轉(zhuǎn)錄因子TaMADS2在小麥-葉銹菌互作中的功能研究

王率伍 秦 昭 趙世佳 劉子豪 路亞南 馬保站 肖繼斌 程 琨 鄭文明 劉 娜

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450002)

小麥葉銹病是由葉銹菌(Pucciniatriticina)侵染引起的在世界范圍內(nèi)廣泛分布的真菌病害,發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可造成小麥5%～45%的減產(chǎn)[1]。小麥葉銹菌是專性寄生的活體營養(yǎng)型真菌,該菌分布范圍廣,發(fā)生頻繁,在世界范圍內(nèi)造成小麥產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失,包括亞洲、北美洲、歐洲、澳洲以及非洲等地區(qū)[2]。銹病防治最經(jīng)濟(jì)有效的方法是抗病品種的培育[3],因此新型葉銹病抗性基因的挖掘?qū)p輕葉銹病的危害以及實(shí)現(xiàn)葉銹病的持久防治具有重要意義。

在長期進(jìn)化過程中,植物形成了一套多層次的識(shí)別防御系統(tǒng),從而抵御病原菌的侵染。植物可以在病原菌的侵染部位啟動(dòng)超敏反應(yīng)(Hypersensitive response,HR)和局部程序性細(xì)胞死亡[4],從而阻止病原菌的進(jìn)一步繁殖與擴(kuò)散。超敏反應(yīng)通常包括病程相關(guān)基因(Pathogenesis-related,PR)表達(dá)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)爆發(fā)以及信號(hào)分子的傳遞等[5]。病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)是一類水溶性蛋白,主要功能包括攻擊病原物、降解病原物毒素以及抑制病毒外殼蛋白同植物受體結(jié)合等[6]。PR1被證實(shí)具有抑制病毒擴(kuò)展、抵抗真菌入侵以及保護(hù)植物抵御逆境脅迫等功能[7-8]。PR2基因編碼β-1,3-葡聚糖酶,可以與幾丁質(zhì)酶一起降解真菌細(xì)胞壁,從而造成菌絲體頂端膨脹、破碎,最終死亡[9-10]。病程相關(guān)基因PR1和PR2是植物抗病反應(yīng)的標(biāo)志基因,檢測這些基因的表達(dá)可側(cè)面反應(yīng)植物抗病反應(yīng)的強(qiáng)弱。病原菌侵染引起的HR反應(yīng)會(huì)促進(jìn)活性氧(O2-和H2O2)的產(chǎn)生,不斷積累的活性氧可以進(jìn)一步刺激產(chǎn)生效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(Effectors-triggered immunity,ETI)。ROS在細(xì)胞中積累能夠控制和抑制病原菌的生長,同時(shí)可作為細(xì)胞壁內(nèi)的抗菌小分子抑制病原菌的侵入,并作為次級信使觸發(fā)額外的免疫反應(yīng),如基因表達(dá)或者氣孔關(guān)閉[11-12]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是一種利用反向遺傳學(xué)的原理研究基因功能的方法,將目的基因特異性片段插入病毒載體后侵染宿主植物,導(dǎo)致目的基因局部雙鏈RNA形成,從而引起目的基因的沉默[13]。VIGS技術(shù)避免了對寄主植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,研究周期短,是一種簡單有效的基因功能研究方法,從而極大的推動(dòng)了植物基因組功能研究的發(fā)展。最早追溯到1995年,Kumagai等[14]首次將插有一段八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene desaturase,PDS)的重組煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)導(dǎo)入本氏煙中,成功的沉默了煙草的PDS基因。由于PDS是類胡蘿卜素合成所必需的酶,其基因沉默會(huì)引起所感染植物的葉片產(chǎn)生光漂白表型[15],因此常被用來作為VIGS體系的指示基因。張蕊等[16]利用VIGS技術(shù)沉默TaSPX3基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)TaSPX3基因正向調(diào)控小麥對葉銹菌的抗性;宋姍姍等[17]通過BSMV-VIGS技術(shù)證明TaRanGAP2基因在小麥抵抗葉銹菌侵染的HR反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用;蔣軍等[18]利用VIGS技術(shù)沉默TaCTSB基因的表達(dá),減弱了小麥對條銹菌的抗性。Guo等[19]通過VIGS技術(shù)沉默TaBln1的表達(dá)增強(qiáng)了小麥對條銹菌的防御反應(yīng);而Wan等[20]發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)沉默TaRaf46可以抑制小麥葉片中條銹菌的侵染。另外有報(bào)道稱,在寄主小麥中通過VIGS能夠沉默小麥條銹菌致病基因的表達(dá),從而顯著降低條銹菌的危害[21]。

轉(zhuǎn)錄因子在生物脅迫與非生物脅迫的信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子是一類廣泛存在于真核生物中的古老轉(zhuǎn)錄因子家族,參與植物生長的各個(gè)環(huán)節(jié),在植物的生長發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及脅迫響應(yīng)中發(fā)揮不可替代的作用[22]。普通六倍體小麥的全基因組表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),MADS-box家族多種轉(zhuǎn)錄因子在病原菌(赤霉菌、葉枯菌、條銹菌以及白粉菌)誘導(dǎo)下呈差異表達(dá),因此MADS-box轉(zhuǎn)錄因子可能在小麥抵抗病原菌的侵染過程中發(fā)揮作用[23]。Guo等[24]研究發(fā)現(xiàn)I型MADS-box基因TaMADS2受條銹菌侵染后,在小麥與條銹菌親和/非親和互作早期上調(diào)表達(dá),36和48 h之后出現(xiàn)下調(diào)表達(dá),推測該基因可參與調(diào)控小麥對條銹菌的抗性。

本試驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)葉銹菌與小麥的親和/非親和互作早期TaMADS2基因的表達(dá)量均受到葉銹菌的誘導(dǎo)呈上調(diào)表達(dá),且在非親和互作中TaMADS2的上調(diào)表達(dá)時(shí)期較親和互作更早。目前,關(guān)于TaMADS2參與小麥抗葉銹病過程的作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。因此,本研究擬利用BSMV-VIGS技術(shù)沉默小麥中TaMADS2基因的表達(dá),對沉默植株接種葉銹菌后進(jìn)行研究,旨在明確TaMADS2在小麥?zhǔn)苋~銹菌侵染過程中的功能,為進(jìn)一步闡明TaMADS2基因的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥葉銹菌生理小種為Pt15,單孢菌系,該菌系為實(shí)驗(yàn)室前期鑒定并保存;供試小麥品種為‘鄭麥9023’(ZM9023,Pt15非親和互作)和‘中國春’(CS,Pt15親和互作)。

1.2 大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)介導(dǎo)的TaMADS2基因沉默

本試驗(yàn)中所用BSMV的α、β和γ載體由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院王道文教授課題組惠贈(zèng)。TaMADS2基因cDNA全長822 bp,由試驗(yàn)前期從‘鄭麥9023’中克隆得到。利用帶有NheⅠ酶切位點(diǎn)的引物TaMADS2-VIGS-F/R從本研究已有的TaMADS2-T重組質(zhì)粒上擴(kuò)增一段204 bp的特異性片段作為VIGS的靶標(biāo)序列,使用NheⅠ將γ載體酶切線性化,使用一步克隆法構(gòu)建TaMADS2的VIGS重組載體γ-TaMADS2。

將病毒載體α、γ(Empty vector)、γ-PDS以及重組載體γ-TaMADS2使用Mlu Ⅰ進(jìn)行線性化,β使用Spe Ⅰ進(jìn)行線性化,使用RiboMAXTM-T7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物定量后分別將γ、γ-PDS、γ-TaMADS2與α、β等體積混合,組裝為BSMV:EV、BSMV:PDS和BSMV:TaMADS2這3種病毒,采用摩擦接種的方法接種于二葉一心期小麥的第二片葉。接種BSMV:PDS的小麥作為陽性對照來觀察沉默效果,PDS為八氫番茄紅素脫氫酶基因,若PDS被沉默則小麥葉片會(huì)出現(xiàn)白化表型;接種BSMV:TaMADS2的小麥作為試驗(yàn)組,檢測TaMADS2基因沉默小麥對葉銹菌的抗性變化;空質(zhì)粒BSMV:EV為陰性對照。病毒接種后第14天觀察接種BSMV:PDS小麥葉片的白化現(xiàn)象。將葉銹菌夏孢子Pt15均勻接種于BSMV:TaMADS2和BSMV:EV小麥葉片上。在接種葉銹菌后分別取樣進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),并在接種葉銹菌后的第10天觀察小麥葉片感病表型,分析TaMADS2基因沉默對于小麥抗病性的影響。

1.3 qRT-PCR檢測

接種葉銹菌后第12天分別對沉默組和對照組取樣,使用Trizol Reagent(CW0580S)和HiScript Ⅱ QRT SuperMix for qPCR(Vazyme,R223-01)分別提取樣品RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA。使用qRT-PCR檢測TaMADS2、PR1和PR2的相對表達(dá)量,分析TaMADS2的沉默效率以及葉銹菌侵染早期TaMADS2基因沉默對病程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平影響。

接種葉銹菌10 d后分別對試驗(yàn)組和陰性對照組取樣。提取樣品DNA后通過絕對定量測定各樣品中葉銹菌單拷貝基因PtRTP1和小麥單拷貝基因TaEF1的CT值,代入前期測定的特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線[25]得到2個(gè)基因的拷貝數(shù),計(jì)算PtRTP1和TaEF1基因的比例,獲得樣品的真菌生物量[26]。

1.4 組織學(xué)與活性氧染色觀察

接種葉銹菌后的24和48 h分別對沉默組和對照組小麥葉片進(jìn)行隨機(jī)取樣,參考肖繼斌[27]所列方法使用WGA-Alexa-488熒光染料對沉默組和對照組24及48 h樣品進(jìn)行處理,用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)活性氧染料對沉默組和對照組的48 h樣品進(jìn)行處理,在熒光顯微鏡下觀察菌絲生長與活性氧的積累情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 VIGS重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以TaMADS2-T載體為模板,使用引物TaMADS2-VIGS-F/R進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增,克隆得到204 bp的特異靶標(biāo)序列。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收,將回收產(chǎn)物與線性化γ載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取單克隆菌落,使用VIGS-text-F/R進(jìn)行單克隆測序,與靶標(biāo)序列一致即重組質(zhì)粒構(gòu)建完成可進(jìn)行下一步操作。將驗(yàn)證成功的菌落的質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化,重組質(zhì)粒片段小于線性化質(zhì)粒,說明重組質(zhì)粒成功線性化。將線性化的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,獲得病毒α、β、γ、γ-PDS以及γ-TaMADS2的RNA,用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 BSMV-VIGS沉默體系效果檢測

為驗(yàn)證本試驗(yàn)BSMV-VIGS沉默體系是否有效,在感染病毒14 d后觀察BSMV:PDS沉默表型。如圖1(a)所示,‘中國春’和‘鄭麥9023’小麥葉片在接種BSMV:PDS病毒后出現(xiàn)白化,而作為陰性對照的BSMV:EV未出現(xiàn)變化,證明本研究所用沉默體系能夠有效沉默小麥基因。利用qRT-PCR檢測感染BSMV病毒的小麥在接種葉銹菌后12 h葉片中TaMADS2基因的表達(dá)水平,進(jìn)一步證實(shí)TaMADS2基因是否被成功沉默。如圖1(b)和(c)所示,與感染BSMV:EV的小麥相比,感染BSMV:TaMADS2病毒的小麥的TaMADS2基因表達(dá)量顯著降低,結(jié)果表明感染BSMV:TaMADS2病毒有效的沉默了‘鄭麥9023’和‘中國春’中的TaMADS2基因表達(dá)。

BSMV:EV為陰性對照,BSMV:PDS為PDS基因沉默的小麥植株,BSMV:TaMADS2為TaMADS2基因沉默的植株。顯著性分析(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。下同。BSMV: EV is the negative control, BSMV: PDS is the PDS-silenced wheat plants, BSMV: TaMADS2 is the TaMADS2-slienced wheat plants. Significance analysis (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). The same below.圖1 接種BSMV病毒的小麥葉片表型及沉默效率檢測Fig.1 Phenotype and silencing efficiency of wheat leaves inoculated with BSMV virus

2.3 TaMADS2基因沉默后小麥抗病性分析

為解析TaMADS2基因在小麥抗葉銹病中的功能,分別對感染BSMV:EV和BSMV:TaMADS2病毒的小麥葉片接種葉銹菌,在第10天,觀察葉片感病表型。如圖2(a)所示,2個(gè)不同品種小麥感染病毒后,BSMV:TaMADS2的小麥葉片明顯比BSMV:EV的小麥葉片產(chǎn)生更多的葉銹菌孢子堆。對2種不同小麥葉片進(jìn)行分子病情指數(shù)檢測,與表型觀察結(jié)果相同,BSMV:TaMADS2小麥葉片的真菌生物量高于BSMV:EV的小麥葉片(圖2(b)和(c)),表明TaMADS2基因的沉默降低小麥對葉銹病的抗病性。

圖2 TaMADS2沉默植株及對照植株接種葉銹菌后的葉片表型及真菌生物量檢測Fig.2 Leaf phenotype and detection of fungal biomass of TaMADS2-slienced plants and control plants

對葉銹菌侵染的小麥葉片經(jīng)DAB染色后在組織學(xué)水平觀察活性氧積累上的變化,經(jīng)WGA染色,在組織學(xué)水平觀察葉銹菌在TaMADS2沉默植株中的生長情況。DAB染色后的活性氧觀察結(jié)果如圖3所示,在48 h時(shí)BSMV:EV樣品內(nèi)活性氧積累量顯著大于BSMV:TaMADS2樣品。WGA染色后的組織學(xué)觀察結(jié)果如圖4所示,在24和48 h,處理組BSMV:TaMADS2和對照BSMV:EV均可觀察到氣孔下囊和入侵菌絲,但處理組BSMV:TaMADS2中的氣孔下囊較對照BSMV:EV相比更大且入侵菌絲更長,表明TaMADS2基因的沉默可能促進(jìn)葉銹菌侵染初期入侵菌絲的擴(kuò)展。以上結(jié)果表明沉默TaMADS2基因可降低小麥對葉銹病的抗性。

圖3 葉銹菌侵染后的活性氧觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Fig.3 Observation of reactive oxygen species (ROS) and data statistics after inoculated with rust fungi

在接種葉銹菌后的12 h取樣檢測病程相關(guān)基因以及活性氧清除相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,其中PR1、PR2和CAT基因的表達(dá)量變化顯著。如圖5所示,同對照組BSMV:EV相比,感染BSMV:TaMADS2的2種小麥的PR1基因的表達(dá)量均降低,其中親和小麥品種‘中國春’中PR1表達(dá)量顯著降低90.22%,非親和小麥‘鄭麥9023’降低14.73%;感染BSMV:TaMADS2的2種小麥中PR2基因的表達(dá)量顯著低于感染BSMV:EV的小麥,分別下降46.67%和36.38%,表明TaMADS2的沉默顯著抑制了2個(gè)品種小麥中PR2的表達(dá)。CAT基因的表達(dá)量在感染BSMV:TaMADS2的小麥中相對于感染BSMV:EV的小麥分別降低17.80% 和24.15%,表明在葉銹菌侵染早期,TaMADS2基因可能通過活性氧清除酶(TaCAT)維持植株體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡。對這2種小麥表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),TaMADS2基因沉默后在親和/非親和小麥中PR1、PR2和CAT的表達(dá)量均呈下調(diào),表明TaMADS2基因可能通過PR1、PR2和CAT調(diào)控小麥葉銹菌抗性。

數(shù)據(jù)為40個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。Values are the average of 40 data.圖4 沉默TaMADS2后葉銹菌的組織細(xì)胞學(xué)分析Fig.4 Histocytology analysis of rust fungi growth in TaMADS2-silenced plants

圖5 TaMADS2沉默植株和對照植株接種葉銹菌后PR1、PR2和CAT基因的相對表達(dá)量Fig.5 The relative expression levels of PR1、PR2 and CAT genes in TaMADS2-silenced plants compared to control plants after inoculated with rust fungi

3 結(jié)論與討論

植物在生長發(fā)育的過程中為應(yīng)對多變的環(huán)境進(jìn)化出了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),各種轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子不僅是植物生長發(fā)育各個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)控因子,同時(shí)也在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[28]。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病過程中的作用越來越受到廣大研究者的關(guān)注,Khong等[29]發(fā)現(xiàn)水稻OsMADS26基因負(fù)調(diào)控水稻抗寒性以及對稻瘟病、白葉枯病的抗性。Guo等[24]發(fā)現(xiàn)小麥與條銹菌親和/非親和互作過程中,I型MADS-box基因TaMADS2在受到條銹菌的侵染早期上調(diào)表達(dá),在36和48 h分別出現(xiàn)下調(diào)表達(dá),推測該基因可能參與調(diào)控小麥的條銹菌抗性。Ma等[23]通過六倍體小麥的全基因組表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)MADS-box家族多種轉(zhuǎn)錄因子在赤霉菌、條銹菌和白粉菌等病原菌誘導(dǎo)下差異表達(dá)。本研究前期發(fā)現(xiàn)葉銹菌與親和/非親和小麥早期互作過程中,TaMADS2的表達(dá)量均受到葉銹菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),且在非親和小麥中TaMADS2的響應(yīng)時(shí)期較親和小麥更早。本研究選取葉銹菌小種Pt15的非親和品系‘鄭麥9023’以及親和品系‘中國春’,利用BSMV-VIGS技術(shù)分別沉默TaMADS2基因表達(dá),解析TaMADS2基因在小麥抗葉銹病中的功能。在接種病毒14 d后檢測TaMADS2基因的表達(dá)量,感染BSMV:TaMADS2的小麥中TaMADS2基因的表達(dá)水平顯著降低,TaMADS2基因沉默株系葉片上的葉銹菌孢子堆數(shù)量增多,分子病情指數(shù)增加。組織學(xué)觀察和活性氧觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染BSMV:TaMADS2的小麥葉片中病原菌生長速度更快,菌絲分枝數(shù)增多,活性氧積累量減少,說明沉默TaMADS2基因的表達(dá)降低了小麥對葉銹菌的抗性。

目前,病程相關(guān)蛋白(PRs)在植物抗病性以及系統(tǒng)獲得抗性中的作用已有廣泛報(bào)道,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PRs中PR1、PR2和PR5是植物抗病反應(yīng)和SAR(Systemic acquired resistance)的標(biāo)記基因[30]。PR1是在受到病原菌和SA大量誘導(dǎo)表達(dá)的PR蛋白[31],受侵染的組織中PR1的表達(dá)水平可以提高10 000倍,占整個(gè)葉片蛋白含量的1%～2%[32],因此被廣泛認(rèn)為是植物防御反應(yīng)的標(biāo)記基因。β-1,3-葡聚糖酶屬于PR2家族成員,而β-1,3-葡聚糖是很多植物病原菌細(xì)胞壁的重要組成成分,β-1,3-葡聚糖酶能夠催化β-1,3-葡聚糖多聚體的水解,從而抑制真菌的生長與增殖[33]。本研究中TaMADS2的沉默抑制了PR1和PR2基因的表達(dá),表明TaMADS2可能通過病程相關(guān)蛋白途徑抑制病原菌的生長,提高小麥對葉銹菌的抗性。

在早期的HR反應(yīng)中病原菌的侵染會(huì)引起活性氧的爆發(fā),活性氧可以直接作為抗菌物質(zhì)發(fā)揮作用[34]。過氧化氫酶(CAT)是生物防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵的活性氧清除酶類,能夠清除超氧化物陰離子自由基,將H2O2降解為無毒的H2O和O2-,保護(hù)植物免受活性氧毒害,在植物防御、脅迫應(yīng)答及控制細(xì)胞的氧化平衡中發(fā)揮重要的作用[35-36]。病程的發(fā)展伴隨著ROS的大量產(chǎn)生,而活性氧清除酶基因CAT的表達(dá)量也會(huì)隨之變化,常做為調(diào)控植物抵御病原菌的抗性參照指標(biāo)[37]。本研究在葉銹菌侵染早期,TaMADS2沉默植株中活性氧積累量減少,CAT的表達(dá)量亦下降,表明TaMADS2基因可能通過調(diào)控侵染點(diǎn)活性氧的積累影響葉銹菌的侵染過程。本試驗(yàn)測定了侵染早期(12 h)TaCAT轉(zhuǎn)錄水平的相對變化,呈現(xiàn)下調(diào)趨勢但未達(dá)顯著差異水平,表明其受到了TaMADS2表達(dá)變化的影響,可能參與了這一抗性調(diào)控。但更準(zhǔn)確描述CAT在TaMADS2調(diào)控小麥對葉銹菌抗性中作用,尚有待進(jìn)一步的研究。

本研究利用BSMV-VIGS技術(shù)初步驗(yàn)證了TaMADS2基因在小麥抗葉銹病中的功能,葉銹菌侵染下TaMADS2基因抑制表達(dá)植株的葉銹菌孢子堆增多,病菌生物量增加,菌絲生長速度顯著加快,活性氧積累量顯著減少,病程相關(guān)基因PR1和PR2表達(dá)量顯著減少,表明TaMADS2基因的沉默表達(dá)降低了小麥對葉銹菌的抗性。研究結(jié)果為進(jìn)一步解析TaMADS2基因在小麥抗葉銹病中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ),也為抗病性小麥品種的遺傳改良和利用提供了基因資源。