殖。本研究為病理性瘢痕的形成和發(fā)病機制提供了一個新的視角。