腸道微生物細(xì)胞外囊泡對心血管系統(tǒng)影響的研究進(jìn)展

黃露霈 成澤東

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院,遼寧 沈陽 110000; 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)科技處,遼寧 沈陽 110000)

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)已成為世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因,而動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心肌梗死、卒中和不穩(wěn)定型心絞痛等CVD的主要病理因素[1]。AS是一種慢性炎性動(dòng)脈疾病,是大部分CVD的始動(dòng)階段,其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,與炎癥、氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)和感染密切相關(guān)[2],而腸道微生物區(qū)系作為炎癥反應(yīng)的刺激點(diǎn)之一,在AS和CVD的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用,微生物來源的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)及其在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的溝通、攜帶物呈遞和宿主免疫調(diào)節(jié)中的功能成為疾病機(jī)制研究的新熱點(diǎn)。

目前在CVD中研究最多的是宿主細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)來源的EVs,與炎癥、血管功能障礙密切相關(guān)[1]。而腸道來源的EVs攜帶多種蛋白、遺傳物質(zhì)、酶和代謝產(chǎn)物等,同樣在CVD中起著不可忽視的作用?，F(xiàn)主要對EVs的主要功能及其影響心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制進(jìn)行闡述,以期為CVD的診斷與治療提供理論依據(jù)。

1 腸道微生物區(qū)系和AS

人體是一個(gè)超有機(jī)體,微生物通常與宿主為共生和互利的關(guān)系[3]。而腸道中的萬億細(xì)菌、病毒等構(gòu)成腸道微生物區(qū)系,腸道微生物區(qū)系通過釋放代謝產(chǎn)物,激活先天受體來影響宿主[3]。腸道微生物區(qū)系主要由兩個(gè)細(xì)菌門組成,即擬桿菌門和厚壁菌門,占人類腸道菌群的90%以上。

近十年的研究證明了腸道微生物群與CVD之間的因果聯(lián)系[4]。腸道菌群作為炎癥的扳機(jī)點(diǎn),脂質(zhì)代謝和糖代謝的關(guān)鍵階段,在心血管系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用不容忽視。

2 腸道細(xì)菌來源的EVs的結(jié)構(gòu)與功能

EVs是一種由原核生物、真核生物和古生物釋放的雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡狀小體,直徑為30～1 000 nm,擁有與親本細(xì)胞相似的細(xì)胞膜[5],本質(zhì)上是一種普遍的、可遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)募?xì)胞間通信媒介[6]。

1965年Bishop等[7]首次發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的細(xì)胞外囊泡(bacteria extracellular vesicles,BEVs),它是由細(xì)菌釋放的納米級的脂質(zhì)球形雙層膜結(jié)構(gòu),大小為20～400 nm,密度為1.133～1.201 g/mL,攜帶了如肽、蛋白質(zhì)(周質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、外膜蛋白等)、核酸、毒素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、磷脂、離子代謝物及信號分子等物質(zhì)[8],可與宿主和其他細(xì)菌進(jìn)行長距離的信息傳遞。不同種類的BEVs在結(jié)構(gòu)、大小、密度和分子量組成上是不同的[9],而BEVs的功能與結(jié)構(gòu)和其攜帶物有密切聯(lián)系。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的3種BEVs中,以外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)最為常見,大小為50～250 nm。革蘭氏陽性菌主要通過內(nèi)溶素觸發(fā)的細(xì)胞死亡產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)膜囊泡,它們通過脂磷壁酸與細(xì)胞質(zhì)膜連接,依賴Toll樣受體2激活免疫細(xì)胞[8]。

BEVs釋放是普遍存在的,在多種腸道共生菌和病原菌中都能觀察到,雙向的細(xì)菌-宿主通信不涉及直接細(xì)胞接觸,微生物和宿主來源的EVs都是這種域間串?dāng)_的關(guān)鍵因素[10],這是腸道微生物介導(dǎo)病原體-宿主相互作用的功能單元[11]。

BEVs是獨(dú)立的0分泌系統(tǒng)(type 0 secretion system,T0SS)。分泌系統(tǒng)是通過細(xì)胞膜輸出生物分子幫助細(xì)菌定植的工具,這些大分子結(jié)構(gòu)能將蛋白質(zhì)和DNA運(yùn)送到細(xì)胞外或靶細(xì)胞中[12],具有以下作用：(1)致病作用;(2)協(xié)同作用;(3)拮抗作用。因此BEVs能改善細(xì)菌的適應(yīng)性,并促進(jìn)菌群之間以及宿主和微生物之間的相互作用,被稱為T0SS。

BEVs是細(xì)菌的“防御工程”。BEVs是應(yīng)激反應(yīng)的體現(xiàn),不同菌株的BEVs產(chǎn)生速率是不同的,當(dāng)細(xì)菌受到外界因素(如溫度、氧氣、鐵、抗生素等)刺激時(shí)會(huì)大量釋放,BEVs是一種保護(hù)機(jī)制,它的產(chǎn)生量和速率與其生存能力正相關(guān)[9,13]。

BEVs是細(xì)菌的“遠(yuǎn)程武器”。BEVs攜帶的黏附分子可幫助細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞[14];BEVs的微生物/病原體相關(guān)分子模式也可與宿主來源的宿主模式識別受體接觸,引起宿主免疫耐受或免疫反應(yīng)。此外,BEVs含有多種毒力因子,可抑制其他細(xì)菌生長、截獲養(yǎng)分、損害其功能和防御能力以幫助親本細(xì)菌成功定植生態(tài)位[14]。

3 腸道來源的EVs對心血管系統(tǒng)的作用

腸道屏障受損和內(nèi)毒素血癥是CVD發(fā)展過程中的關(guān)鍵介質(zhì),而如今微生物EVs到達(dá)體循環(huán)的途徑主要是基于腸道滲漏理論。已有研究[15]證明BEVs可從腸道轉(zhuǎn)移到不同哺乳動(dòng)物的單個(gè)細(xì)胞中,而BEVs的轉(zhuǎn)移不僅可在腸道上皮細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)短期效應(yīng),而且還通過靶向腸道干細(xì)胞而產(chǎn)生遺傳變化。腸屏障破壞后,有毒物質(zhì)(如BEVs)進(jìn)入血液引起炎癥,而這又進(jìn)一步破壞腸道通透性[16-17],這會(huì)引起血清連蛋白(Zonulin)和含LPS的BEVs水平升高。在穩(wěn)定狀態(tài)下,少量BEVs仍可通過腸上皮的跨細(xì)胞作用逃逸到黏膜下通過血液傳播[18]。

動(dòng)脈硬化和炎癥反應(yīng)常貫穿CVD始終,而腸道菌群與二者有顯著的相互作用關(guān)系。Ziganshina等[19]在AS斑塊中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的DNA,這些細(xì)菌主要來源于腸道,如金黃色葡萄球菌、牙齦卟啉單胞菌等。在腸道中,柯林斯菌屬和乳酸桿菌屬在AS患者中高表達(dá),而羅氏菌屬和擬桿菌屬減少[4]。革蘭氏陰性菌廣泛存在于胃腸道中,細(xì)菌豐度的變化引起B(yǎng)EVs釋放增加,BEVs的攜帶物質(zhì)或許會(huì)激發(fā)機(jī)體慢性炎癥,促進(jìn)血管損傷和脂質(zhì)攝取,已報(bào)道的BEVs影響動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)機(jī)制見表1[20-31]。

3.1 幽門螺桿菌

幽門螺桿菌常定植于胃腸道,大部分存在于黏膜層,其OMVs通常被腸上皮細(xì)胞通過內(nèi)吞作用攝取,目前無進(jìn)入血液循環(huán)的證據(jù)[32]。幽門螺桿菌OMVs的細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxin associated gene A,CagA)和LPS通過活性氧(reactive oxygen species,ROS)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路促使內(nèi)皮損傷,加速AS斑塊的形成[33]。幽門螺桿菌EVs還可通過miR-25/KLF2軸調(diào)節(jié)NF-κB信號通路靶向調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的NF-κB活性增強(qiáng),血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule-1,ICAM-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1水平顯著升高[20],引起血栓形成和血管炎癥反應(yīng)。此外,幽門螺桿菌感染通過宿主細(xì)胞外切體來損害患者和小鼠的內(nèi)皮功能[21]。

表1 腸道微生物EVs對AS作用機(jī)制

3.2 擬桿菌

高膽固醇血癥是CVD的主要致病因素之一,革蘭氏陰性菌OMVs不僅能通過破壞腸道屏障來影響CVD患者脂質(zhì)代謝,加速脂質(zhì)堆積和AS斑塊的形成。尼曼-匹克C1型類似蛋白1(Niemann-Pick C1 like 1,NPC1L1)位于小腸黏膜上皮細(xì)胞中,是腸道膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)入血的關(guān)鍵蛋白,脆弱擬桿菌和多形擬桿菌的OMVs通過提高NPC1L1水平,引起腸道膽固醇吸收增加,這與膽固醇運(yùn)輸、脂類穩(wěn)態(tài)和膽固醇穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[22]。此外,高水平的NPC1L1也與血管內(nèi)皮功能障礙相關(guān),增加動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度、VCAM-1和ICAM-1的含量[23]。

3.3 嗜黏蛋白阿克曼菌

嗜黏蛋白阿克曼菌是一種黏蛋白降解菌,是人類腸道微生物中含量最豐富的單一物種之一,近年關(guān)于其對肥胖的機(jī)制研究[24]較多,肥胖是CVD的危險(xiǎn)因素之一,可導(dǎo)致血脂異常及胰島素抵抗。嗜黏蛋白阿克曼菌與其EVs作用相近,其EVs并未直接影響AS的癥狀或臨床指標(biāo),而是通過增加緊密連接蛋白的表達(dá),改善由高脂血癥引起的腸道屏障通透性,顯著減少高脂小鼠體重和脂肪重量,明顯降低血糖、膽固醇水平和代謝性炎癥反應(yīng)以此間接地改善心血管系統(tǒng)[25]。此外,普拉梭菌和嗜黏蛋白阿克曼菌EVs均能使過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)激活,以降低血脂水平和炎癥反應(yīng),提高斑塊的穩(wěn)定性[26]。

3.4 大腸桿菌

大腸桿菌是人類腸道中的機(jī)會(huì)致病菌,在CVD患者體內(nèi)該菌種數(shù)量顯著增加,且在人類AS斑塊中發(fā)現(xiàn)了來自大腸桿菌的LPS[34]。一項(xiàng)研究[27]表明,大腸桿菌OMVs可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則鈣振蕩,血液中肌鈣蛋白顯著增加,心壁厚度增加,心率加快;此外OMVs還能引起血管鈣化,能提高促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α、IL-6等的表達(dá),促進(jìn)CVD發(fā)生和發(fā)展,損傷心肌細(xì)胞和心功能。來自尿路致病性大腸桿菌、銅綠假單胞菌和淋球菌的OMVs能誘導(dǎo)依賴B細(xì)胞淋巴瘤因子-2家族成員促凋亡蛋白(BCL2 antagonist/killer,BAK)途徑和非依賴BAK途徑的線粒體凋亡,使巨噬細(xì)胞激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎癥小體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[28],NLRP3炎癥小體是驅(qū)動(dòng)血管炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。雖然目前無大腸桿菌、銅綠假單胞菌和淋球菌OMVs通過線粒體凋亡影響心血管系統(tǒng)的直接證據(jù),但線粒體凋亡與AS、心肌梗死和心房顫動(dòng)等CVD關(guān)系密切,在CVD發(fā)病機(jī)制研究方面有重大潛力。

3.5 古菌

古菌病毒也是腸道微生物區(qū)系中的重要組成部分,經(jīng)檢測共有56個(gè)古菌種存在于腸道,其中以產(chǎn)甲烷古菌屬最為豐富[35],古菌的存在與AS的加重呈正相關(guān)[36]。Moreno等[29]在重癥急性心肌梗死患者血清中檢測到大量具有高負(fù)電荷的古菌微泡(microvesicles,MVs)。古菌MVs數(shù)量與AS嚴(yán)重程度成正比,而在重癥患者的不穩(wěn)定斑塊中,肺炎支原體和古菌的共生會(huì)加劇外周血中這兩種病原體MVs的釋放,引起血清基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)水平顯著升高,MMP9引起的氧化應(yīng)激與斑塊破裂和血栓形成密切相關(guān)。

3.6 牙齦卟啉單胞菌

牙齦卟啉單胞菌屬于口腔菌群,但CVD與口腔菌群間的聯(lián)系已得到證實(shí),同時(shí)口腔菌群與腸道菌群存在相互作用,口腔細(xì)菌仍可定植于腸道[37]。牙齦假單胞菌及其OMVs可聚集血小板促使AS血栓形成[38],牙齦卟啉單胞菌OMVs還能直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,還可引起血管平滑肌細(xì)胞鈣化[30-31]。此外,其OMVs能通過裂解血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1來破壞血管內(nèi)皮通透性,這有助于免疫細(xì)胞通過內(nèi)皮向動(dòng)脈內(nèi)膜遷移來誘導(dǎo)血管炎癥[31]。

4 腸道來源的BEVs在CVD中的臨床價(jià)值

4.1 藥物載體與治療靶點(diǎn)

EVs具有獨(dú)特的低免疫原性、高穩(wěn)定性及高特異性等特點(diǎn),在CVD的治療中有較大應(yīng)用潛力[39-40]。天然的或生物改造過的BEVs同樣可作為藥物載體,利用其表面的配體-受體識別、基因和表面修飾與宿主細(xì)胞靶向結(jié)合[13],將藥物精確地輸送到細(xì)胞內(nèi),起到特異性、高效的治療作用。天然的BEVs在生物修飾后一定程度上能增強(qiáng)其穩(wěn)定性、生物活性以及呈遞、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向結(jié)合能力[41]。如產(chǎn)酶溶桿菌C3的外膜OMVs可將抗生素輸送到靶真菌生物體[42]。此外,由于BEVs高特異性靶向結(jié)合能力使其能成為治療靶點(diǎn)。Roufaiel等[43]提出,用LPS刺激模式識別受體后,可在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表面檢測到CD11c+活化蛋白C,能有效清除內(nèi)膜中的衣原體而不會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)。Xia等[21]證明中性鞘磷脂酶抑制劑GW4869抑制外切體分泌,可有效保護(hù)幽門螺桿菌感染小鼠的內(nèi)皮功能。

4.2 疫苗制備

由于BEVs外膜成分能誘導(dǎo)免疫反應(yīng),且具有低免疫原性和穩(wěn)定性,因此還可制備疫苗來防治CVD,或許將健康人群腸道BEVs注射到患者體內(nèi)將成為一種新方式[44]。目前已有將OMVs疫苗運(yùn)用到腦膜炎、淋病、腫瘤等疾病的研究報(bào)道[45-46]。近年來有不少關(guān)于用細(xì)菌來源的疫苗治療AS的報(bào)道,如肺炎鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌等[47-48],用牙齦卟啉單胞菌從鼻腔進(jìn)行接種,顯著減少了ApoE-/-小鼠的AS斑塊大小,治療效果可達(dá)到他汀類藥物組水平;間隔6個(gè)月接受2次13價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗接種,可使患者抗氧化低密度脂蛋白IgG和IgM抗體顯著增加,有效緩解因氧化低密度脂蛋白導(dǎo)致的免疫反應(yīng)。而OMVs能更有效地誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng),OMVs疫苗不僅能作為異種抗原載體,還具有跨屬保護(hù)的潛力[49]。但BEVs來源的疫苗也有局限性,OMVs能引起嚴(yán)重毒性反應(yīng)[46];由于目前技術(shù)的缺陷,BEVs產(chǎn)量低,不足以形成規(guī)模;易被其他細(xì)胞蛋白質(zhì)污染;去污劑可能破壞其膜成分會(huì)影響其特異性或呈遞功能;BEVs在不同產(chǎn)生途徑下所攜帶的物質(zhì)不同,激發(fā)的免疫反應(yīng)是不同的,如何進(jìn)行BEVs篩選和劑量確定也是亟待解決的問題。

5 展望

目前腸道菌群與CVD的相關(guān)研究還局限于有限數(shù)量的病原體-宿主之間的相互作用,胃腸道細(xì)菌EVs對CVD、AS、心肌梗死等作用機(jī)制研究仍處于初級階段。由于革蘭氏陽性菌的研究相對缺乏,本文主要聚焦于革蘭氏陰性菌EVs對CVD的影響,但革蘭氏陽性菌EVs又會(huì)對CVD加重或緩解產(chǎn)生什么作用,不同來源、種類和產(chǎn)生途徑的BEVs如何參與CVD的發(fā)生和發(fā)展,在不同的CVD中是否存在共同的致病BEVs,目前相關(guān)的研究與信息相對較少,這將給基于腸道菌群探討CVD的發(fā)病機(jī)制和治療方案提供不一樣的視角。