杜仲葉乙醇提取物抑菌試驗

郭 菡,徐溶蔓,原 夢,楊月琴,朱文學(xué)

(1.河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,河南 洛陽 471023;2.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州 450001)

0 引言

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)為杜仲科杜仲屬落葉喬木,栽培歷史悠久[1],是中國特有的名貴藥材和木本油料樹種[2]。杜仲干燥樹皮入藥,用于肝腎不足、腰膝酸痛和筋骨無力等癥[3]?，F(xiàn)代研究表明,杜仲還有降血糖、降血脂、抗氧化等多種藥理作用[4],也是常用的食品添加劑[5-6]。

目前,主要圍繞育種、藥材栽培與種植、化學(xué)成分分析、資源調(diào)查、藥理及保健功能開發(fā)等方面對杜仲進行研究[7-8],已先后從杜仲中分離得到木脂素類[9-13]、環(huán)烯醚萜類[14-16]、苯丙素類[17-20]、黃酮[21]、多糖[22]、氨基酸[23-25]及杜仲膠[26-27]等70余種化合物以及鈣、鐵等15余種礦物質(zhì)元素[28]。研究表明,杜仲葉和杜仲皮中所含活性成分大體一致,藥理作用也相似[29],具有較好的抗氧化活性和抑菌活性,在減抗替抗的純天然飼料添加劑開發(fā)、畜牧業(yè)養(yǎng)殖等方面應(yīng)用前景廣闊,成為研究的熱點[30-34],但對于其抑菌活性的機理研究未見報道。

本研究利用乙醇提取杜仲葉中的活性成分,再經(jīng)由系統(tǒng)溶劑提取法萃取、分離(溶劑使用順序為石油醚—乙酸乙酯—正丁醇)得到3個極性部分,最后通過硅膠柱層析配合梯度洗脫法(氯仿/甲醇洗脫液)進一步分離純化,經(jīng)過薄層層析試驗合并類似洗脫組分后,從其中2個極性部分(乙酸乙酯、正丁醇)各得到5個洗脫組分,作為抑菌活性分析的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

細菌菌株：大腸桿菌 (Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),依次標(biāo)記為受試菌1、2、3、4;真菌菌株：根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger) 、青霉(Penicilliumsp.),依次標(biāo)記為受試菌5、6、7。

杜仲葉采摘于洛陽市汝陽縣王坪鄉(xiāng)杜仲種植基地。采取加熱回流提取法制得杜仲葉乙醇提取物,經(jīng)由系統(tǒng)溶劑法萃取分離和硅膠柱層析法進一步純化,得到抑菌活性分析的材料。

乙酸乙酯極性組分質(zhì)量濃度為0.14 g/mL;正丁醇極性質(zhì)量濃度為0.13 g/mL。

1.2 試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 15 g/L、瓊脂20 g/L);馬鈴薯培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g/L、蔗糖20 g/L、瓊脂20 g/L)。

1.3 儀器

本試驗所用主要儀器為超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。

1.4 抑菌活性試驗

1.4.1 試驗方法

杜仲葉活性提取物抑菌試驗。采用改良的打孔法：在超凈工作臺內(nèi),用移液槍吸取150 μL已稀釋好的菌液,均勻涂布在平板上,利用滅菌后的玻璃管在平板上打孔,挑出孔中培養(yǎng)基后用火焰封底(打孔管兩端光滑,外徑約4 mm,孔徑和孔距約3 mm);將不同稀釋倍數(shù)的樣品注入孔中(加滿但不外溢),37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

最小抑菌濃度試驗。采用改良的二倍稀釋法：在超凈工作臺中,每個試管均吸取2 mL液體培養(yǎng)基放入已滅菌的試管中,在第1支試管中加入2 mL已配制的一定稀釋倍數(shù)的樣品溶液,混勻后吸取2 mL放進第2支試管,以此類推,逐個試管進行稀釋至第5支試管,第6支為陽性對照。之后,在各試管內(nèi)加入0.1 mL相應(yīng)的稀釋至適當(dāng)濃度的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和炭疽桿菌懸菌液,置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h,肉眼觀察,試管中液體培養(yǎng)基如果澄清并且搖勻后仍澄清,則判斷無菌生長,且試管中的樣品濃度是最小抑菌濃度。

1.4.2 結(jié)果觀察

抑菌試驗中,注入打孔瓊脂平板中的樣品向周圍擴散,并且濃度呈梯度遞減,經(jīng)過若干小時培養(yǎng)后會出現(xiàn)抑菌圈,其大小和樣品的抑菌效果強弱正相關(guān),同時受樣品稀釋倍數(shù)及接種菌液稀釋倍數(shù)的影響。

1.4.3 判定標(biāo)準

以平板中抑菌圈直徑大小作為判斷藥敏試驗中敏感度高低的標(biāo)準。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 最適稀釋倍數(shù)菌液篩選

本試驗通過比較不同細菌和真菌稀釋前后吸光度值的變化,篩選最適涂布的菌液稀釋倍數(shù),以達到更好觀察提取物抑菌效果目的。圖1為最適涂布菌液篩選結(jié)果。圖1中：受試菌1稀釋前、稀釋2 000倍分別表示為a、b;受試菌2稀釋前、稀釋100倍分別表示為c、d;受試菌3稀釋前、稀釋100倍分別表示為e、f;受試菌4稀釋前、稀釋100倍分別表示為g、h;受試菌5稀釋前、稀釋200倍分別表示為j、k;受試菌6稀釋前、稀釋100倍分別表示為m、n;受試菌7稀釋前、稀釋200倍分別表示為p、q。圖1表明：菌懸液吸光光度值為0.006 A左右時,涂布后菌落致密程度均勻,適合抑菌試驗。

圖1 最適涂布菌液篩選結(jié)果

2.2 杜仲葉乙醇提取物乙酸乙酯部分各洗脫組分抑菌效果

2.2.1 洗脫組分Ⅰ、Ⅲ抑菌效果分析

洗脫組分Ⅰ(V(氯仿)∶V(甲醇)=90∶10)、Ⅲ(V(氯仿)∶V(甲醇)=70∶30)抑菌情況見圖2。圖2a顯示洗脫組分Ⅰ處理下,杜仲葉乙醇提取物乙酸乙酯部分對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌和根霉都有不同程度的抑菌效果,其中對炭疽桿菌的抑制效果最好,但隨著稀釋倍數(shù)的增大,抑菌效果逐漸減弱,而對根霉在稀釋2倍時有抑菌活性。圖2b表明洗脫組分Ⅲ處理下,杜仲葉乙醇提取物乙酸乙酯部分對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和青霉有不同程度的抑菌活性,整體表現(xiàn)為隨著稀釋倍數(shù)增大,抑菌活性逐漸減弱。也是對炭疽桿菌的抑菌效果最好,僅在稀釋2倍時對黑曲霉和青霉有微弱的抑菌效果,但對根霉沒有抑菌活性。

(a) 洗脫組分Ⅰ抑菌效果

2.2.2 洗脫組分Ⅱ抑菌效果分析

表1為乙酸乙酯部分洗脫組分Ⅱ抑菌效果。由表1可知：洗脫組分Ⅱ(V(氯仿)∶V(甲醇)=80∶20)處理下,乙酸乙酯部分對炭疽桿菌的抑制作用最顯著。當(dāng)稀釋倍數(shù)增加時,對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌抑制作用減弱較顯著。

表1 乙酸乙酯部分洗脫組分Ⅱ抑菌效果 mm

2.2.3 洗脫組分Ⅳ、V抑菌效果分析

表2為乙酸乙酯部分洗脫組分Ⅳ、Ⅴ抑菌作用結(jié)果。從表2可以看出：洗脫組分Ⅳ(V(氯仿)∶V(甲醇)=60∶40)、洗脫組分Ⅴ(純甲醇)處理下,獲得的杜仲葉乙醇提取物乙酸乙酯成分對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌均有抑制作用。其中,對炭疽桿菌的抑制作用最好,最大抑菌圈直徑可達22.0 mm。洗脫組分Ⅳ在稀釋倍數(shù)增加后抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的能力明顯減弱,而洗脫組分Ⅴ的抑菌活性受稀釋倍數(shù)影響較小。

表2 乙酸乙酯部分洗脫組分Ⅳ、Ⅴ抑菌作用結(jié)果 mm

上述抑菌試驗結(jié)果表明,基于杜仲葉乙醇提取物乙酸乙酯部分設(shè)置的5個極性洗脫組分對4種細菌均有一定抑制作用,對炭疽桿菌的抑制作用最強,對枯草芽孢桿菌的抑制作用最弱。低極性洗脫組分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的抑制作用隨著稀釋倍數(shù)增加下降較明顯,而高極性洗脫組分(Ⅳ、Ⅴ)的抑制作用受稀釋倍數(shù)影響較小,5個洗脫組分對真菌的基本沒有抑制作用。

2.3 乙酸乙酯部分各極性洗脫組分最大有效稀釋倍數(shù)

杜仲葉乙醇提取物乙酸乙酯部分5個極性洗脫組分最大有效稀釋倍數(shù)試驗采用二倍稀釋法,即將5個極性洗脫組分分別按照4倍、8倍、16倍、32倍、64倍,5個稀釋倍數(shù)進行稀釋,各取100 μL置于裝有菌液懸液和培養(yǎng)基混合液的試管中,于37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察。如果試管內(nèi)的液體清澈,則說明該稀釋倍數(shù)下對受試菌有抑制作用,如果液體渾濁,則說明無抑制作用。乙酸乙酯部分不同洗脫組分的最大有效稀釋倍數(shù)見表3。

表3 乙酸乙酯部分不同洗脫組分的最大有效稀釋倍數(shù)

從表3可以看出：洗脫組分Ⅱ?qū)μ烤覘U菌和金黃色葡萄球菌最大有效稀釋倍數(shù)高于大腸桿菌,和抑菌試驗結(jié)果一致。洗脫組分Ⅰ在4倍稀釋后對3種細菌均有抑制作用,較洗脫組分1略弱。洗脫組分Ⅲ在16倍稀釋后對炭疽桿菌仍有抑制作用,和洗脫組分Ⅰ、Ⅱ相比,對3種細菌的抑制作用均有所增強。洗脫組分Ⅳ則在32倍稀釋后仍對炭疽桿菌有抑制作用,同時能夠較強抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。洗脫組分V在較高稀釋倍數(shù)下對3種細菌均有抑制作用。

2.4 杜仲葉乙醇提取物正丁醇部分各極性洗脫組分抑菌效果

2.4.1 洗脫組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的抑菌效果分析

在洗脫組分Ⅰ(V(氯仿)∶V(甲醇)=90∶10)、Ⅱ(V(氯仿)∶V(甲醇)=80∶20)、Ⅲ(V(氯仿)∶V(甲醇)=70∶30)處理下,杜仲葉乙醇提取物正丁醇部分抑菌作用見表4。表4顯示：洗脫組分Ⅰ能夠較強抑制炭疽桿菌,對金黃色葡萄球菌抑制作用則稍弱;洗脫組分Ⅱ的抑菌作用受稀釋倍數(shù)影響較大,當(dāng)稀釋倍數(shù)較低時,才具有明顯的抑菌作用;洗脫組分Ⅲ能夠較強抑制炭疽桿菌,對金黃色葡萄球菌抑制作用則稍弱,稀釋倍數(shù)增加抑制作用均有下降,但對炭疽桿菌抑制作用受稀釋倍數(shù)影響相對較小。

表4 正丁醇部分洗脫組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抑菌作用 mm

2.4.2 洗脫組分Ⅳ、Ⅴ抑菌效果分析

洗脫組分Ⅳ(V(氯仿)∶V(甲醇)=60∶40)、Ⅴ(純甲醇)處理下,杜仲葉乙醇提取物正丁醇部分抑菌效果如圖3所示。圖3a顯示洗脫組分Ⅳ處理下,杜仲葉乙醇提取物正丁醇部分對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌和根霉都表現(xiàn)為一定的抑菌活性,也是隨著稀釋倍數(shù)增大,抑菌活性減弱,其中對炭疽桿菌的抑菌效果最好,而對枯草芽孢桿菌和根霉僅在稀釋2倍時表現(xiàn)出抑菌活性。圖3b顯示：在洗脫組分Ⅴ處理下,杜仲葉乙醇提取物正丁醇部分僅對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和炭疽桿菌具有抑制作用,對另外4種受試菌都沒有抑菌作用,和洗脫組分Ⅳ處理一樣,稀釋8倍時對大腸桿菌均沒有抑制作用。

(a) 洗脫組分Ⅳ抑菌效果

2.5 正丁醇部分各極性洗脫組分最大有效稀釋倍數(shù)

正丁醇部分各極性洗脫組分均能在一定程度上抑制4種細菌生長,通過與乙酸乙酯部分相同的方法測定5種洗脫組分處理下,正丁醇部分對受試細菌和真菌的最大有效稀釋倍數(shù)。表5為正丁醇部分不同洗脫組分的最大有效稀釋倍數(shù)。

表5 正丁醇部分不同洗脫組分的最大有效稀釋倍數(shù)

表5表明：洗脫組分Ⅰ對3種細菌的最大有效稀釋倍數(shù)有明顯差別,對炭疽桿菌的最大有效稀釋倍數(shù)為16倍。洗脫組分Ⅱ在16倍稀釋后仍能抑制炭疽桿菌。洗脫組分Ⅲ對炭疽桿菌抑制效果與洗脫組分Ⅱ類似。洗脫組分Ⅳ在32倍稀釋后仍對炭疽桿菌有抑制作用,在正丁醇5個洗脫組分中,抑菌效果比較好。洗脫組分Ⅴ對炭疽桿菌最大有效稀釋倍數(shù)為32倍。

3 結(jié)論

(1)杜仲葉乙醇提取物乙酸乙酯部分、正丁醇部分各極性洗脫組分對除枯草芽孢桿菌之外的另外3種細菌均有不同程度的抑制作用。其中,對炭疽桿菌的抑制作用最強,最大抑菌圈直徑可達到22.0 mm;對金黃色葡萄球菌的抑制作用次之,對大腸桿菌的抑制作用則較弱,而對黑曲霉、青霉和根霉3種真菌沒有抑制作用。

(2)正丁醇部分和乙酸乙酯部分各極性洗脫成分的抑菌作用差別不大,極性較大的洗脫組分對細菌的抑制作用較極性較小的洗脫組分強,且受稀釋倍數(shù)影響較小,即隨著稀釋倍數(shù)增加,抑菌作用減小的程度比較小。

(3)乙酸乙酯部分和正丁醇部分各極性洗脫組分沒有太大差別,其中對炭疽桿菌的最大有效稀釋倍數(shù)可以達到32倍。

(4)本研究初步分離了杜仲不同極性、不同類型的化合物,為后續(xù)杜仲活性成分的篩選和天然產(chǎn)物的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。