基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與數(shù)據(jù)挖掘探討中藥調(diào)節(jié)壞死性凋亡的用藥規(guī)律

郭家敏，郭宵飛，孫詩(shī)藝，李靜靜，鄧曉曦，張 平

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102）

壞死性凋亡（necroptosis）又被稱為程序性壞死，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞凋亡的條件缺少時(shí)，受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）及其下游的受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）和混合譜系激酶域樣蛋白（MLKL）將會(huì)激活壞死性凋亡的通路［1，2］。它不依賴于半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）活性，當(dāng)caspase-8 依賴的凋亡通路被阻斷時(shí)，腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、TOLL 樣受體（TLR）等的刺激作用可激活RIPK1，募集RIPK3 并發(fā)生磷酸化，活化的RIPK3調(diào)控MLKL 誘導(dǎo)其寡聚化，易位至質(zhì)膜內(nèi)葉破壞細(xì)胞膜的完整性，因此細(xì)胞表達(dá)RIPK3 以及caspase-8分子受到抑制是壞死性凋亡發(fā)生的必備條件［3-6］。

壞死性凋亡存在于腫瘤、自身免疫病等多種疾病的發(fā)生過(guò)程中，而研究壞死性凋亡干預(yù)制劑也逐漸成為新的研究熱點(diǎn)［7，8］。已有研究表明逍遙散、大黃蟄蟲(chóng)丸等中藥復(fù)方通過(guò)調(diào)節(jié)壞死性凋亡治療疾?。?-11］，然而中藥在壞死性凋亡領(lǐng)域的研究仍較少，暫未系統(tǒng)地總結(jié)出中藥用藥規(guī)律，因此本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選壞死性凋亡相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的小分子化合物，通過(guò)化合物的橋接作用篩選相關(guān)中藥并挖掘其性味歸經(jīng)信息，總結(jié)中藥使用規(guī)律，為壞死性凋亡干預(yù)制劑的研發(fā)提供一定的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 獲取壞死性凋亡相關(guān)靶點(diǎn)

借 助GeneCards （http：//www.genecards.org）［12］、DrugBank （http：//go.drugbank.com/）［13］、TTD（https：//bidd.nus.edu.sg）［14］、DisGeNET （www.disgenet.org）［15］、OMIM （https：//omim.org）［16］數(shù) 據(jù)庫(kù)，以“necroptosis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得壞死性凋亡相關(guān)靶點(diǎn)，利用UniProt （https：//www.uniprot.org）［17］數(shù)據(jù)庫(kù)查尋靶點(diǎn)全稱。

1.2 篩選候選化合物并構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）篩選與壞死性凋亡靶點(diǎn)相關(guān)的化合物。候選化合物應(yīng)滿足ADME 標(biāo) 準(zhǔn) 及Lipinski 規(guī) 則［18］：口 服 生 物 利 用 度≥30%，類藥性［19］≥0.18，半衰期≥4，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)［20］≤10，拓?fù)錁O性表面積［21］＜140，分子量≤500 Da。將收集到的靶點(diǎn)、候選化合物導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)。

1.3 獲取中藥及性味歸經(jīng)信息并構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)

使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與候選化合物相關(guān)的中草藥，合并去重后規(guī)范中藥名稱并匹配性味歸經(jīng)信 息，將《中 華 人 民 共 和 國(guó) 藥 典》［22］、《中 藥 學(xué)》［23］、《中華本草》［24］中無(wú)法查找到相關(guān)信息的中藥予以刪除。將化合物-中藥信息與“1.2”項(xiàng)得到的靶點(diǎn)-化合物信息一同導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape3.9.1軟件中Analyze Network 模塊功能分析該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)屬性值［25，26］。為了更加直觀地展示壞死性凋亡及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)、化合物、中藥之間的關(guān)系，本研究選取度值≥6 的中藥及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)、化合物進(jìn)一步構(gòu)建核心靶點(diǎn)-化合物-中藥相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，評(píng)估中藥及化合物干預(yù)壞死性凋亡的功效強(qiáng)度［27］。

1.4 主要靶點(diǎn)-化合物分子對(duì)接

分子對(duì)接能夠判斷靶點(diǎn)與候選化合物作用關(guān)系的可信度，因此選取核心網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5 的靶點(diǎn)（度值≥8）與度值排名前8 的化合物（度值≥10）進(jìn)行分子對(duì)接，判斷核心網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)與化合物作用關(guān)系強(qiáng)度［28］。靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)文件利用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行下載并使用PyMOL 軟件去除晶體結(jié)構(gòu)中的水分子，通過(guò)AutoDockTools-1.5.7 軟件（ADT）加全氫并設(shè)置為受體導(dǎo)出pdbqt 格式［29］。候選化合物的MOL2 結(jié)構(gòu)從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行下載，通過(guò)ADT 軟件加全氫設(shè)置為配體導(dǎo)出pdbqt 格式。運(yùn)用ADT 插件Autodock4 進(jìn)行分子對(duì)接并使用PyMOL 軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 壞死性凋亡相關(guān)靶點(diǎn)

分別從GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得636、19個(gè)壞死性凋亡相關(guān)靶點(diǎn)，其他數(shù)據(jù)庫(kù)未檢索出相關(guān)靶點(diǎn)。GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)可根據(jù)布爾模型（Boolean）計(jì)算相關(guān)性值得出各靶點(diǎn)的Score 評(píng)分，Score評(píng)分越高表示該靶點(diǎn)與壞死性凋亡的相關(guān)程度越高。因此篩選出GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中Score 值前10%的靶點(diǎn)作為壞死性凋亡相關(guān)靶點(diǎn)，與OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)所得19 個(gè)靶點(diǎn)合并后去除重復(fù)值，一共得到79個(gè)靶點(diǎn)，其中有21 個(gè)靶點(diǎn)能夠匹配到小分子化合物，所匹配的小分子化合物能夠滿足ADME 及Lipinski 規(guī)則的靶點(diǎn)12 個(gè)，因此這12 個(gè)靶點(diǎn)可看作是與壞死性凋亡相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 壞死性凋亡潛在靶點(diǎn)基本信息Tab 1 Basic information on potential targets of necroptosis

2.2 候選化合物結(jié)果及靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以各靶點(diǎn)的蛋白名稱作為檢索詞，檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共得到與潛在靶點(diǎn)相關(guān)的化合物517個(gè)，其中滿足ADME 標(biāo)準(zhǔn)及Lipinski 規(guī)則的候選化合物191 個(gè)，根據(jù)檢索結(jié)果構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。該網(wǎng)絡(luò)由204 個(gè)節(jié)點(diǎn)和351 條邊組成，圖中藍(lán)色六邊形表示候選化合物，粉色菱形表示潛在靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)度值越高所示圖形越大，表示該靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越關(guān)鍵。網(wǎng)絡(luò)中度值前5 的靶點(diǎn)為GSK3B、MAPK14、BCL2、TNF、TP53，分 別 對(duì) 應(yīng)162、122、16、15、12 個(gè)化合物；度值排名靠前的化合物主要有槲皮素（quercetin）、漢黃芩素（wogonin）、雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide）、甘草查爾酮（licochalcone a）、玫瑰樹(shù)堿（ellipticine）分別與7、5、4、4、3 個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)。

圖1 壞死性凋亡靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Necroptosis apoptosis target-compound network

2.3 篩選中藥并構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出389 味與候選化合物相關(guān)的中藥，其中可匹配到性味歸經(jīng)者366 味，通過(guò)化合物的聯(lián)接作用構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由569 個(gè)節(jié)點(diǎn)以及1 397 條邊組成。其中度值排名前10 味的中藥分別是甘草、丹參、苦參、半枝蓮、桑葉、葛花、雞血藤、降香、菊花、山豆根，分別對(duì)應(yīng)48、10、10、10、10、9、9、9、9、9 個(gè)化合物，見(jiàn)圖2。利用化合物的聯(lián)接性統(tǒng)計(jì)中藥相關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)數(shù)目，連翹可作用11 個(gè)靶點(diǎn)，甘草、銀杏葉、敗醬草、半邊蓮等均可作用10 個(gè)靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。由于化合物度值的中位數(shù)是3，因此將網(wǎng)絡(luò)中度值＞6 的化合物視為核心化合物，其中度值居前5 位的化合物分別為β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素，見(jiàn)表2。為展示調(diào)節(jié)壞死性凋亡的核心中藥及相關(guān)靶點(diǎn)、化合物，從上述網(wǎng)絡(luò)中篩選出度值≥6的中藥及其對(duì)應(yīng)的化合物、靶點(diǎn)構(gòu)建核心靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含177 個(gè)節(jié)點(diǎn)、546 條邊，其中黃色箭頭表示靶點(diǎn)、粉色六邊形表示化合物、綠色菱形表示中藥，度值越高節(jié)點(diǎn)形狀越大，見(jiàn)圖4。對(duì)366 味中藥性味歸經(jīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示調(diào)節(jié)壞死性凋亡的中藥多為寒性、溫性，味多苦、辛，多歸肝經(jīng)、肺經(jīng)，見(jiàn)圖5。

表2 中藥干預(yù)壞死性凋亡潛在核心化合物（度值＞6）Tab 2 Potential core compounds of traditional Chinese medicine intervention in necroptosis（degree value＞6）

圖3 中藥靶點(diǎn)數(shù)（前20 位）Fig 3 Number of traditional Chinese medicine target points （Top 20）

圖4 核心靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Core target-compound-traditional Chinese medicine network

圖5 中藥性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)圖Fig 5 Statistical chart of the meridian distribution of traditional Chinese medicine

2.4 分子對(duì)接結(jié)果

將核心靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)中高度值（≥8）靶點(diǎn)GSK3B（PDB ID：5K5N）、MAPK14（PDB ID：1WBS）、BCL2（PDBID：2W3L）、TNF（PDB ID：2AZ5）、TP53（PDB ID：5O1H）與高度值（≥10）化合物進(jìn)行分子對(duì)接。根據(jù)結(jié)合能與氫鍵數(shù)綜合評(píng)估分子對(duì)接的結(jié)果，其中結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol 的靶點(diǎn)與化合物對(duì)接活性良好，結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol 則表示對(duì)接活性強(qiáng)烈，形成氫鍵數(shù)越多的靶點(diǎn)與化合物對(duì)接質(zhì)量越好［29］。結(jié)果顯示，對(duì)接結(jié)合能最高的為T(mén)P53-kaempferol（-9.89 kcal/mol），結(jié)合能最低的為BCL2-quercetin（-4.75 kcal/mol），40組對(duì)接結(jié)果平均結(jié)合能為-6.80 kal/mol；對(duì)接氫鍵數(shù)最多為8 個(gè)，最少者沒(méi)有對(duì)接氫鍵，平均氫鍵個(gè)數(shù)為4，提示所選核心靶點(diǎn)與化合物結(jié)合活性較強(qiáng)，對(duì)接質(zhì)量較好，見(jiàn)圖6、7。綜合考慮分子對(duì)接結(jié)合能和氫鍵個(gè)數(shù)，選擇對(duì)接情況較好的4 個(gè)組合進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)展示，見(jiàn)圖8。

圖7 核心靶點(diǎn)-化合物分子對(duì)接氫鍵數(shù)熱圖Fig 7 Thermal diagram of hydrogen bond numbers of core target-compound molecular docking

圖8 調(diào)節(jié)壞死性凋亡核心靶點(diǎn)與化合物分子對(duì)接結(jié)構(gòu)圖Fig 8 Structural diagram of the docking between the core target of regulating necroptosis and compound molecules

3 討論

作為細(xì)胞程序性死亡的一種方式，壞死性凋亡在多種疾病的病理過(guò)程發(fā)揮著雙重作用，一方面壞死性凋亡發(fā)生時(shí)釋放的胞內(nèi)物質(zhì)能夠參與固有免疫反應(yīng)，另一方面其釋放的炎性物質(zhì)又會(huì)加劇炎癥反應(yīng)［30］。因此單一的壞死性凋亡干預(yù)制劑無(wú)法解決其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)理，而具有多種成分、靶點(diǎn)的中藥逐漸變成新藥研發(fā)的重要來(lái)源。

研究結(jié)果顯示，高度值靶點(diǎn)有GSK3B、MAPK14、BCL2、TNF、TP53 等。其中GSK3B 基因編碼的蛋白GSK3β 失活可使RIPK1 抑制劑受到抑制，從而誘導(dǎo)壞死性凋亡［31］。BCL2 在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中具有重要作用，BCL2 家族蛋白協(xié)調(diào)線粒體外膜（MOM）的透化，MOM 透化（MOMP）導(dǎo)致促凋亡分子的激活，而B(niǎo)CL2 蛋白家族調(diào)節(jié)壞死性凋亡的具體作用機(jī)制目前尚不清楚［32］。TNF 是一種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，MAPK14 及其底物MAPKAPK2（MK2）在TNF 誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，RIP3 是TNF 引起的壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，RIP3 表達(dá)缺失可能會(huì)降低細(xì)胞對(duì)壞死性凋亡刺激的敏感性，從而促進(jìn)細(xì)胞存活和腫瘤發(fā)生［33］。TP53 基因?qū)僖环N腫瘤抑制基因，它在活性氧（ROS）誘導(dǎo)的壞死性凋亡中起作用，它在線粒體基質(zhì)中積累并與親環(huán)蛋白-D（CypD）形成復(fù)合物，這是ROS 產(chǎn)生并導(dǎo)致線粒體PTP 開(kāi)放進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體腫脹和壞死性凋亡所必需的［34，35］。

根據(jù)篩選結(jié)果，化合物度值較高的有槲皮素、漢黃芩素、雷公藤甲素、甘草查爾酮A 等，這些化合物與靶點(diǎn)連接較多，被認(rèn)為是干預(yù)壞死性凋亡的主要活性成分。槲皮素屬于黃酮醇類化合物，它具有多種生物學(xué)特性，能夠通過(guò)抑制大鼠脊髓損傷后M1 巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞極化來(lái)減輕少突膠質(zhì)細(xì)胞的壞死性凋亡［36］。壞死性凋亡是急性腎損傷發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵事件，而漢黃芩素被證明可以通過(guò)靶向RIPK1 介導(dǎo)的壞死性凋亡來(lái)抑制急性腎損傷中的炎癥反應(yīng)和腎小管細(xì)胞死亡［37］。RIPK1-RIPK3-MLKL 信號(hào)通路已被廣泛認(rèn)為是壞死性凋亡的主要介導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇可通過(guò)該通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡從而發(fā)揮抗癌作用［38］。TLR 在壞死性凋亡的發(fā)生過(guò)程中有著重要作用，研究顯示甘草查爾酮 A 以劑量依賴 性 方 式 抑 制TLR4 表 達(dá)，MAPK 和NF-κB 活 化，而TLR4 的過(guò)表達(dá)能夠部分消除甘草查爾酮 A 對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥和TLR4 信號(hào)激活的抑制作用［39］。

中藥方面，甘草、連翹、銀杏葉、杜仲等可干預(yù)壞死性凋亡的靶點(diǎn)較多，是調(diào)節(jié)壞死性凋亡的重要中藥。研究發(fā)現(xiàn)甘草主要成分異甘草素、連翹主要成分連翹苷均可通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，而NF-κB 信號(hào)通路是壞死性凋亡誘發(fā)炎癥反應(yīng)的常見(jiàn)機(jī)制，因此推測(cè)甘草、連翹均可抑制壞死性凋亡所致的炎癥反應(yīng)［40-42］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，銀杏葉提取物761（EGb761）可以通過(guò)減弱RIP1 介導(dǎo)的線粒體功能障礙抑制細(xì)胞壞死性凋亡，因此推測(cè)該途徑可能為銀杏葉調(diào)節(jié)壞死性凋亡的機(jī)制；杜仲主要成分杜仲苷則可通過(guò)抑制壞死蛋白MLKL 和RIP1 進(jìn)而抑制壞死性凋亡發(fā)揮對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用［43，44］。分子對(duì)接結(jié)果顯示，多數(shù)化合物與靶點(diǎn)之間對(duì)接活性良好，其中化合物luteolin 與isorhamnetin 表現(xiàn)突出。luteolin、isorhamnetin均可通過(guò)抑制NF-κB 通路控制炎癥，這與壞死性凋亡誘導(dǎo)炎癥通路相類似，推測(cè)luteolin、isorhamnetin可通過(guò)該途徑調(diào)節(jié)壞死性凋亡［45，46］。

中藥性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，調(diào)節(jié)壞死性凋亡潛在中藥多苦寒、辛溫，苦味“能瀉，能燥，能堅(jiān)”，多有燥濕瀉熱的功效；《內(nèi)經(jīng)》云“治熱以寒”“熱者寒之”，寒性藥多可清熱瀉火，因此苦寒藥用于治療濕熱互結(jié)證。辛味藥多有調(diào)達(dá)氣機(jī)、通行血脈的功效；溫性藥可溫里散寒，辛溫藥臨床多用于治療表證。潛在中藥多歸肝、肺二經(jīng)，《素問(wèn)》曰：“肝生于左，肺藏于右”“肝者，將軍之官，謀慮出焉”“肺者，相傅之官，治節(jié)出焉”，肝臟以升發(fā)為宜，肺臟以肅降為順，二者一升一降共同調(diào)理全身氣機(jī)?，F(xiàn)代研究也顯示壞死性凋亡的終末效應(yīng)物MLKL 的缺失可減少小鼠肝損傷以及肝臟纖維化，這表明壞死性凋亡常造成不同程度的肝損傷，故調(diào)節(jié)壞死性凋亡的潛在中藥多歸屬肝經(jīng)［47］。綜上推測(cè)，壞死性凋亡中醫(yī)病機(jī)多為肝郁化火，木火刑金；病性多屬熱證、表證、實(shí)證；病位多在肝，與肺密切相關(guān)；治療上以清熱瀉火、解表散邪為治則。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法結(jié)合數(shù)據(jù)挖掘初步探討了中藥調(diào)節(jié)壞死性凋亡的物質(zhì)基礎(chǔ)及用藥規(guī)律，為從中醫(yī)層面解讀壞死性凋亡等細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制提供思路，為中西醫(yī)結(jié)合治療壞死性凋亡相關(guān)疾病提供借鑒。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于數(shù)據(jù)庫(kù)的定量分析，因此本研究?jī)H從理論層面闡述了壞死性凋亡相關(guān)靶點(diǎn)、化合物、中藥之間的關(guān)系，存在一定的局限性，結(jié)果有待更深入的實(shí)驗(yàn)性研究予以證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

郭家敏、郭宵飛、李靜靜、鄧曉曦：論文選題與研究設(shè)計(jì)；孫詩(shī)藝：數(shù)據(jù)的核驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)；郭家敏：數(shù)據(jù)分析，論文起草；郭宵飛、孫詩(shī)藝：論文修訂；張平：對(duì)論文的指導(dǎo)與審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。