結(jié)直腸癌早期定期篩查研究進(jìn)展

蘇全琳,楊 萍,師 聲,張 靜,蘭文軍

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物醫(yī)學(xué)工程研究所,山東 濟(jì)南 250353

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)作為消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率位列第二[1]。近二十年間,發(fā)達(dá)國(guó)家中結(jié)直腸癌的發(fā)生率已顯著減少,但在中國(guó)呈上升趨勢(shì)[2]。CRC在早期是無(wú)癥狀或癥狀不明顯的,伴有間歇性腸胃不適、消化不良、大便潛血等癥狀,易被患者忽略,導(dǎo)致癌癥繼續(xù)發(fā)生發(fā)展、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[3]。CRC患者進(jìn)展為較明顯的癌前病變或發(fā)展成為癌需要5到10年甚至更長(zhǎng)的時(shí)間[4],因此根據(jù)身體狀況在這期間進(jìn)行早期定期篩查尤為重要。本文對(duì)CRC早期定期篩查相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 血液標(biāo)志物

1.1 蛋白質(zhì)標(biāo)志物

CRC腫瘤標(biāo)志物(tumor marker,TM)是由腫瘤細(xì)胞分泌對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有利或患者身體受腫瘤細(xì)胞脅迫所產(chǎn)生的一類物質(zhì),可用于衡量腫瘤細(xì)胞所處的生長(zhǎng)分期。臨床常見(jiàn)的TM主要有CA199、CA50、CA724、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)等。ATTALLAH 等[5]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定患者血清CEA、碳水化合物抗原19-9(CA19-9)、CK1和MUC1,用曲線下面積法(area under the curve,AUC)評(píng)估對(duì)腫瘤的診斷價(jià)值,結(jié)果顯示血清四項(xiàng)指標(biāo)均升高,且CRC>良性疾病>健康對(duì)照組,能夠反應(yīng)腫瘤的分期、淋巴結(jié)浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的情況。DOU等[6]開(kāi)發(fā)了用于血液II型半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CST4)檢測(cè)的抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 分析系統(tǒng),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting蛋白質(zhì)印記法分析了CST4在胃腸道腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況,并純化CST4重組蛋白,制備了抗CST4單克隆抗體,建立抗體夾心的ELISA分析系統(tǒng)檢測(cè)CST4,發(fā)現(xiàn)在CRC患者中CST4-mRNA及其表達(dá)蛋白在胃腸道腫瘤組織和細(xì)胞系中的含量明顯上調(diào),ELISA檢測(cè)CST4、胃癌(GC)和CRC的靈敏度和特異性明顯優(yōu)于臨床常用的標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4和CA125,表明了血液標(biāo)志物CST4在早期篩查結(jié)直腸癌的臨床診斷應(yīng)用價(jià)值。NING等[7]使用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)癌抗原CA19-9、CEA、胸腺嘧啶激酶1(TK1)和糖類抗原72-4(CA72-4)的水平,評(píng)估聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CRC的意義,發(fā)現(xiàn)TK1水平與腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及年齡顯著相關(guān)。利用二維電泳,串聯(lián)質(zhì)譜及印記法對(duì)結(jié)直腸癌和晚期腺瘤性息肉的蛋白組學(xué)分析顯示[8]:HPR、HP、ALB、KRT 1、APOA 1、FGB、IGJ、C4a等蛋白在息肉組織中的表達(dá)明顯低于正常人;血漿中FGB和C4A蛋白與結(jié)直腸癌的發(fā)展呈明顯相關(guān)性,提示其可作為早期診斷結(jié)直腸癌的血漿潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述,血液抗原標(biāo)志物可應(yīng)用于腫瘤分期、術(shù)后檢測(cè)和預(yù)后判斷等方面,但由于早期分泌水平較低,還應(yīng)進(jìn)一步提升檢測(cè)的靈敏度和特異性,以增加早期篩查的準(zhǔn)確性。

1.2 核酸標(biāo)志物

血液標(biāo)本核酸檢測(cè)主要以循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)和循環(huán)游離DNA(cfDNA)中BRAF(表1)、KRAS(表2)、NRAS等特定基因的突變和部分基因的甲基化(表3)、微小RNA及微衛(wèi)星改變作為檢測(cè)目標(biāo)[9]。

表1 BRAF基因常見(jiàn)致癌突變類型

表2 RAS基因常見(jiàn)突變

表3 常見(jiàn)的甲基化位點(diǎn)

利用ddPCR技術(shù)對(duì)ctDNA中的RAS和BRAF的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行檢測(cè),JUNCA等[10]報(bào)道,RAS和BRAF的SNP對(duì)晚期突變型CRC的敏感性高,但對(duì)進(jìn)展期腺瘤(AA)不敏感。XU等[11]采用real-time PCR技術(shù),對(duì)CRC ctDNA樣本中的Septin9、Syndecan-2(SDC2)和branched-chain amino acid transaminase 1(BCAT1)基因的甲基化進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸息肉患者與正常對(duì)照組ctDNA甲基化水平差異顯著,預(yù)示對(duì)CRC的早篩診斷有較好的診斷價(jià)值。WANG等[12]利用基因組學(xué)分析和焦磷酸測(cè)序,進(jìn)行了全基因組DNA甲基化分析,建立了一個(gè)基于CpG甲基化的CRC篩查模型,結(jié)果顯示:基于cg09239744和cg12587766兩個(gè)CpG位點(diǎn)的診斷模型對(duì)CRC和結(jié)直腸腺瘤患者的鑒別有意義,可用于結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺癌的早期定期篩查。ZHAO等[13]報(bào)道了以循環(huán)外泌體miRNA為結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的研究,從165例CRC患者和153例健康人群血清中分離外泌體miR-99b-5p和miR-150-5p,用透射電鏡、免疫印跡、新型外泌體粒徑分析儀和RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)循環(huán)外泌體進(jìn)行基因測(cè)序,結(jié)果顯示:與健康人群和良性疾病人群相比,CRC患者的外泌體miRNA水平顯著下調(diào),結(jié)直腸癌術(shù)后又顯著升高,因此血清循環(huán)外泌體miR-99b-5p和miR-150-5p可能可以用于結(jié)直腸癌的早期篩查。CAI等[14]篩選了六種在血漿和組織中具備更好待檢測(cè)能力的標(biāo)志物,建立了對(duì)CRC和進(jìn)展期腺瘤的血液多基因位點(diǎn)甲基化檢測(cè)方法,結(jié)果表明:相比于FIT、癌胚抗原和Septin 9單位點(diǎn)基因甲基化檢測(cè),這六種基因甲基化標(biāo)志物聯(lián)檢具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

與單一標(biāo)志物檢測(cè)相比,多個(gè)CRC標(biāo)志物聯(lián)檢的特異性和靈敏度更好,結(jié)果也更加精準(zhǔn)。采用real-time PCR、ddPCR、基因測(cè)序等技術(shù)對(duì)血液標(biāo)本中的基因突變、甲基化進(jìn)行聯(lián)檢,具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn),是未來(lái)CRC早期篩查的發(fā)展趨勢(shì)。

2 糞便標(biāo)志物

2.1 潛血相關(guān)標(biāo)志物

糞便潛血現(xiàn)象是由于腫瘤破裂、直腸息肉破裂、消化道出血、消化道潰瘍、痢疾和痤瘡等原因?qū)е录S便中含少量血液[15]。在結(jié)直腸癌早期,約有20%的患者可能出現(xiàn)便潛血檢測(cè)陽(yáng)性的現(xiàn)象,而CRC晚期病人的便潛血陽(yáng)性概率可達(dá)到90%以上[16],所以糞便潛血檢測(cè)是早期篩查結(jié)直腸癌的有效手段。目前,已被臨床認(rèn)可的糞便潛血檢測(cè)方法主要有:化學(xué)法、免疫法、膠體金免疫層析及質(zhì)譜等。

化學(xué)法是通過(guò)亞鐵血紅素來(lái)檢測(cè)糞便潛血現(xiàn)象,其中愈創(chuàng)木酯法(gFOBT)應(yīng)用最廣[17]。據(jù)報(bào)道,gFOBT對(duì)結(jié)直腸癌的檢測(cè)靈敏度和特異性可達(dá)79.4%和97.7%[18],但化學(xué)法檢測(cè)受限條件較多,易導(dǎo)致結(jié)果假陰性或假陽(yáng)性,目前已逐漸被糞便潛血免疫分析(faecal immunochemical test,FIT)所取代[19]。FIT是通過(guò)單克隆或多克隆抗體識(shí)別糞便中人血紅蛋白抗原等血液成分,以此監(jiān)測(cè)患者創(chuàng)口輕微出血的狀況,且不受飲食、藥物的干擾[16]。GUO等[20]研究表明,gFOBT檢測(cè)出晚期腫瘤的頻率低于FIT。對(duì)于晚期腫瘤,gFOBT的陽(yáng)性檢測(cè)值低于FIT,與gFOBT陰性組相比,FIT陰性組患間期癌的可能性降低77%。WIETEN等[21]研究表明,gFOBT陰性組比FIT陰性組的間期結(jié)直腸癌(iCRC)發(fā)生率更高,FIT陰性組和gFOBT陰性組分別每100 000人每年約有20和34個(gè)CRC漏檢患者出現(xiàn),因此FIT比gFOBT的檢測(cè)價(jià)值更高。

免疫法糞便潛血檢測(cè),主要包括以免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)的膠體金試紙法的定性FIT和免疫比濁法定量FIT。李佩等[22]對(duì)定性FIT和定量FIT檢測(cè)性能進(jìn)行了評(píng)估。其中,定性免疫法糞便潛血檢測(cè)組陽(yáng)性率比理論陽(yáng)性率高,靈敏度可達(dá)100.00%;定量免疫法糞便潛血檢測(cè)組陽(yáng)性率與理論陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其血紅蛋白水平與理論濃度高度相關(guān),靈敏度為86.21%。這表明,定性FIT靈敏度高,但特異性低于定量FIT;定性FIT由于其操作簡(jiǎn)便、成本便宜更加適合廣泛使用,而定量FIT可對(duì)病情做出更精準(zhǔn)的判斷。H?GBERG等[23]研究發(fā)現(xiàn):①使用定性FIT檢測(cè)直腸出血的606例患者,其靈敏度為96.2%,特異性為60.2%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為9.8%,陰性預(yù)測(cè)值為99.7%;②1421例無(wú)直腸出血患者的相應(yīng)數(shù)字分別為100%、73.6%、8.3%和100%,但FIT對(duì)高危腺瘤(HRA)的檢出率不高,只有42%。FIT聯(lián)合糞便鈣衛(wèi)蛋白(fecal calprotectin,FC)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)等標(biāo)志物的檢測(cè),有助于提高檢測(cè)靈敏度和特異性[24]。LIANG等[25]研究發(fā)現(xiàn),從糞便嗜鉻梭菌中分離出來(lái)的基因標(biāo)志物L(fēng)achnoclostridium(m3)比FIT的效能更高,聯(lián)合FIT和m3對(duì)晚期腺瘤的靈敏度可提升至56.8%,提示m3對(duì)基于糞便的腺瘤檢測(cè)有良好的效果。

綜上所述,結(jié)直腸癌患者FIT法比gFOBT法早期篩查效果更佳,擁有更好的進(jìn)展期腺瘤檢出敏感度,是CRC大規(guī)模篩查的最佳選擇。

2.2 核酸標(biāo)志物

CRC腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育迅速,細(xì)胞分裂快且粘附性差,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷地脫落到腸腔中。與此類似,糞便核酸檢測(cè)主要是測(cè)定腸道脫落細(xì)胞中的KRAS、NRAS、BRAF等特定基因位點(diǎn)的突變和BMP3、NDRG4、p33ING1b等基因甲基化的表觀遺傳生物標(biāo)志物的異常變化[26],從而判斷CRC的發(fā)生發(fā)展?fàn)顩r[17],指導(dǎo)患者個(gè)性化治療。

核酸在糞便和血液中的存在是微量的,因此需要利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、數(shù)字PCR和基因測(cè)序等高靈敏度高特異性的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)[27]。未知的突變致癌基因位點(diǎn)核酸序列的檢測(cè)一般采用全基因組甲基化測(cè)序、全基因組測(cè)序、外顯子測(cè)序以及RNA末端平行分析法等。對(duì)已知突變致癌基因位點(diǎn)的檢測(cè)一般采用數(shù)字PCR技術(shù)、磁珠乳液擴(kuò)增技術(shù)[28]、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)、基于深度測(cè)序的腫瘤個(gè)體化指紋圖譜、雙向焦磷酸解激活的聚合反應(yīng)、標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)樸等[29]。

糞便核酸檢測(cè)在CRC無(wú)創(chuàng)篩查中應(yīng)用前景廣闊。LIU等[30]研究顯示,SFRP2、SFRP1、TFPI2、BMP3、NDRG4、SPG20和BMP3+NDRG4基因甲基化水平對(duì)CRC檢測(cè)的敏感性為70%,特異性為80%,鑒別性與區(qū)分度良好,這些發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了DNA甲基化作為糞便中微創(chuàng)生物標(biāo)志物診斷CRC和腺瘤的可行性。CARETHERS等[31]研究發(fā)現(xiàn),多靶點(diǎn)糞便DNA(mt-sDNA)檢測(cè)CRC的靈敏度為92%,且mt-sDNA檢測(cè)對(duì)晚期腺瘤和無(wú)柄鋸齒狀息肉的檢出率均比FIT檢出率要高,同時(shí)總體特異性略低。通過(guò)對(duì)KRAS突變、NDRG4/BMP3啟動(dòng)子甲基化和血紅蛋白的檢測(cè),CRC早期篩查研究也顯示:mt-sDNA和FIT檢測(cè)的特異性分別為89%和93%,mt-sDNA的靈敏性較優(yōu)[31-32]。據(jù)報(bào)道[33],FIT-DNA聯(lián)檢對(duì)CRC、癌前病變和高危腺瘤的靈敏度和陽(yáng)性率均高于定性膠體金法和定量免疫法,對(duì)正常健康腸道和其他性質(zhì)的疾病假陽(yáng)性比率也小于定性膠體金法和定量免疫法,這提示:多靶點(diǎn)糞便FIT-DNA聯(lián)檢是早期篩查CRC經(jīng)濟(jì)有效的方法,對(duì)提高腸鏡檢查的依從性和檢出率有幫助。無(wú)創(chuàng)診斷FIT-DNA聯(lián)檢CRC最為準(zhǔn)確,但對(duì)高危腺瘤(HRA)的檢出率僅有42%,有極大的隱患。BARNELL等[34]研究發(fā)現(xiàn),糞便真核RNA序列(stool-derived eukaryotic RNA,seRNA)是檢測(cè)高危腺瘤的絕佳標(biāo)志物,采用二代測(cè)序聯(lián)合靶向擴(kuò)增的方法,檢測(cè)HRA的靈敏度為45%,特異性為87%,相較于FIT-DNA聯(lián)檢法具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述,糞便核酸標(biāo)志物的檢測(cè)靈敏度較高,但因存在的干擾因素較多,核酸含量較低,特異性較免疫法糞便潛血檢測(cè)略低。

3 討論與展望

結(jié)腸鏡檢是結(jié)直腸癌篩查的金標(biāo)準(zhǔn),但不宜進(jìn)行常規(guī)定期早篩檢查。雖然基于核酸擴(kuò)增和膠體金免疫層析的FIT-DNA聯(lián)檢在CRC早期篩查中展現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和特異性(≥90%),但多靶點(diǎn)表觀遺傳學(xué)液體活檢以其取材潔凈、良好的特異性和靈敏度而逐漸得到認(rèn)可,后者可能成為未來(lái)CRC早期定期篩的首選方法,而DNA-RNA聯(lián)檢是CRC早期篩查及腺瘤鑒別的發(fā)展趨勢(shì)。