紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)鑒別中藥白及和其偽品“水白及”*

劉想晴 程旺興 秦亞?wèn)|

(1安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系 安徽蕪湖 241000；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽合肥 230012)

白及始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，藥用歷史悠久，療效顯著，來(lái)源于蘭科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥塊莖；具有收斂止血，消腫生肌的功效，常用于咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂[1]。白及中主要含有2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類、聯(lián)芐類、蒽醌類、螺環(huán)烷甾類皂苷、菲類、葡萄糖苷類、類胡蘿卜素等成分，其中2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類是蘭科植物含有的具有特殊結(jié)構(gòu)的化合物[3-5]。

白及應(yīng)用廣泛，主要集中在醫(yī)藥、美容、保健等領(lǐng)域，市場(chǎng)需求量較大，資源相對(duì)緊缺，導(dǎo)致大量混偽品出現(xiàn)。目前，市場(chǎng)上出現(xiàn)的白及混偽品統(tǒng)稱為“水白及”，據(jù)文獻(xiàn)記載，“水白及”多來(lái)源于蘭科天麻屬(Gastrodia)、杜鵑蘭屬(Cremastra)、美冠蘭屬(Eulophia)、筒瓣蘭屬(Anthogonium)、舌唇蘭屬(Platanthera)、獨(dú)蒜蘭屬(Pleione)、美冠蘭屬，百合科黃精屬(Polygonatum)、知母屬(Anemarrhena)等屬的多種植物在不同地區(qū)作為白及的混偽品使用[6-7]。“水白及”多為白及的近屬植物，其性狀特征與白及十分相似，容易造成混淆，運(yùn)用紅外技術(shù)建立白及和“水白及”鑒別的方法具有一定是價(jià)值和意義。

常見(jiàn)的白及的傳統(tǒng)鑒定方法主要包括性狀鑒別、顯微鑒別和理化性質(zhì)鑒別[8-10]，已有學(xué)者報(bào)道白及的DNA鑒別[11]、近紅外光譜[12]等，但尚未見(jiàn)紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量數(shù)在白及和“水白及”鑒別中的研究。鑒于此，該研究對(duì)白及和“水白及”共37批樣品的紅外光譜進(jìn)行自動(dòng)基線校正、平滑，二階求導(dǎo)等處理，進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，快速鑒別白及和“水白及”，為白及的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iN10 MX)、DTGS 檢測(cè)器、SMART ITR附件：美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司、高速多功能粉碎機(jī)：合肥億心程試驗(yàn)設(shè)備有限公司；無(wú)水乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 樣品來(lái)源與制備

白及及“水白及”樣品主要來(lái)源于安徽、云南、四川、貴州、廣西、湖南等地，除少量自采以外，樣品多采購(gòu)于藥材市場(chǎng)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。按照2020版《中國(guó)藥典》采收要求，將37批樣品，曬干，打粉，過(guò)80目篩備用，置4℃冰箱中保存。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 數(shù)據(jù)采集

精密稱取1.2節(jié)中制備的白及、“水白及”樣品粉末，平攤于SMART ITR附件的金剛石上，旋轉(zhuǎn)附件旋鈕將樣品固定，壓成透明薄片。利用傅里葉變換紅外光譜儀，在4000～525cm-1范圍內(nèi)采集紅外光譜，樣品壓片累積掃描16次，掃描速度為0.2 cm/s，間隔4cm-1，過(guò)程實(shí)時(shí)扣除H2O和CO2的干擾。

2.2 數(shù)據(jù)分析

采用OriginPro 2019軟件對(duì)白及和“水白及”共37批樣品的紅外光譜進(jìn)行自動(dòng)基線校正、平滑，并繪制紅外光譜圖，詳見(jiàn)圖1和圖2。再取樣品紅外光譜的平均圖譜作為紅外標(biāo)準(zhǔn)圖譜，并進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，得到相對(duì)應(yīng)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖，運(yùn)用Origin軟件進(jìn)行自動(dòng)尋峰，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，得到峰位、峰強(qiáng)等信息?；诩t外光譜數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(HCA)，使用SIMCA 16.1軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

圖1 19批白及的紅外光譜圖譜

圖2 18批“水白及”的紅外光譜圖譜

3 結(jié)果與分析

3.1 紅外光譜圖分析

從圖1中19批白及的紅外光譜圖譜可看出，白及樣品紅外光譜圖的峰形、峰位、峰高基本相似。如圖2所示，由于18批 “水白及”的來(lái)源不同，其紅外光譜圖在鋒形、峰位等方面存在一定的差異，粗略的可以分為3組，具體圖譜如圖3中B、C、D所示。19批白及藥材的紅外指紋圖譜相似(圖1所示)，主要吸收峰位于3366～3360、2977～2975、2932～2930、2894、2365～2362、2164、2025～2023、1976、1681～1679、1632、1587～1583、1526～1524、1450～1448、1386～1384、1326～1324、1268～1266、1226～1225、1147～1145、1087～1085、1050～1047、1007～1005、930～928、884、571～569cm-1等處。3363 cm-1附近強(qiáng)而寬的吸收峰為糖苷甾醇類、多糖、皂苷類化合物中O-H伸縮振動(dòng)峰。2930 cm-1附近吸收峰為C-H伸縮振動(dòng)峰；1679 cm-1處附近吸收峰表征為羰基C=O伸縮振動(dòng)；1632 cm-1處附近吸收峰表征為N-H彎曲振動(dòng)；1583、1525、1450 cm-1為苯環(huán)骨架C=C伸縮振動(dòng)，可能為聯(lián)芐類、蒽醌類、菲類化合物的吸收峰；1324 cm-1附近吸收峰為C-0伸縮振動(dòng)峰；1267 cm-1可能是C-O伸縮振動(dòng)和C-H彎曲振動(dòng)的疊加，多為糖苷類、脂類、多糖類中C=C骨架C=O-C伸縮振動(dòng)；1147 cm-1附近吸收峰為-COOH彎曲振動(dòng)；1048、1006、928 cm-1附近由多個(gè)吸收峰重疊成的寬強(qiáng)峰，為多糖、苷類等碳水化合物的C-O伸縮振動(dòng)。[13-16]

18批“水白及”紅外指紋圖譜(如圖2所示)，從整體上看具有較高的相似，由于市場(chǎng)上的“水白及”具有多個(gè)不同來(lái)源，其紅外光譜圖在峰形、峰位等方面存在一定的差異，粗略的可以分為3組，具體圖譜如圖3中B(S1、S3、S5、S7、S11)、C(S2、S4、S17)、D(S6、S8、S9、S10、S12、S13、S14、S15、S16、S18)所示。白及和“水白及”在4000～1800 cm-1區(qū)紅外指紋圖譜吸收峰稀少，在吸收峰的個(gè)數(shù)、峰形、峰位等方面基本一致，共有8個(gè)共有吸收峰。白及和“水白及”在1800～800 cm-1區(qū)的紅外指紋圖譜吸收峰較為密集，除去在1453～1444、1387～1381、1332～1324、1091～1083、1051～1046、885～879 cm-1處的7個(gè)共有峰之外，白及在1679、1632、1583、1525、1267、1147、1106、928 cm-1處有明顯吸收峰；3組“水白及”中B組在1719、1642、1272 cm-1處有明顯吸收峰，C組1715、1280、803 cm-1處有明顯吸收峰，D組在1717、1652、1417、1270、930、815 cm-1處有明顯吸收峰。白及和“水白及”在1800～800 cm-1區(qū)的紅外指紋圖譜除了吸收峰的不同，在吸收峰的峰形和峰強(qiáng)等方面也存在明顯區(qū)別，所以紅外光譜可以作為白及和“水白及”的鑒別依據(jù)。

圖3 白及(A)和“水白及”(B～D)紅外光譜圖(4000～525cm-1)

3.2 二階導(dǎo)紅外光譜圖分析

二階導(dǎo)數(shù)光譜，可以提高光譜圖的分辨率，在一定程度上減少紅外光譜重疊峰的疊加，使吸收峰變得窄而尖。采用Origin進(jìn)行二階導(dǎo)處理，選用Savitsky-Golay卷曲平滑法進(jìn)行平滑處理，得到特征峰明顯的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖；在紅外光譜圖中，1800 cm-1之前會(huì)受到-OH的影響，在800 cm-1之后基線的漂移過(guò)大，因此選擇1800～800 cm-1范圍，對(duì)白及和“水白及”二階導(dǎo)數(shù)光譜圖進(jìn)行分析[17-18]。

從圖4可以看出，在1800～1300 cm-1范圍內(nèi)，白及和“水白及”的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖在峰數(shù)、峰位、峰形、峰強(qiáng)上均存在明顯的差異，可以用于鑒定。從圖5可以看出，白及和“水白及”的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖在1300～800 cm-1范圍內(nèi)，區(qū)域1中白及在1224、1200、1154 cm-1處峰明顯，“水白及”(B)在1240、1197、1154 cm-1處峰明顯，“水白及”(C)在1202、1168、1135 cm-1處峰明顯，“水白及”(D)在1199、1167、1128 cm-1處峰明顯，白及的峰強(qiáng)顯高于“水白及”(B、C、D)的峰強(qiáng)；在區(qū)域2中白及在998、930 cm-1處峰明顯，“水白及”(B)在993、941 cm-1處峰明顯，“水白及”(C)在982、935 cm-1處峰明顯，“水白及”(D)在1015、983、928 cm-1處峰明顯，白及和“水白及”(D)的峰強(qiáng)顯高于“水白及”(B、C)的峰強(qiáng)。

圖4 白及(A)和“水白及”(B～D)二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖(1800～1300cm-1)

圖5 白及(A)和“水白及”(B～D)二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖(1300～800cm-1)

3.3 系統(tǒng)聚類分析(HCA)

以37白及和“水白及”樣品的紅外光譜為原始數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS27.0軟件，采用組間聯(lián)接法以平方歐式距離為分類依據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，得到聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖6；從圖中可知，當(dāng)歐氏距離為5時(shí)，37批樣品被分為兩類，19批白及聚為一類，18批“水白及”聚為一類。HCA分析結(jié)果表明，白及與“水白及”之間存在明顯差異。

圖6 白及和“水白及”聚類分析圖

3.4 主成分分析(PCA)

主成分分析是一種有效的解釋復(fù)雜數(shù)據(jù)的工具，通過(guò)對(duì)復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，將數(shù)據(jù)眾多變量的多元變量濃縮成少數(shù)主成分，前幾個(gè)主成分往往能夠在復(fù)雜的中藥體系中表征數(shù)據(jù)的總體信息，近年來(lái)，該方法在中藥評(píng)價(jià)和鑒別方面廣泛應(yīng)用[19-21]。為更加客觀的分析白及和“水白及”的差異性，選取紅外光譜在 1800～800 cm-1內(nèi)的數(shù)據(jù)，采用SIMCA 16.1軟件對(duì)白及和“水白及”共37個(gè)樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)，得到主成分分析得分圖(見(jiàn)圖7)，其中PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為96.8%和2.72%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)99.52%。模型解釋率參數(shù)R2X為0.992、預(yù)測(cè)能力參數(shù)為0.99，表征PCA模型的區(qū)分度和預(yù)測(cè)程度都較好。由圖7(A)可知，白及和“水白及”樣品分別分布在t[1]象限的負(fù)值區(qū)和正值區(qū)；如圖7(B)所示，各點(diǎn)的聚集狀態(tài)充分證明白及和“水白及”內(nèi)在成分不同。由此可見(jiàn)，PCA對(duì)白及和其偽品“水白及”樣品具有較好的區(qū)分效果。

A

3.5 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

在無(wú)監(jiān)督PCA分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行OPLS-DA分析(見(jiàn)圖8)，白及和“水白及”所處象限范圍與PCA分析結(jié)果一致，但組間的差異變大、組內(nèi)的差異變小。由圖8可知，白及樣品分布在t[1]負(fù)值區(qū)域，“水白及”樣品分布于t[1]正值區(qū)域，白及和“水白及”樣品可以達(dá)到較好的區(qū)分效果。模型解釋率參數(shù)R2X、R2Y分別為0.999、0.992，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.983，R2、Q2的數(shù)值均高于0.5，說(shuō)明模型穩(wěn)定性好，預(yù)測(cè)能力強(qiáng)[22-23]。如圖9所示，經(jīng)過(guò)200次置換檢驗(yàn)得到R2和Q2的Y軸截距分別為0.203和﹣0.59，說(shuō)明模型驗(yàn)證有效。

A

圖9 白及和“水白及”O(jiān)PLS-DA模型交叉驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

隨著白及藥材野生資源的枯竭，以及栽培技術(shù)的制約，近年來(lái)白及藥材的用量較大，價(jià)格居高不下，使得市場(chǎng)中出現(xiàn)多種混偽品。白及的混偽品主要來(lái)源于蘭科、百合科多種植物，其切片以后外形和白及較為相似，易與白及飲片造成混淆[7]。該研究運(yùn)用紅外光譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件，探討白及和其偽品“水白及”的快速鑒別方法。

通過(guò)紅外光譜指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)，白及和“水白及”在1800～800 cm-1區(qū)域內(nèi)存在明顯差異，除7共有峰之外，白及具有8處明顯吸收峰，3組“水白及”中B組具有3處有明顯吸收峰、C組具有3處有明顯吸收峰、D組具有6處有明顯吸收峰。從二階導(dǎo)數(shù)光譜圖中發(fā)現(xiàn)，白及和“水白及”在1800～800 cm-1峰位、峰形及峰強(qiáng)存在明顯差異，表明白及與“水白及”化學(xué)成分存在差異。

在運(yùn)用HCA、PCA、OPLS-DA方法后能明顯鑒別白及和“水白及”。通過(guò)系統(tǒng)聚類分析(HCA)，當(dāng)歐氏距離為5時(shí)，白及和“水白及”聚為兩類。PCA和OPLS-DA的分析結(jié)果一致，白及分布在t[1]象限負(fù)值區(qū)，“水白及”分布在t[1]象限正值區(qū)，其中OPLS-DA的分類結(jié)果最突出。該研究為白及和其偽品“水白及”的鑒別提供了快速、簡(jiǎn)便的方法，也為白及的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。