基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討三黃瀉心湯治療膿毒癥心功能障礙的作用機(jī)制研究

陳芳良,古惠文,衛(wèi)勁沂,毛 帥,2

膿毒癥是一種臨床常見(jiàn)疾病,具有發(fā)病急、病情進(jìn)展快等特點(diǎn),嚴(yán)重影響病人的健康及生命安全。膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,多和機(jī)體感染、免疫、炎癥等病理生理過(guò)程相關(guān),其中炎癥反應(yīng)過(guò)度、免疫系統(tǒng)失衡是病情發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[1]。膿毒癥所導(dǎo)致的免疫功能紊亂貫穿于整個(gè)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,并可誘發(fā)多器官功能障礙,包括呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等。膿毒癥心功能障礙的發(fā)生率為50%～70%[2-4]。心臟功能的損傷對(duì)膿毒癥預(yù)后影響較大,心功能障礙會(huì)顯著減少心排血量,導(dǎo)致有效循環(huán)容量減少,從而加劇組織缺氧、線粒體功能和代謝障礙,前期研究表明,合并心功能障礙使膿毒癥病人死亡率增高3～5倍[5]。因此,探索防治膿毒癥心功能障礙的新方法、新策略是目前重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。研究表明,膿毒癥心功能障礙的發(fā)病可能與炎性因子對(duì)心肌的抑制、心肌線粒體酶的抑制以及凋亡蛋白酶的激活等過(guò)程相關(guān)[6]。因此,清除心肌炎性因子、調(diào)節(jié)免疫功能、改善心肌能量代謝和抑制心肌細(xì)胞凋亡可能是治療膿毒癥心功能障礙的關(guān)鍵[7]。研究表明,中醫(yī)藥能夠抑制膿毒癥病人炎癥反應(yīng)、降低炎性因子水平、改善微循環(huán)和減輕心肌缺血缺氧等從而發(fā)揮治療膿毒癥心功能障礙的作用[8]。

三黃瀉心湯又名“三黃湯”“伊尹三黃湯”,由大黃、黃連、黃芩組成。該方首載于東漢張仲景所撰《金匱要略·驚悸吐衄下血胸滿(mǎn)瘀血病脈證治第十六》:“心氣不足、吐血、衄血,瀉心湯主之。大黃二兩,黃連、黃芩各一兩,右三味以水三升,煮取一升,頓服之[9]”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),三黃瀉心湯具有抗菌、抗炎、胃黏膜保護(hù)、改善高脂血癥、改善血液黏稠度等作用,臨床應(yīng)用較為廣泛[10]。三黃瀉心湯具有抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)和抗氧化等作用[11]。三黃瀉心湯中的大黃酸、小檗堿和黃芩苷被證實(shí)具有抑制氧化應(yīng)激、清除炎性介質(zhì)的作用[12]。但既往研究多是對(duì)某一作用機(jī)制進(jìn)行研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)“目標(biāo)藥物-疾病-基因”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和數(shù)據(jù)的可視化處理,用于預(yù)測(cè)藥物活性成分靶點(diǎn)和相對(duì)應(yīng)的靶向疾病途徑,有助于從多維度探討藥物治療疾病的作用機(jī)制[13-14]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法,利用多種相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建“三黃瀉心湯-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-膿毒癥心功能障礙”網(wǎng)絡(luò),多維度探討三黃瀉心湯對(duì)膿毒癥心功能障礙的潛在機(jī)制,為臨床和基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)和新的思路。

1 資料與方法

1.1 三黃瀉心湯活性成分的獲取及靶點(diǎn)篩選 以“三黃瀉心湯”和“高效液相色譜/HPLC”為關(guān)鍵詞,在中國(guó)知網(wǎng)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,共獲得3篇相關(guān)文獻(xiàn):2020年傅丹青等[15]運(yùn)用高效液相法研究三黃瀉心湯中主要成分大黃素、黃芩苷、鹽酸小檗堿的溶出規(guī)律,但其研究成分較少;2018年李智勇等[16]采用高效液相色譜法研究發(fā)現(xiàn),三黃瀉心湯配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)煎劑的化學(xué)成分存在一定差異,但缺乏生物等效研究;而2018年水棟等[17]運(yùn)用高效液相色譜技術(shù)(包括專(zhuān)屬性試驗(yàn)、線性范圍檢查、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)、供試驗(yàn)品含量測(cè)定)對(duì)三黃瀉心湯13個(gè)有效成分(巴馬汀、表小檗堿、大黃酚、大黃素、大黃酸、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃連堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、藥根堿、小檗堿)的含量進(jìn)行了測(cè)定,各成分的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1,其中,蒽醌類(lèi)和黃酮類(lèi)共8種成分的含量在同一色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,所用方法快捷、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng),具有良好的精密度和重復(fù)性,故選為本次研究的主要有效成分。使用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)(PubChem,http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查詢(xún)成分相應(yīng)分子結(jié)構(gòu)(Canonical SMILES格式),上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲取三黃瀉心湯潛在作用靶點(diǎn),由于Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄蘆薈大黃素的作用靶點(diǎn),因此,借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP)補(bǔ)充預(yù)測(cè)蘆薈大黃素的潛在作用靶點(diǎn),最后在Uniprot(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)將蛋白質(zhì)靶點(diǎn)名稱(chēng)規(guī)范化。

圖1 三黃瀉心湯中主要成分含量柱狀圖

1.2 膿毒癥心功能障礙疾病靶點(diǎn)篩選 以“sepsis-induced myocardial dysfunction”為關(guān)鍵詞在人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards,https://www.genecards.org/)和人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,https://omim.org/)中獲取膿毒癥心功能障礙相關(guān)潛在靶點(diǎn),匯總并刪除重復(fù)靶點(diǎn)后獲得膿毒癥心功能障礙對(duì)應(yīng)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選 將三黃瀉心湯活性成分的靶點(diǎn)與膿毒癥心功能障礙的靶點(diǎn)同時(shí)導(dǎo)入Venn 2.1.0在線軟件作圖工具平臺(tái)進(jìn)行Venn分析,獲得藥物與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn),即為三黃瀉心湯治療膿毒癥心功能障礙的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建核心靶蛋白相互作用(PPI)關(guān)系網(wǎng)絡(luò) 將上述獲得的交集靶點(diǎn)上傳至蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫(kù)(STRING,http://string-db.org/),并將物種設(shè)置為人(Homo sapiens),將最低作用閾值設(shè)置為0.400,其他參數(shù)則保留默認(rèn)設(shè)置,隱藏未關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn),并運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥物與疾病之間的交集蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將三黃瀉心湯13種有效成分及交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中,構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。利用軟件中的“Network Analyzer”功能進(jìn)行分析,并根據(jù)Degree值篩選出關(guān)鍵活性成分及靶點(diǎn)。其中藥物活性成分和作用靶點(diǎn)以“節(jié)點(diǎn)”表示,節(jié)點(diǎn)之間的相互作用以“邊”表示。

1.6 基因本體(geneon tology,GO)功能富集和京都基因及基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析 運(yùn)用注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID,https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),設(shè)置“Homo sapiens”,對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。使用微生信在線繪圖網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)將結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7 分子對(duì)接 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB,https://www.rcsb.org/)檢索并下載PPI網(wǎng)絡(luò)柱狀圖排名前3位的核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)PDB格式文件,并用PyMOL 2.5.0軟件進(jìn)行去除水分子和配體的操作及運(yùn)用Autodock Tools1.5.6軟件進(jìn)行加氫處理。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索三黃瀉心湯的13種有效成分并下載其化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)SDF文件,通過(guò)PyMOL軟件轉(zhuǎn)換成PDB文件。利用Autodock Tools 1.5.6軟件將化合物及靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)文件轉(zhuǎn)換為pdbqt格式,確定對(duì)接受體的活性口袋。利用Autodock Vina進(jìn)行虛擬對(duì)接,輸出20個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果。最后使用PyMOL軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 三黃瀉心湯活性成分的獲取及潛在靶點(diǎn)篩選 刪除重復(fù)值后獲得三黃瀉心湯13種主要有效成分、511個(gè)相關(guān)潛在作用靶點(diǎn),由此可以推測(cè)三黃瀉心湯具有多成分、多靶點(diǎn)的藥理特點(diǎn)。

2.2 膿毒癥心功能障礙疾病靶點(diǎn)篩選 從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并刪除重復(fù)值,共獲得膿毒癥心功能障礙相關(guān)靶點(diǎn)基因352個(gè);將三黃瀉心湯活性成分靶點(diǎn)與膿毒癥心功能障礙靶點(diǎn)同時(shí)在線導(dǎo)入Venn 2.1.0在線軟件作圖工具平臺(tái)進(jìn)行Venn分析,獲得三黃瀉心湯與膿毒癥心功能障礙交集靶點(diǎn)51個(gè)(見(jiàn)圖2)。由此可知,三黃瀉心湯可以通過(guò)多種成分作用于膿毒癥心功能障礙的多個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮作用。

圖2 三黃瀉心湯與膿毒癥心功能障礙相關(guān)交集基因韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將三黃瀉心湯13種有效成分及三黃瀉心湯與膿毒癥心功能障礙的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中,構(gòu)建“藥物-成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖3)。利用軟件中的“Network Analyzer”功能進(jìn)行分析,并根據(jù)Degree值篩選出關(guān)鍵有效成分,有效成分的Degree值越大,表明其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大,其中Degree值排名前3位的有效成分是大黃酸、大黃素、表小檗堿。所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)共包括65個(gè)節(jié)點(diǎn)、143條邊線,藍(lán)色橢圓形代表三黃瀉心湯有效成分,青色八邊形代表交集靶點(diǎn),每個(gè)潛在的藥物活性成分都與疾病靶點(diǎn)基因存在相互作用,體現(xiàn)了三黃瀉心湯通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)干預(yù)治療膿毒癥心功能障礙。

圖3 藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 交集靶點(diǎn)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得交集蛋白相互作用的tsv文件,運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥物與疾病之間的交集PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖4),并利用軟件中的“Network Analyzer”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示49個(gè)節(jié)點(diǎn)、489條邊。節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),連接線代表功能相關(guān)性,節(jié)點(diǎn)大小、線條多少與節(jié)點(diǎn)的Degree值呈正相關(guān)。

圖4 交集靶點(diǎn)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的交集靶點(diǎn)相互作用的tsv文件使用R語(yǔ)言進(jìn)行處理得到PPI核心基因柱狀圖(見(jiàn)圖5)。其中大于Degree值中位數(shù)2倍的核心靶點(diǎn)為絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、腫瘤壞死因子(TNF)、血清清蛋白(ALB)。Degree值排名前10位的核心靶點(diǎn)包括MAPK3、TNF、ALB、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白9(MMP9)、MYC基因(MYC)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)。PPI網(wǎng)絡(luò)也體現(xiàn)了三黃瀉心湯是通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)治療膿毒癥心功能障礙。

圖5 PPI核心基因柱狀圖

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)51個(gè)潛在作用交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,且設(shè)置顯著富集(P<0.01)后共獲得165個(gè)條目,其中生物過(guò)程125個(gè)、細(xì)胞組分21個(gè)、分子功能19個(gè),依據(jù)基因計(jì)數(shù)值(Count值)升序排列,生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能各選取排名前10位制作氣泡圖(見(jiàn)圖6)。結(jié)果顯示,生物過(guò)程主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過(guò)程、蛋白磷酸化、炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等,由此可見(jiàn),三黃瀉心湯有效成分主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等對(duì)膿毒癥心功能障礙起潛在治療作用。

圖6 GO富集分析氣泡圖

KEGG通路富集分析共獲得顯著富集(P<0.01)80條通路,選取富集排名前20條的通路繪制氣泡圖(見(jiàn)圖7),結(jié)果顯示,三黃瀉心湯治療膿毒癥心功能障礙的主要信號(hào)通路涉及磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路及自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號(hào)通路等,表明三黃瀉心湯主要通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等來(lái)發(fā)揮對(duì)膿毒癥心功能障礙的潛在治療作用。

圖7 KEGG通路富集分析圖

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 將三黃瀉心湯的13種有效成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前3位的核心靶點(diǎn)MAPK3、TNF、ALB分別進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能<-20.920 kJ/mol表明活性成分與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性,結(jié)合能<-29.288 kJ/mol表明分子與靶點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[18]。結(jié)果顯示,三黃瀉心湯13種有效成分與MAPK3、TNF、ALB關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合力,詳見(jiàn)表1。其中,與核心靶點(diǎn)MAPK3結(jié)合最強(qiáng)的是大黃酸(-38.074 kJ/mol)。詳見(jiàn)圖8。

表1 分子對(duì)接結(jié)果

3 討 論

王今達(dá)等[19]遵循六經(jīng)辨證、衛(wèi)氣營(yíng)血辨證理論提出了“三證三法”辨證治療膿毒癥,將膿毒癥分為熱證、瘀證和虛證,與之相對(duì)應(yīng)的治療方法是清熱解毒法、活血化瘀法和益氣固脫法。大量基礎(chǔ)及臨床研究證實(shí)了“三證三法”對(duì)膿毒癥具有治療作用,其在一定程度上降低了膿毒癥的病死率[20]。三黃瀉心湯為張仲景經(jīng)方,具有清熱解毒的功效,用于治療膿毒癥心功能障礙具有充足的理論基礎(chǔ)。三黃瀉心湯的關(guān)鍵活性成分包括漢黃芩素、黃芩素、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、漢黃芩苷、黃連堿、黃芩苷、小檗堿等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),漢黃芩素通過(guò)抑制一氧化氮、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用[21]。漢黃芩素通過(guò)減少胞內(nèi)活性氧,達(dá)到降低細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活性、弱化NF-κB介導(dǎo)的炎癥基因轉(zhuǎn)錄作用來(lái)減弱巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[22]。黃芩素快速抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放,導(dǎo)致白細(xì)胞介素-6(IL-6)和一氧化氮的減少發(fā)揮抗炎作用[23]。黃芩素通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路,保護(hù)糖尿病心肌病大鼠免受氧化應(yīng)激和心肌組織炎癥的損害[24]。黃芩素具有解熱和廣泛的抗病毒作用,對(duì)RNA、DNA病毒均有良好的抗病毒作用,可通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)通路,對(duì)急性胰腺炎引發(fā)的肺組織損傷具有保護(hù)作用,亦能抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡及心肌壞死對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用[25]。Yu等[26]研究發(fā)現(xiàn),蘆薈大黃素能夠減輕心肌梗死及心肌凋亡;徐瑞明等[27]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),大黃素能夠減輕膿毒癥大鼠心肌損傷,減少膿毒癥大鼠心肌組織炎癥、氧化損傷和細(xì)胞凋亡。研究證實(shí),大黃素減輕膿毒癥大鼠心肌損傷的作用可能是通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生以及激活心肌細(xì)胞線粒體膜ATP敏感性K+通道來(lái)對(duì)抗細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的[28]。Wei等[29]研究顯示,大黃素能夠通過(guò)抑制Akt、NF-κB活性,減少半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9),抑制線粒體依賴(lài)凋亡途徑。研究表明,大黃酸可減少I(mǎi)L-6、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的生成,同時(shí)抑制NF-κB和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)炎性因子途徑,顯著減少免疫細(xì)胞遷移而發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎作用[30-31]。大黃酸已被證明可抑制活性氧的產(chǎn)生,在過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中,大黃酸以劑量依賴(lài)性的方式顯著減少細(xì)胞中BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(BID)、Caspase-3、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)和Caspase-9的mRNA表達(dá),減少細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生,從而逆轉(zhuǎn)H2O2引起的細(xì)胞損傷[32-33]。由此可以推測(cè),三黃瀉心湯在治療膿毒癥心功能障礙方面,可能主要通過(guò)這些有效成分發(fā)揮調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等的重要治療作用。

本研究發(fā)現(xiàn),三黃瀉心湯治療膿毒癥心功能障礙的潛在作用靶點(diǎn)集中在MAPK3、TNF、IL-1β、MMP9等。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其核心靶點(diǎn)為MAPK3、TNF、ALB。TNF-α、IL-1β是膿毒癥發(fā)生時(shí)重要的促炎因子,其主要是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,具有抑制心肌功能的作用[34-36]。TNF-α作為凋亡的啟動(dòng)介質(zhì),通過(guò)激活線粒體膜上促凋亡因子(Bax)促凋亡蛋白家族,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[37]。IL-1β可濃度依賴(lài)性抑制心肌收縮,與TNF-α協(xié)同在低濃度即可抑制心肌收縮,同時(shí)可誘導(dǎo)一氧化氮等因子產(chǎn)生[38-39]。誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶編碼誘導(dǎo)型一氧化氮抑制線粒體功能,引起氧化應(yīng)激、心肌組織代謝性缺氧,收縮功能障礙[40]。一氧化氮合成酶參與心肌梗死、心力衰竭等心肌損傷[41]。MAPK家族蛋白可被上游激酶磷酸化,從而活化下游因子,發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及死亡的作用[42]。其中MAPK3已被證明在心肌細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用[43]。Tomita等[44]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素顯著增加心臟成纖維細(xì)胞中TNF-α和MMP9的表達(dá),廣譜MMP抑制劑治療可減輕膿毒癥期間的心臟纖維化和心功能不全等,可見(jiàn)心肌細(xì)胞纖維化所致的心臟重構(gòu)也是膿毒癥心功能障礙發(fā)病環(huán)節(jié)之一。綜上所述,三黃瀉心湯通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)來(lái)治療膿毒癥心功能障礙,這些靶點(diǎn)主要涉及炎癥反應(yīng)、心肌凋亡、纖維化等調(diào)控。

從GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果可見(jiàn),三黃瀉心湯治療膿毒癥心功能障礙涉及的生物過(guò)程主要有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過(guò)程、蛋白磷酸化、炎癥反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等,其中靶點(diǎn)主要富集在PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路及HIF-1信號(hào)通路等。PI3K/Akt信號(hào)通路是機(jī)體重要信號(hào)通路,磷酸化過(guò)程中產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生物活性[45]。以往研究表明,PI3K/Akt能夠抑制線粒體凋亡,降低Bax活性,從而減少細(xì)胞凋亡,改善病情[46]。PI3K是其信號(hào)通路的起始因子,可被多種生長(zhǎng)因子激活,在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使分子肌醇三磷酸,并與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt和3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1結(jié)合,促進(jìn)Akt的磷酸化激活[47]。Akt是PI3K下游信號(hào)通路中的重要蛋白,被PI3K激活后,能磷酸化激活其下游雷帕霉素靶蛋白(mTOR),參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活的調(diào)節(jié)[48]。其可直接作用于自噬相關(guān)基因(Atg)調(diào)節(jié)自噬體的形成[49]。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同交會(huì)通路之一[50]。研究發(fā)現(xiàn),TNF信號(hào)通路與炎癥、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[51]。綜上所述,三黃瀉心湯通過(guò)調(diào)控這些信號(hào)通路對(duì)膿毒癥心功能障礙發(fā)揮抗炎、調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬及減輕氧化應(yīng)激損傷等潛在治療作用。

綜上所述,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示,三黃瀉心湯中大黃酸、大黃素、黃芩素、大黃酚、蘆薈大黃素等有效成分可能通過(guò)TNF、MAPK1、MAPK8、IL-1β、MMP9、MYC、STAT3、ICAM1等關(guān)鍵靶點(diǎn),調(diào)控PI3K/Akt通路、TNF通路、MAPK通路及HIF-1通路等,發(fā)揮抗炎、抑制心肌細(xì)胞凋亡、調(diào)控自噬、減輕氧化應(yīng)激損傷等作用,為三黃瀉心湯治療膿毒癥心功能障礙的進(jìn)一步臨床和基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)和新的思路。