瀉白糖漿中杏仁水的質(zhì)量研究

王 靜，周 軍

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

瀉白糖漿為兒童中藥制劑，由石膏、桑白皮、瓜蔞子、葶藶子、麻黃、甘草、前胡、紫菀、款冬花、川貝母、苦杏仁、紫蘇葉油、薄荷腦共十三味藥組成。該品種具有宣肺解熱，化痰止咳的功效。用于傷風(fēng)咳嗽，痰多胸滿，口渴舌干，鼻塞不通。該制劑收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十五冊(cè)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的【制法】項(xiàng)下要求“苦杏仁提取杏仁水備用”。但目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沒有統(tǒng)一制備杏仁水的方法，各廠家提取方法各有不同。該制劑中也未對(duì)杏仁水制定相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，苦杏仁中主要有效成分為苦杏仁苷［1-3］，因苦杏仁苷屬芳香族氰苷，其化學(xué)名為苯羥基乙氰-β-D-葡萄糖-6-O-β-D-葡萄糖苷，該成分性質(zhì)不穩(wěn)定，在β-葡萄糖苷酶或加熱作用下生成葡萄糖和杏仁腈，而杏仁腈可以自發(fā)或經(jīng)羥基腈裂解酶作用產(chǎn)生氫氰酸和苯甲醛［4］。故杏仁水的主要有效成分為苯甲醛和氫氰酸。小劑量氫氰酸對(duì)呼吸中樞有鎮(zhèn)靜作用，可以麻痹咳嗽中樞，體現(xiàn)苦杏仁的止咳平喘等效果；而大劑量的氫氰酸進(jìn)入人體后則發(fā)生中毒，氫氰酸系劇毒物質(zhì)，人體內(nèi)氰化物急性中毒劑量為0.5～3.5 mg/kg［5］。為了保證兒童用藥的安全有效，本試驗(yàn)分別建立了苦杏仁苷的檢查方法、氫氰酸和苯甲醛的含量測(cè)定方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AD 高效液相色譜儀；DAD 檢測(cè)器；LC Solution 工作站。Agilent 6890N 氣相色譜儀；NPD 檢測(cè)器；安捷倫7697A 頂空進(jìn)樣器。XS205 電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。Milli-QA10 型超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試藥 苦杏仁苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110820-201808，供含量測(cè)定用，含量以88.2%計(jì)）；苯甲醛（北京曼哈格生物科技有限公司，批號(hào)B0002957，供含量測(cè)定用，含量以99.8%計(jì)）；水中氰標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)21044，供含量測(cè)定用，濃度：50.0 μg/ml）；甲醇、乙腈（色譜純，默克股份有限公司）；磷酸（色譜純，天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠）；水為Milli-Q 超純水；樣品分別購(gòu)自A、B、C 3 個(gè)廠家共計(jì)18 批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁苷的檢查（HPLC 法）

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按照表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速：1.0 ml/min；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml 含40 μg 的溶液，即得。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 精密量取樣品5 ml，置50 ml 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比，取除苦杏仁外其他藥材，按【制法】項(xiàng)下的工藝制成制劑，再按“2.1.2.2”項(xiàng)下制備方法制得陰性樣品溶液。

2.1.3 測(cè)定方法 分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果詳見圖1。

2.1.4 樣品測(cè)定 對(duì)本次抽驗(yàn)的3 家生產(chǎn)企業(yè)共計(jì)18 批樣品按照“2.1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果均未檢出苦杏仁苷。

2.2 氫氰酸的含量測(cè)定（GC 法）

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent HP-PLOT/Q（30 m×0.53 mm，40.0 μm）色譜柱；程序升溫：初始溫度100 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的速率升溫至200 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度：220 ℃；檢測(cè)器溫度：250 ℃；分流比：1∶1；頂空瓶平衡溫度：85 ℃；平衡時(shí)間：30 min。

圖1 對(duì)照品（A）A 廠家供試品（B）B 廠家供試品（C）C 廠家供試品（D）陰性樣品（E）HPLC 色譜圖

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密吸取對(duì)照品溶液1 ml，加水制成每1 ml 中含1 μg 的對(duì)照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品5 ml，置10 ml 量瓶中，加50%磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.3 陰性樣品的制備 按處方配比，取除苦杏仁外其他藥材，按【制法】項(xiàng)下的工藝制成制劑，再按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液

2.2.2.4 測(cè)定方法 精密量取上述對(duì)照品溶液2 ml置于頂空瓶中，快速加入50%磷酸溶液2 ml，密封，搖勻；分別精密量取上述供試品溶液、陰性樣品溶液各4 ml 置于頂空瓶中密封，將上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖2。

圖2 對(duì)照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）空白溶劑（D）HPLC 色譜圖

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取水中氰標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水分別制成0.005、0.20、0.50、1.00、1.70、2.50 和3.20μg/ml 的對(duì)照品溶液，按“2.2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=89.497 0X-33.239 2（r=0.999 8）。結(jié)果表明，氫氰酸在0.005～3.20 μg/ml 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.4 檢出限與定量限 精密量取水中氰標(biāo)準(zhǔn)溶液加水制成0.005 μg/ml 的對(duì)照品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，按信噪比3∶1 確定檢出限。精密量取水中氰標(biāo)準(zhǔn)溶液加水制成0.015 μg/ml 的對(duì)照品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，按信噪比10 ∶1 確定定量限。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（A 廠家，批號(hào)300099）6 份，按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.2.2.4”項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，樣品中氫氰酸平均值為0.950 5 μg/ml，RSD 為1.9%，符合要求。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批樣品（A 廠家，批號(hào)300099），按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.2.2.4”項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定樣品中氫氰酸峰面積值的RSD 為1.9%，精密度符合要求。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品（A 廠家，批號(hào)300099），按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.2.2.4”項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，分別于0、2、4、8、12 和24 h 進(jìn)樣，測(cè)得氫氰酸峰面積的RSD 為1.7%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品（A 廠家，批號(hào)300099）6 份，每份精密量取2.5 ml，加入與供試品中各組分濃度相當(dāng)?shù)膶?duì)照品溶液，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.2.4”項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果氫氰酸平均回收率為84.06%，RSD 為3.4%。結(jié)果見表2。

2.2.9 樣品測(cè)定 對(duì)本次抽驗(yàn)的3 家生產(chǎn)企業(yè)共計(jì)18 批樣品按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.2.2.4”項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定氫氰酸含量。結(jié)果見表3。

2.3 苯甲醛含量測(cè)定（HPLC 法）

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表4 進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：10 μl。理論板數(shù)按苯甲醛峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取苯甲醛對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml 含20 μg的溶液，即得。

表2 氫氰酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

表4 梯度洗脫程序

2.3.2.2 供試品溶液的制備 取本品原液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比，取除苦杏仁外其他藥材，按【制法】項(xiàng)下的工藝制成制劑，再按“2.3.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.3.2.4 測(cè)定方法 分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見圖3。

圖3 對(duì)照品（A）供試品（B）陰性樣品溶液（C）空白溶劑（D）HPLC 色譜圖

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取苯甲醛對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 ml 含苯甲醛0.391 2、0.978 0、1.956 0、3.912 0、9.780 0、19.560 0、29.340 0、39.120 0、48.90 0 和78.244 0 μg 的系列溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程：Y=6 536 181.351 2X+6 224.320 5（r=1.000 0）。結(jié)果表明苯甲醛進(jìn)樣量在0.003 91～0.782 44 μg 之間，線性關(guān)系良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品（批號(hào)300069）6 份，按照“2.3.2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定，樣品中苯甲醛平均值為12.799 μg/ml，RSD 為0.4%，符合要求。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液1 份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，精密吸取供試品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得苯甲醛峰面積值的RSD 為0.6%，精密度符合要求。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液1 份，分別于0、2、4、8、12、16、20 和24 h 進(jìn)樣，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)得苯甲醛峰面積的RSD 為1.2%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)（300069）樣品6 份，精密量取5 ml，置10 ml 量瓶中，分別精密加入每1 ml 中含苯甲醛對(duì)照品31.536 8 μg 的甲醇溶液2 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，制得供回收率用的供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果苯甲醛平均回收率為100.77%，RSD 為0.4%。結(jié)果見表5。

2.3.8 樣品測(cè)定 對(duì)本次抽驗(yàn)的3 家生產(chǎn)企業(yè)共計(jì)18 批樣品按照“2.3.2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定苯甲醛含量。結(jié)果見表6。

表5 苯甲醛加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表6 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 瀉白糖漿中的苦杏仁以蒸餾芳香水入藥，理論上不應(yīng)該含有苦杏仁苷，經(jīng)查閱并參考相關(guān)文獻(xiàn)，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法，采用50%甲醇為提取溶劑［6］，以甲醇-水為流動(dòng)相［7］，采用梯度洗脫方式進(jìn)行測(cè)定，檢查該制劑中是否存在苦杏仁苷成分，目的是考查3家生產(chǎn)企業(yè)的制備工藝是否存在不按【制法】嚴(yán)格制備情況。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3 家生產(chǎn)企業(yè)均未檢出苦杏仁苷成分，證明不存在苦杏仁直接投料現(xiàn)象。

3.2 苦杏仁苷的最終分解產(chǎn)物為氫氰酸和苯甲醛，理論上兩者含量成正比（摩爾比為1∶1）。氫氰酸的沸點(diǎn)低，極易揮發(fā)，且無紫外吸收，含量測(cè)定非常困難。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，氫氰酸的測(cè)定一般多用于食品和司法鑒定方面，有的采用頂空進(jìn)樣器注入氣相色譜儀進(jìn)行分離，電子捕獲檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)食品中氰化物含量［8］；有的同樣采用氣相色譜電子捕獲檢測(cè)器，利用制品中氰化物在酸性條件下用氯胺T 將其衍生為氯化氫進(jìn)行測(cè)定［9］；有文獻(xiàn)報(bào)道采用離子色譜法，電導(dǎo)檢測(cè)器測(cè)定飲用水中的氰根等陰離子［10］。但本文經(jīng)過查閱司法相關(guān)文獻(xiàn)［11］發(fā)現(xiàn)，采用氣相色譜，氮磷檢測(cè)器方法，應(yīng)用磷酸酸化樣品，使氫氰酸釋放出來再進(jìn)行檢測(cè)，該方法相對(duì)于氣相色譜-電子捕獲器檢測(cè)方法更簡(jiǎn)便。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A 廠家均檢出氫氰酸；B 廠家4 批次樣品檢出氫氰酸，2 批次樣品未檢出；C 廠家均未檢出氫氰酸。含量測(cè)定結(jié)果顯示，氫氰酸的檢出量均很低。

3.3 苯甲醛作為另一個(gè)指標(biāo)成分，從側(cè)面能反映氫氰酸的含量，故本試驗(yàn)對(duì)制劑中苯甲醛含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：3 家生產(chǎn)企業(yè)均檢出苯甲醛，但含量差異懸殊，C 企業(yè)苯甲醛均檢出，但含量極低，B 企業(yè)苯甲醛含量最高。結(jié)合氫氰酸含量比較，并未呈現(xiàn)出正比例關(guān)系。且根據(jù)《中國(guó)藥典》一部苦杏仁中苦杏仁苷限度理論推算，與苦杏仁苷分解理論值也相差很大。分析原因可能為：①企業(yè)投料苦杏仁質(zhì)量較差，苦杏仁苷含量極低；②企業(yè)制備苦杏仁水未提取完全；③企業(yè)制備的杏仁水儲(chǔ)存不當(dāng)，造成氫氰酸和苯甲醛的揮發(fā)。

綜上所述，瀉白糖漿存在一定的質(zhì)量問題，分析原因可能主要與各企業(yè)的杏仁水制備工藝和投料質(zhì)量控制不嚴(yán)有關(guān)。建議相關(guān)部門加強(qiáng)監(jiān)管并提升法定標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立了苦杏仁苷的檢查方法，氫氰酸和苯甲醛的含量測(cè)定方法，可為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)升級(jí)提供參考依據(jù)。