西洋參抗心臟肥大的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究

邱雨美,李冰濤,歐陽(yáng)長(zhǎng)生,謝夢(mèng)蝶,李洪銘,涂 珺,尚廣彬,湯喜蘭,4

研究顯示,2019年全球心血管疾病患病人數(shù)為5.23億例,死亡人數(shù)為1 860萬(wàn)例[1]。我國(guó)心血管疾病現(xiàn)患人數(shù)為3.3億例,因心血管疾病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位,受城鎮(zhèn)化進(jìn)程及人口老齡化加速的影響,我國(guó)心血管疾病的患病率及死亡率仍處于上升階段[2]。臨床上多種心血管疾病如高血壓、冠心病及心肌炎等都會(huì)引起心臟肥大。心臟肥大早期仍可維持正常的心臟功能,但持續(xù)的心臟肥大會(huì)導(dǎo)致心力衰竭、心律失常及猝死等嚴(yán)重后果[3]。

西洋參(Panax quinquefolius)為五加科人參屬植物,主產(chǎn)于加拿大安大略和魁北克、美國(guó)威斯康辛等地,已在我國(guó)吉林和山東等地引種栽培[4]。西洋參味甘、微苦,性涼,入心、肺、腎經(jīng),具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效,用于治療氣虛陰虧、虛熱煩倦、咳喘痰血、內(nèi)熱消渴、口燥咽干等癥[5]。西洋參主要含有人參皂苷、多糖、揮發(fā)油、有機(jī)酸、甾醇、氨基酸及蛋白質(zhì)類等成分[6],具有保護(hù)心臟[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、降血糖[10]及增強(qiáng)免疫力[11]等作用。研究表明,西洋參對(duì)于冠狀動(dòng)脈結(jié)扎、異丙腎上腺素及血管緊張素Ⅱ等多種因素誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大、心力衰竭模型具有良好的保護(hù)作用[12-14],但西洋參抗心臟肥大的作用機(jī)制尚未明確。因此,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析西洋參抗心臟肥大的作用靶點(diǎn)及機(jī)制,進(jìn)一步在大鼠H9c2心肌細(xì)胞肥大模型上對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,以期為西洋參用于心血管疾病的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 西洋參活性成分及藥物靶點(diǎn)的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,http://tcmspw.com)收集西洋參的主要化學(xué)成分,以“西洋參”為關(guān)鍵詞,后對(duì)其包含的所有化合物根據(jù)吸收、分布、代謝和排泄(ADME)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行潛在活性成分篩選,參數(shù)設(shè)置為:口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18。運(yùn)用中醫(yī)藥百科全書(ETCM,http://ww.tcmip.cn/ETCM/)和查找已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)一步補(bǔ)充西洋參的活性成分。將成分輸入有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)(PubChem,http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov),根據(jù)類藥五原則(Lipinski原則,氫鍵供體數(shù)≤5個(gè)、氫鍵受體數(shù)≤10個(gè)、相對(duì)分子量≤500、脂水分配系數(shù)≤5、化合物中可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10個(gè)),選擇符合2項(xiàng)規(guī)則以上的成分,獲取Canonical SMILES號(hào),并通過基于多靶點(diǎn)定量構(gòu)效關(guān)系的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)(Targetnet,http://targetnet.scbdd.com/)和小分子藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在線平臺(tái)(Swiss Target Prediction,http://www.swisstargetprediction.ch/)以顯著性水平(Prob)>0為原則篩選西洋參的作用靶點(diǎn);利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot(https://www.uniprot.org/)查詢每個(gè)蛋白靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名,確定物種來源為“Human”并建立數(shù)據(jù)庫(kù),用于后續(xù)分析。

1.2 心臟肥大疾病靶點(diǎn)的篩選 通過人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,http://www.omim.org)、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、基因名片數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards,http://www.genecards.org/),以“cardiomyocyte hypertrophy”為關(guān)鍵詞,收集已知驗(yàn)證的與心臟肥大相關(guān)的人類基因,刪去重復(fù)項(xiàng),取并集,獲得心臟肥大相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 西洋參抗心臟肥大潛在靶點(diǎn)的獲取 將西洋參成分靶點(diǎn)與心臟肥大疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),提取同時(shí)出現(xiàn)在藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)中的共同靶點(diǎn),即為西洋參治療心臟肥大的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 西洋參抗心臟肥大潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 打開STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/),進(jìn)入頁(yè)面首先選擇“multiple proteins”條目,輸入獲得的交集靶點(diǎn)名稱,物種限定為“Homo sapiens”,最低相互作用閾值設(shè)為中等“Medium confidence(0.400)”,隱藏游離節(jié)點(diǎn),其余參數(shù)保持默認(rèn)值進(jìn)行檢索,下載蛋白-蛋白相互作用(PPI)結(jié)果(tsv格式文件),而后將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析,通常根據(jù)度中心性Degree值,計(jì)算其平均數(shù),以大于平均數(shù)的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中為重要靶點(diǎn),大于平均數(shù)2倍的為關(guān)鍵靶點(diǎn),獲得西洋參治療心臟肥大的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 生物信息學(xué)基因本體(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 使用注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID,https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對(duì)上述篩選得到的重要靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能及分子信號(hào)通路的富集分析。其中,從生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cell component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個(gè)水平進(jìn)行GO富集分析,選擇BP校正P值最小的前15個(gè)條目進(jìn)行可視化;并使用基迪奧生物信息云平臺(tái)(Omicshare在線平臺(tái),https://www.omicshare.com/)將KEGG富集程度較高的前20條通路繪制成氣泡圖。

1.6 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 細(xì)胞株、藥物和試劑 大鼠H9c2細(xì)胞株購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心;異丙腎上腺素(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):Z21N10X103254,純度≥99.2%);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司,批號(hào):8121192);胎牛血清(美國(guó)Gemini公司,批號(hào):A15H74K);磷酸鹽緩沖液(PBS)(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào):GP21010070226);0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司,批號(hào):2120732);噻唑藍(lán)(MTT)試劑(廣州賽國(guó)生物科技有限公司,批號(hào):EZ3455C328);DEPC處理水(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,批號(hào):G430KA5395);RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑[Takara寶生物工程(大連)有限公司,批號(hào)分別為:AJG1902A、AL12354A、AK81975A]。

1.6.2 儀器 MI52-N倒置顯微鏡(廣州明美光電技術(shù)有限公司),Spectra Max Plus384 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司),TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),CFX96TMReal-Time PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.6.3 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活力檢測(cè) 將H9c2心肌細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的西洋參,根據(jù)加入西洋參濃度的不同分為12.5 μg/mL西洋參組、25.0 μg/mL西洋參組、50.0 μg/mL西洋參組、100.0 μg/mL西洋參組、200.0 μg/mL西洋參組,將加入含0.1%二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基作為正常組。藥物作用24 h后進(jìn)行MTT法檢測(cè),在酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(OD),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IC%)=(正常組OD-西洋參各濃度組OD)/正常組OD×100%,觀察西洋參對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響。

1.6.4 心肌細(xì)胞表面積檢測(cè) 采用異丙腎上腺素10 μmol/L復(fù)制H9c2心肌細(xì)胞肥大模型,以心肌細(xì)胞表面積增大和心臟肥大相關(guān)胚胎基因心房鈉尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)、α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(α-SKA)表達(dá)上調(diào)表明模型制作成功。將5×103個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中,接種24 h后將細(xì)胞分為正常組(加入與其他各組等體積的溶媒0.2% DMSO)、模型組(加入異丙腎上腺素10 μmol/L)、西洋參干預(yù)組(預(yù)先1 h加入西洋參100.0 μg/mL,而后加入異丙腎上腺素10 μmol/L)、西洋參單獨(dú)組(加入西洋參100.0 μg/mL)。藥物作用24 h后,采用明美顯微數(shù)碼測(cè)量分析系統(tǒng)拍照并運(yùn)用ImageJ軟件測(cè)量心肌細(xì)胞面積。

1.6.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 將1×105個(gè)心肌細(xì)胞接種于35 mm的培養(yǎng)皿中,接種24 h后,實(shí)驗(yàn)分組和加藥同1.6.4。藥物作用24 h后,按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA并定量。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。以18S rRNA為內(nèi)參基因,采用10倍稀釋制作內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,稀釋范圍為10-5～1,根據(jù)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算心臟肥大相關(guān)胚胎基因ANP、β-MHC、α-SKA及關(guān)鍵靶點(diǎn)基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的相對(duì)表達(dá)水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 西洋參潛在活性化合物及其作用靶點(diǎn) 通過TCMSP平臺(tái)及ETCM共檢索到西洋參活性成分45個(gè),去除無(wú)明確對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化學(xué)成分共獲得有效活性成分42個(gè)(見表2),去除重復(fù)項(xiàng)得到西洋參作用靶點(diǎn)共558個(gè)。

表2 西洋參活性成分信息

2.2 西洋參治療心臟肥大的潛在作用靶點(diǎn) 經(jīng)過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,刪除重復(fù)項(xiàng)靶點(diǎn)獲得心臟肥大疾病靶點(diǎn)809個(gè),通過Venny 2.1.0軟件獲取西洋參和心臟肥大的作用靶點(diǎn)交集,其中共同作用靶點(diǎn)41個(gè),約占集合總數(shù)的3.1%,獲得西洋參和心臟肥大的Venny圖,詳見圖1。

圖1 西洋參活性成分靶點(diǎn)與心臟肥大相關(guān)靶點(diǎn)Venny圖

2.3 西洋參抗心臟肥大潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲得的交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,并借助Cytoscape 3.8.0進(jìn)行可視化,刪除游離項(xiàng)(見圖2)。圖中節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn),邊為靶點(diǎn)之間的聯(lián)系;節(jié)點(diǎn)的顏色及大小反映節(jié)點(diǎn)的Degree值,顏色越深、節(jié)點(diǎn)越大則其Degree值越大,邊的粗細(xì)反映連接程度,邊越粗,連接越緊密。在西洋參抗心臟肥大作用PPI網(wǎng)絡(luò)中,有21個(gè)靶點(diǎn)的Degree值大于平均值,其中VEGFA(28)、AKT1(26)、EGFR(25)、TNF(25)、MAPK1(24)是Degree值大于平均數(shù)2倍的靶點(diǎn),為關(guān)鍵靶點(diǎn),可能在西洋參治療心臟肥大的過程中發(fā)揮重要作用。

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 利用DAVID在線平臺(tái)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中大于平均Degree值的21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。GO分析共獲得247個(gè)條目,其中BP分類主要包括一氧化氮合成過程的正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、肽基-絲氨酸磷酸化的正調(diào)控(positive regulation of peptidyl-serine phosphorylation)等193個(gè)條目;CC分類主要包括細(xì)胞膜質(zhì)(plasma membrane)、細(xì)胞表面(cell surface)、蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein complex)等26個(gè)條目;MF分類主要包括酶結(jié)合(enzyme binding)、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、支架蛋白結(jié)合(scaffold protein binding)等28個(gè)條目。根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR值)由小到大排序,篩選出BP結(jié)果中前15條繪圖(見圖3)。KEGG富集分析共獲得89條信號(hào)通路,80條信號(hào)通路的閾值P<0.05,選取前20條信號(hào)通路,借助Omicshare平臺(tái)繪制西洋參作用于心臟肥大的可視化氣泡圖(見圖4)。西洋參抗心臟肥大主要與癌癥蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等有關(guān)。上述結(jié)果提示西洋參主要活性成分的作用靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)過程的多樣化,并分布于不同的代謝通路。

圖3 西洋參治療心臟肥大GO生物過程富集分析

圖4 西洋參治療心臟肥大的KEGG富集分析

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.5.1 不同濃度西洋參對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響 12.5 μg/mL西洋參組、25.0 μg/mL西洋參組、50.0 μg/mL西洋參組、100.0μg/mL西洋參組心肌細(xì)胞抑制率與正常組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而200 μg/mL西洋參組與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。故本研究選用100.0 μg/mL的西洋參用于評(píng)價(jià)對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響。詳見表3。

表3 不同濃度西洋參對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響(±s)

2.5.2 西洋參對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響 與正常組比較,模型組心肌細(xì)胞表面積增加,ANP、β-MHC、α-SKA mRNA表達(dá)上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,西洋參干預(yù)組心肌細(xì)胞表面積降低,ANP、β-MHC、α-SKA mRNA表達(dá)均下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,西洋參單獨(dú)組心肌細(xì)胞表面積及ANP、β-MHC、α-SKA mRNA表達(dá),差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖5、圖6。

與正常組比較,＊ P<0.05;與模型組比較,# P<0.05。圖5 西洋參對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積的影響(n=6)

與正常組比較,＊ P<0.05;與模型組比較,# P<0.05。圖6 西洋參對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大基因表達(dá)的影響(A為ANP mRNA相對(duì)表達(dá)量,B為β-MHC mRNA相對(duì)表達(dá)量,C為α-SKA mRNA相對(duì)表達(dá)量,n=6)

2.5.3 西洋參對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1基因表達(dá)的影響 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)富集分析篩選顯示VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1可能是西洋參干預(yù)心臟肥大的關(guān)鍵靶點(diǎn)。qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組比較,模型組心肌細(xì)胞VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1 mRNA表達(dá)上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與模型組比較,西洋參干預(yù)組心肌細(xì)胞VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1 mRNA表達(dá)下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖7、圖8。

與正常組比較,＊P<0.05;與模型組比較,# P<0.05。圖7 西洋參對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞VEGFA、AKT1、EGFR基因表達(dá)的影響(A為VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)量,B為AKT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量,C為EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量,n=5)

與正常組比較,＊P<0.05;與模型組比較,# P<0.05。圖8 西洋參對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞TNF、MAPK1基因表達(dá)的影響(A為TNF mRNA相對(duì)表達(dá)量,B為MAPK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量,n=5)

3 討 論

心臟肥大是心肌組織為適應(yīng)多種病理刺激如血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷、循環(huán)激素增加等因素而產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng),是多種心血管疾病如高血壓、冠心病等的常見并發(fā)癥,其病理改變表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、心臟胚胎基因重編程和一些心臟發(fā)育期的轉(zhuǎn)錄因子重新激活、心臟收縮和舒張功能降低、膠原纖維沉積及心臟重構(gòu)等[3,15]。西洋參以其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)在心臟肥大等心血管疾病的防治研究和應(yīng)用較為廣泛。西洋參及其活性成分具有抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善血液循環(huán)、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多方面的作用[16]。研究表明,西洋參提取物可通過阻斷p115Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子-Ras同源基因家族成員A/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(p115RhoGEF-RhoA/ROCK)依賴的絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)激活而抑制瘦素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[17],可通過阻斷蛋白激酶A(PKA)激活和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化而減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大[13],還可通過調(diào)節(jié)脂肪酸和葡萄糖的氧化緩解血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟肥大[14]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從TCMSP和ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)中共篩選出42種西洋參活性成分,再與OMIM、TTD 以及GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的心臟肥大相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì),獲得西洋參抗心臟肥大靶點(diǎn)41個(gè)。進(jìn)一步PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明,VEGFA、AKT1、EGFR、TNF和MAPK1可能是西洋參抗心臟肥大的關(guān)鍵靶點(diǎn)。VEGFA是血管生成的關(guān)鍵介質(zhì),其與心臟的關(guān)系是雙向的,一方面,受炎癥、機(jī)械應(yīng)力、內(nèi)皮素-1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等刺激因素的影響,心肌細(xì)胞分泌和釋放VEGFA;另一方面,VEGFA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞激活,促進(jìn)心肌組織的血管生成,增強(qiáng)心肌的收縮和存活[18]。研究表明,在異丙腎上腺素或主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)誘導(dǎo)的小鼠心臟肥大模型中,VEGFA表達(dá)上調(diào)[19-20]。AKT1為絲/蘇氨酸蛋白激酶,參與調(diào)節(jié)心臟生長(zhǎng)、增殖、遷移和代謝,與心臟肥大密切相關(guān)[21]。研究表明,心臟中長(zhǎng)期AKT1的激活可降低心肌線粒體的氧化能力而導(dǎo)致心臟肥大[22]。AKT1在血管緊張素Ⅱ灌注誘導(dǎo)的心臟肥大模型和高血壓心肌纖維化模型中均表達(dá)上調(diào)[23-24]。EGFR是受體型蛋白酪氨酸激酶,廣泛表達(dá)于心臟和血管組織中,EGFR通路參與細(xì)胞增殖、分化和周期調(diào)控等生物過程,與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明,EGFR激活可促進(jìn)內(nèi)脂素、血管緊張Ⅱ等誘導(dǎo)的心肌肥大[25-26],抑制EGFR活性和EGFR依賴的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路可緩解心臟肥大[27-28]。TNF-α介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)激活參與了心臟肥大,人參皂苷Rg1抑制TNF-α/NF-κB信號(hào)通路可緩解主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大[29]。MAPK1參與多種炎性因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡。研究發(fā)現(xiàn),在主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)或異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心臟肥大時(shí),心肌細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)蛋白磷酸化水平增加[30]。

為進(jìn)一步探討西洋參抗心臟肥大的作用機(jī)制,本研究對(duì)西洋參抗心臟肥大關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO功能富集分析顯示西洋參抗心臟肥大的作用機(jī)制涉及CC的細(xì)胞膜質(zhì)、細(xì)胞表面和蛋白質(zhì)復(fù)合物,BP主要與一氧化氮合成過程的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路以及肽基-絲氨酸磷酸化的正調(diào)控相關(guān),MF主要與酶結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性以及支架蛋白結(jié)合相關(guān)。KEGG通路富集分析表明,西洋參抗心臟肥大主要與癌癥蛋白多糖、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路等有關(guān)。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的基礎(chǔ)上,本研究選擇大鼠H9c2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察了西洋參抗心肌細(xì)胞肥大作用,并對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)VEGFA、AKT1、EGFR、TNF和MAPK1的基因表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。異丙腎上腺素屬于兒茶酚胺類物質(zhì),可興奮心肌細(xì)胞的β受體,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、心臟胚胎基因重新激活表達(dá)[15]。本研究結(jié)果顯示,西洋參100.0 μg/mL可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積增加及心臟胚胎基因ANP、β-MHC與α-SKA mRNA的表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明,西洋參100 .0μg/mL抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1 mRNA表達(dá)上調(diào),這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果相一致。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)西洋參抗心臟肥大的作用靶點(diǎn)及通路進(jìn)行了分析,而后通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了西洋參抗心臟肥大作用,并對(duì)其抗心臟肥大的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證和探討,為深入研究西洋參防治心血管疾病的藥理機(jī)制和臨床應(yīng)用提供參考。