枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花生長和品質(zhì)的影響

王琳，胡凱基，2，及華*，李洪濤，李運朝，李超楠，章麗

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所，河北 石家莊 050051；2.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000）

金銀花（Lonicera japonica Thunb.） 為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花[1]，是常用的中藥材，性味甘、寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、宣散風(fēng)熱的功效[2]。河北省巨鹿縣為全國金銀花傳統(tǒng)三大道地產(chǎn)區(qū)之一，先后被命名為“國家級中藥材基地縣”和“中國金銀花道地藥材產(chǎn)業(yè)之鄉(xiāng)”，產(chǎn)量約占全國總量的50%左右。由于近幾年連續(xù)暴發(fā)病毒性疫情，以金銀花為主要原料的抗病毒中成藥及中藥飲片需求量急劇增加，導(dǎo)致金銀花種植面積不斷增大。而農(nóng)戶在金銀花生產(chǎn)中為了追求高產(chǎn)，常大量施肥、灌水和使用農(nóng)藥，致使藥材質(zhì)量普遍下降，二三茬花的藥效達(dá)不到新版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，降低了金銀花藥材合格率，也損害了冀藥品牌的公信力。

微生物菌劑是一種新興的活菌制劑，具有直接或間接改良土壤、恢復(fù)地力、預(yù)防土傳病害、維持根際微生物區(qū)系平衡、降解有毒有害物質(zhì)等作用，其通過促進(jìn)植物根系對養(yǎng)分的吸收，促進(jìn)植株生長[3，4]，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。前人研究表明，微生物菌劑能夠提高蔬菜[5～7]以及糧油作物[8，9]產(chǎn)量和品質(zhì)，增強果樹抗病性[10～12]，減少中藥材連作障礙[13，14]，改變土壤微生態(tài)環(huán)境。作者前期以促進(jìn)金銀花植株生長和提高品質(zhì)為目標(biāo)，研究了3 種不同微生物菌劑的作用效果，篩選出最佳菌劑為枯草芽孢桿菌[15]。在此基礎(chǔ)上，研究同一菌劑不同施用次數(shù)對金銀花生長特性和品質(zhì)的影響，明確該菌劑的作用時效和最佳施用次數(shù)，旨為金銀花高質(zhì)量綠色栽培和集約化生產(chǎn)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金銀花品種為巨鹿一號。在邢臺市巨鹿縣慧農(nóng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司金銀花標(biāo)準(zhǔn)化種植園，選擇4 a 生的金銀花植株進(jìn)行試驗。

微生物菌劑為枯草芽孢桿菌，有效活菌數(shù)≥5.0億個/g，由中農(nóng)綠康（北京）生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 2021 年4 月上旬在金銀花標(biāo)準(zhǔn)化種植園，選擇金銀花植株生長健壯、長勢基本相同的地塊，平均劃分4 個田間試驗小區(qū)，每小區(qū)面積333.5 m2。重復(fù)3 次。

將菌劑均勻撒施于金銀花植株樹冠下周圍地面，然后噴水灌溉。2021 年4 月20 日第1 次施用，施用量為150 kg/hm2，標(biāo)記為T1；之后，每隔20 d 施用1次，每次施用量均為75 kg/hm2，連續(xù)施用2 次，依次標(biāo)記為T2、T3；以不施用枯草芽孢桿菌的地塊為對照（CK）。金銀花田間管理措施同常規(guī)。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 金銀花生長指標(biāo)。每小區(qū)均選擇長勢相近、具有代表性的3 株金銀花植株做好標(biāo)記，在選取的金銀花植株上分別選擇5 個新梢做標(biāo)記，6～9 月生長季節(jié)每月測定1 次生長指標(biāo)。其中，葉片光合速率和蒸騰速率，利用CIRAS～3 型便攜式光合作用儀測定；葉片葉綠素含量，利用SPAD-502 便攜式葉綠素儀測定。

1.2.2.2 金銀花品質(zhì)指標(biāo)。在金銀花大白期，于清晨或上午采集鮮花，帶回實驗室，置于烘箱內(nèi)55～60 ℃烘干至恒重，晾至室溫后置于密封袋內(nèi)，冰箱冷藏備用。測定金銀花品質(zhì)指標(biāo)。

木犀草苷、綠原酸、浸出物和總灰分含量，采用2020 年版《中華人民共和國藥典》 （第四部）方法測定[16]。木犀草苷和綠原酸含量按照不同采樣日期分別檢測，浸出物和總灰分含量按照不同采樣日期產(chǎn)量比例混合樣品檢測。

1.2.2.3 產(chǎn)量指標(biāo)。每小區(qū)均選取長勢相近、具有代表性的3 株金銀花，做好標(biāo)記。分別采收單株的每茬大白期鮮花，稱重。采收結(jié)束后，計算每茬花的單株平均產(chǎn)量。

1.2.2.4 金銀花經(jīng)濟效益。根據(jù)當(dāng)年金銀花產(chǎn)量、市場價格和附加成本投入（菌劑、人工、水費等），計算金銀花的經(jīng)濟效益。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Office 軟件做表和制圖；利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05 作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花生長特性的影響

2.1.1 葉片凈光合速率 隨著金銀花生育進(jìn)程，施用枯草芽孢桿菌處理的葉片凈光合速率均呈先升高后降低的變化，與CK 指標(biāo)值呈降低—升高—降低的變化趨勢略有不同。

同一時期，施用枯草芽孢桿菌處理的葉片凈光合速率均＞CK，指標(biāo)值隨施用次數(shù)的增加而逐漸提高，除9 月7 日T1處理與CK 差異不大外，其他時期各指標(biāo)值與CK 差異均達(dá)到了顯著水平；但不同時期，各施用次數(shù)處理的指標(biāo)值差異程度不同，其中，6 月10日和7 月6 日不同施用次數(shù)處理的差異均不顯著（圖1）。7 月6 日以后，不同施用次數(shù)處理的葉片凈光合速率出現(xiàn)較大差異，其中，8 月5 日T3處理的指標(biāo)值顯著＞T1處理，但二者均與T2處理差異不顯著；9 月7日T3處理的指標(biāo)值顯著較高，而T1與T2處理差異不顯著。表明施用枯草芽孢桿菌可顯著提高金銀花葉片凈光合速率，效果隨著施用次數(shù)的增加而逐漸提高，但施用次數(shù)僅對7 月6 日以后的葉片凈光合速率影響較大，綜合分析認(rèn)為T3處理效果最好、T2處理次之。

圖1 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花葉片凈光合速率的影響Fig.1 Effect of different application frequency of B. subtilis on the net photosynthetic rate of L. japonica leaves

2.1.2 葉片蒸騰速率 隨著金銀花生育進(jìn)程，施用枯草芽孢桿菌處理的葉片蒸騰速率變化趨勢與葉片凈光合速率變化趨勢相同，均呈先升高后降低的變化，且與CK 葉片蒸騰速率的變化趨勢相同。

同一時期，施用枯草芽孢桿菌處理的葉片蒸騰速率均＞CK，指標(biāo)值隨施用次數(shù)的增加而逐漸提高，除7 月 6 日和 8 月 5 日T1處理與 CK 差異不大外，其他時期各指標(biāo)值與CK 差異均達(dá)到了顯著水平；但不同時期，各施用次數(shù)處理的指標(biāo)值差異程度不同，其中，9 月7 日以前不同施用次數(shù)處理的差異均不顯著（圖2）。9 月7 日，不同施用次數(shù)處理的葉片蒸騰速率出現(xiàn)較大差異，其中，T3與T2處理差異不顯著，但二者均與T1處理差異達(dá)到了顯著水平。表明施用枯草芽孢桿菌可顯著提高金銀花葉片蒸騰速率，效果隨著施用次數(shù)的增加而逐漸提高，但施用次數(shù)僅對9 月7日的葉片蒸騰速率影響較大，綜合分析認(rèn)為T2和T3處理效果較好。

圖2 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花葉片蒸騰速率的影響Fig.2 Effect of different application frequency of B. subtilis on the net transpiration rate of L. japonica leaves

2.1.3 葉片葉綠素含量 隨著金銀花生育進(jìn)程，施用枯草芽孢桿菌處理的葉片葉綠素含量均呈逐漸降低趨勢，與CK 指標(biāo)值的變化趨勢相同。

同一時期，施用枯草芽孢桿菌處理的葉片葉綠素含量均＞CK，指標(biāo)值隨施用次數(shù)的增加而逐漸提高，除7 月6 日和8 月5 日T1處理與CK 差異不大外，其他時期各指標(biāo)值與CK 差異均達(dá)到了顯著水平。生長前期（6～8 月），枯草芽孢桿菌3 個處理的葉綠素含量增幅相對穩(wěn)定，均＜15.0%；生長后期（9 月7 日）提升效果較好，T1、T2、T3處理的葉綠素含量分別較CK提高40.5%、46.4%和55.1%。但不同時期，各施用次數(shù)處理的指標(biāo)值差異較大，均表現(xiàn)為T3處理的指標(biāo)值顯著＞T1處理，但二者均與T2處理差異不顯著（圖3）。表明施用枯草芽孢桿菌可顯著提高金銀花葉片葉綠素含量，效果隨著施用次數(shù)的增加而逐漸提高，且施用次數(shù)對金銀花整個測定期的葉片葉綠素含量影響均較大，綜合分析認(rèn)為T2和T3處理效果較好。

圖3 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花葉片葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of different application frequency of B. subtilis on the net chlorophyll content of L. japonica leaves

2.2 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花產(chǎn)量的影響

金銀花的產(chǎn)量主要集中在1 茬花和2 茬花。施用枯草芽孢桿菌處理的1 茬花、2 茬花產(chǎn)量以及總產(chǎn)量均顯著＞CK，指標(biāo)值隨施用次數(shù)的增加而逐漸提高，較CK 增幅分別為46.6%、56.6%和59.7%；且不同施用次數(shù)處理的總產(chǎn)量差異達(dá)到了顯著水平，其中，T3與T2處理差異不顯著，但二者均顯著＞T1處理（圖4）。表明施用枯草芽孢桿菌可顯著提高金銀花單株鮮花產(chǎn)量，效果隨著施用次數(shù)的增加而逐漸提高，施用次數(shù)對金銀花產(chǎn)量影響較大，其中T2與T3處理的產(chǎn)量水平相當(dāng)。

圖4 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different application frequency of B. subtilis on the yield of L. japonica

2.3 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花品質(zhì)的影響

2.3.1 木犀草苷含量 隨著金銀花生育進(jìn)程，施用枯草芽孢桿菌處理的木犀草苷含量均呈降低—升高—降低的變化，與CK 指標(biāo)值的變化趨勢一致。

新版《中國藥典》規(guī)定，金銀花木犀草苷含量不得少于0.05%。同一時期，施用枯草芽孢桿菌處理的金銀花木犀草苷含量均顯著＞CK，除9 月7 日T1處理外，其他采樣時期的指標(biāo)值均達(dá)到了藥典標(biāo)準(zhǔn)；而CK 的木犀草苷含量除5 月11 日第1 茬花外，其他時期均未達(dá)標(biāo)（圖5）。6 月1 日不同施用次數(shù)之間未出現(xiàn)顯著性差異，以后差異逐漸增加，8 月5 日三者之間差異明顯。表明施用枯草芽孢桿菌可顯著提高金銀花木犀草苷含量，其中T3處理效果較好，T2處理次之。

圖5 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花木犀草苷含量的影響Fig.5 Effect of different application frequency of B. subtilis on the luteolin content of L. japonica

2.3.2 綠原酸含量 隨著金銀花生育進(jìn)程，施用枯草芽孢桿菌處理的綠原酸含量均呈降低—升高—降低的變化，與CK 指標(biāo)值的變化趨勢基本一致。

新版《中國藥典》規(guī)定，金銀花綠原酸含量不得少于1.5%。同一時期，施用枯草芽孢桿菌處理的金銀花綠原酸含量均顯著＞CK，整個采樣期指標(biāo)值均達(dá)到了藥典標(biāo)準(zhǔn)，T1、T2和T3處理的指標(biāo)平均值分別較CK 提高了43.1%、63.1%和 68.4%；而 CK 在8～9 月綠原酸含量未達(dá)到藥典規(guī)定值（圖6）。表明施用枯草芽孢桿菌可顯著提高金銀花綠原酸含量，整個采樣期指標(biāo)值均達(dá)到了藥典標(biāo)準(zhǔn)。

圖6 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花綠原酸含量的影響Fig.6 Effect of different application frequency of B. subtilis on the chlorogenic acid content of L. japonica

2.3.3 浸出物含量 施用枯草芽孢桿菌處理的金銀花浸出物含量均＞CK，指標(biāo)值隨著施用次數(shù)的增加而逐漸提高，T1、T2和T3處理的浸出物含量分別較CK 提高了0.38%、21.95%和93.65%，除T1處理外，其他2個處理與CK 差異均達(dá)到了顯著水平；不同施用次數(shù)處理的指標(biāo)值差異均達(dá)到了顯著水平（圖7）。表明施用枯草芽孢桿菌可提高金銀花的浸出物含量，其中T2和T3處理效果顯著，以T3處理最佳。

圖7 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花浸出物含量的影響Fig.7 Effect of different application frequency of B. subtilis on the extracts content of L. japonica

2.3.4 總灰分含量 新版《中國藥典》規(guī)定，金銀花總灰分含量不得大于10%。所有處理的金銀花總灰分含量均達(dá)到了藥典標(biāo)準(zhǔn)，但施用枯草芽孢桿菌處理的指標(biāo)值顯著＜CK；不同施用次數(shù)處理的指標(biāo)值差異均不顯著（圖8）。表明施用枯草芽孢桿菌可明顯降低金銀花總灰分含量，但不同施用次數(shù)的效果差異不大。

圖8 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花總灰分含量的影響Fig.8 Effect of different application frequency of B. subtilis on the total ash content of L. japonica

2.4 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花經(jīng)濟效益的影響

施用枯草芽孢桿菌處理的金銀花增產(chǎn)量為220.80～274.87 kg/hm2，按照 2021 年金銀花市場價80 元/kg 計算，效益增加17 664.00～21 989.81 元/hm2；扣除附加成本后凈增產(chǎn)效益為17 064.00～20 589.85 元/hm2，但不同施用次數(shù)的指標(biāo)值差異較大，其中T2處理指標(biāo)值最高，T3處理次之，二者差異不顯著，但均顯著＞T1處理，均較T1處理提高20.66% （表1）。綜合考慮田間操作及成本投入等因素，認(rèn)為T2處理效果最佳，即枯草芽孢桿菌施用2 次可獲得較高的經(jīng)濟效益。

表1 枯草芽孢桿菌不同施用次數(shù)對金銀花經(jīng)濟效益的影響Table 1 Effect of different application frequency of B. subtilis on the economic benefits of L. japonica

3 結(jié)論與討論

目前，微生物菌劑應(yīng)用于糧油作物、蔬菜、果樹等方面的研究報道較多，但對中藥材的應(yīng)用效果研究很少。本研究結(jié)果顯示，隨著枯草芽孢桿菌施用次數(shù)的增加，金銀花葉片凈光合速率、蒸騰速率和葉綠素含量均逐漸提高，生長后期提升效果更為明顯，并顯著提高了金銀花產(chǎn)量和經(jīng)濟效益；金銀花品質(zhì)指標(biāo)檢測數(shù)據(jù)表明，施用枯草芽孢桿菌后顯著提高了木犀草苷、綠原酸和浸出物含量，同時明顯降低了總灰分含量。本研究結(jié)果與施用微生物菌劑提高丹參幼苗根系活力和干物質(zhì)含量[17]，增加白刺花幼苗葉片淀粉、纖維素和可溶性糖含量[18]，提升人參活性成分皂苷Rg1+Re 和Rb1 含量[19]等研究結(jié)果一致。

前人研究表明，絕大多數(shù)農(nóng)作物能與有益微生物形成菌根共生體[20]，從而提高作物的抗逆性和抗病性，具有提高移栽成活率、產(chǎn)量和品質(zhì)等作用。土壤是中藥材植物生長的基礎(chǔ)和場所，其物理、化學(xué)和生物性質(zhì)等各因子之間相互作用的結(jié)果是中藥材質(zhì)量表現(xiàn)出道地性的主要原因，其優(yōu)劣將直接影響藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，外源施入微生物菌劑（枯草芽孢桿菌）后，可顯著促進(jìn)金銀花植株生長發(fā)育，明顯提高金銀花產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，在金銀花種植中推行菌根化栽培技術(shù)，對促進(jìn)植物生長發(fā)育、土壤生態(tài)系統(tǒng)良性循環(huán)，提高金銀花產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要作用。本研究結(jié)果為利用菌根生物技術(shù)保證中藥材質(zhì)量安全、有效和穩(wěn)定探索了一條可行途徑。