麝香保心丸對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及凋亡的影響

魏娜，李思源，高苑，王雪瑞，肖斌，牛藝璇，楊文霞，劉振兵

急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）是缺血性心臟病患者的首要死因［1］。再灌注治療是STEMI患者的主要治療方法。然而，再灌注治療常誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷（MIRI），擴(kuò)大心肌梗死面積，甚至導(dǎo)致STEMI 患者死亡［2-3］。目前，臨床尚無有效治療STEMI患者M(jìn)IRI的措施［4］。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，是MIRI 發(fā)展的關(guān)鍵因素。既往研究表明，抑制細(xì)胞凋亡途徑可以有效緩解MIRI［5］。麝香保心丸（shexiang baoxin pill，SBP）作為傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑，可減輕STEMI 患者M(jìn)IRI，改善心肌再灌注損傷，縮小心肌梗死面積［6］。其作用機(jī)制具有多樣性，如抑制氧化應(yīng)激和炎癥、促進(jìn)心臟血管生成及調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的能量代謝等［7］。然而，SBP 對(duì)心肌細(xì)胞MIRI 的保護(hù)作用及其對(duì)凋亡的影響研究鮮見。本研究旨在探討SBP對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其是否通過細(xì)胞凋亡機(jī)制實(shí)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。SBP購(gòu)自上海和黃藥業(yè)有限公司，規(guī)格劑量：22.5 mg×42 丸/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z31020068。CCK-8 試劑盒、胰蛋白酶、BCA試劑盒、ECL發(fā)光液、壓片暗盒、X-OMAT BT 膠片、電泳液、PVDF膜、裂解液、TBST購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。高糖DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。青-鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。甲醇、二氯甲烷購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。Anexxin-V FITC/PI雙染色試劑盒購(gòu)自BD公司。轉(zhuǎn)膜液、牛血清白蛋白（BSA）、彩虹180廣譜蛋白Marker購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。B細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）抗體（兔抗、ab194583）購(gòu)自Abcam 公司。Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）抗體（兔抗、14796S）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（兔抗、14220S）、山羊抗兔二抗（7074S）購(gòu)自CST公司。酶標(biāo)儀（型號(hào)：ELX-800）購(gòu)自BioTek公司。流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACSCanto Ⅱ）購(gòu)自BD公司。

1.2 研究方法

1.2.1 藥物提?。ㄋ岱ǎ?取SBP 并碾成粉末，在20 mL蒸餾水中加入1 g SBP 粉末，微熱混勻制成50 g/L 混懸液，1 500 r/min離心5 min后保留上清液，用0.22μm微孔濾膜過濾清除顆粒物，4 ℃保存?zhèn)溆?。在使用時(shí)將工作液按分組需要進(jìn)行稀釋，配制成含相應(yīng)濃度SBP的完全培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、缺氧-復(fù)氧模型建立和分組 細(xì)胞培養(yǎng)：將心肌細(xì)胞H9C2培養(yǎng)于37 ℃5%CO2、1%青-鏈霉素、10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，融合度處于80%以上時(shí)用胰酶消化并傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期發(fā)育狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。缺氧-復(fù)氧模型建立：按照5 000個(gè)/孔將H9C2細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h 后將完全培養(yǎng)基替換為無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基，模擬缺氧時(shí)間分別為2 h、3 h、6 h（缺氧時(shí)的氧濃度：0），達(dá)到規(guī)定時(shí)間后替換為完全培養(yǎng)基復(fù)氧2 h（復(fù)氧時(shí)的氧濃度：95%）；用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性，選擇細(xì)胞活力為50%~60%的時(shí)間即為缺氧-復(fù)氧模型時(shí)間。將細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對(duì)照組，用等體積完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞；模型組，只進(jìn)行缺氧-復(fù)氧處理；0.5、1、2及5 g/L SBP組分別用含相應(yīng)濃度SBP的培養(yǎng)基預(yù)處理心肌細(xì)胞24 h，再進(jìn)行缺氧-復(fù)氧處理。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率 取相應(yīng)處理后的各組細(xì)胞，加入10μL CCK-8試劑，輕輕震蕩，37 ℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-空白組OD值）×100%。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，每組重復(fù)12次。

1.2.4 Anexxin-V FITC/PI 雙染色法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率 將H9C2細(xì)胞接種至6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h，將對(duì)照組、模型組和2 g/L SBP 組進(jìn)行相應(yīng)處理。干預(yù)結(jié)束后用不含EDTA 的胰酶消化并收集細(xì)胞，4 ℃、1 200 r/min 離心5 min，用預(yù)冷的PBS 清洗2 次，1 200 r/min離心5 min。結(jié)合緩沖液重懸心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取100 μL 細(xì)胞用于染色。加入5 μL Annexin V-FITC 和10μL PI，輕輕混勻。避光、室溫反應(yīng)10~15 min。加入400μL結(jié)合緩沖液，混勻后置于冰上并在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，用Cell Quest pro分析。

1.2.5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá) 用胰酶消化并收集對(duì)照組、模型組和2 g/L SBP 組細(xì)胞，加入相應(yīng)的裂解液，-20 ℃裂解40 min，在12 000 r/min離心20 min，只保留上清液即總蛋白。采用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性、上樣、電泳3~4 h，濕法轉(zhuǎn)膜1~2 h。用5%BSA封閉液室溫封閉2 h，β-actin、Bax、Bcl-2及Caspase-3一抗（均1∶1 000稀釋）分別在4 ℃下孵育過夜。用TBST 洗膜5 min，重復(fù)5 次。二抗（1∶2 000）孵育PVDF 膜1 h，再次洗膜5 次，每次5 min。用ECL 發(fā)光液浸潤(rùn)PVDF膜，完全避光放置于壓片暗盒內(nèi)并覆蓋X-OMAT BT膠片30 s~3 min，將膠片先后置于顯影液和定影液中顯影成像，后將膠片晾干保存，再用掃描儀掃描膠片。用Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧-復(fù)氧模型的建立 與對(duì)照組（100%±0%）比較，分別缺氧2 h、3 h及6 h，復(fù)氧2 h后，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率為72.76%±4.84%、60.27%±0.58%及49.70%±4.92%。缺氧3 h，復(fù)氧2 h 后細(xì)胞活力維持在50%~60%，因此選擇此缺氧-復(fù)氧條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組細(xì)胞存活率比較 對(duì)照組、模型組、0.5 g/L SBP 組、1 g/L SBP 組、2 g/L SBP 組及5 g/L SBP 組心肌細(xì)胞存活率分別為100%±0%、60.29%±0.93%、69.66%±0.66%、 78.98%±0.77%、 84.30%±1.50%、81.35%±0.91%（n=12，F(xiàn)=441.545，P＜0.01）。與對(duì)照組比較，各組心肌細(xì)胞存活率均下降；與模型組比較，各SBP 處理組心肌細(xì)胞存活率均升高（P＜0.05）；2 g/L SBP組細(xì)胞存活率最高，用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組和2 g/L SBP 組凋亡率、Bax、Caspase-3 相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），而模型組與對(duì)照組Bcl-2 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2 g/L SBP 組與模型組和對(duì)照組比較Bcl-2 相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，2 g/L SBP組凋亡率、Bax、Caspase-3 相對(duì)表達(dá)水平下降，而Bcl-2 相對(duì)表達(dá)水平和Bcl-2/Bax 比值升高（P＜0.05）。見圖1、2，表1。

Fig.1 Results of flow cytometry of apoptosis in each group圖1 各組細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

3 討論

SBP是我國(guó)傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑，由人工麝香、人參提取物、人工牛黃、肉桂、蘇合香、蟾酥、冰片配方而成［8］。研究證實(shí)，SBP 主要用于治療缺血性心臟?。?］，可減少STEMI患者心血管不良事件發(fā)生率［10］。動(dòng)物研究證實(shí)，SBP 可減少鼠MIRI 和梗死面積，并預(yù)防心肌重構(gòu)［11-12］。SBP 化學(xué)成分十分復(fù)雜，主要有揮發(fā)性的小分子成分和不易揮發(fā)的膽酸、皂苷類等［9］。選用適當(dāng)?shù)娜軇┦亲畲笙薅鹊匕l(fā)揮藥物活性的關(guān)鍵［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，采用水提法提取SBP 有效成分對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞顯示出明顯的保護(hù)作用。其原因可能與揮發(fā)性成分有效保存和人參皂苷類物質(zhì)吸收程度有關(guān)［14］。

MIRI 是影響STEMI 患者療效的主要因素之一［15］。目前，單一治療措施對(duì)MIRI治療的有效性結(jié)論并不一致。研究顯示，遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)可降低STEMI 患者心肌梗死面積，增加心肌挽救指數(shù)［16］。然而，一項(xiàng)納入5 401 例STEMI 患者的CONDI-2/ERIC-PPCI研究并沒有發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)可以降低心肌梗死面積［4］。García-Ruíz 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，早期給予STEMI患者注射美托洛爾注射液可降低心肌梗死面積。然而，一項(xiàng)多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)并沒有發(fā)現(xiàn)美托洛爾注射液能夠降低STEMI患者心肌梗死面積［18］。SBP在急性心肌梗死防治中具有多種靶向作用。本團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn)，SBP 能夠降低STEMI患者M(jìn)IRI和心肌梗死面積，改善心肌再灌注和心功能［6］。既往研究也發(fā)現(xiàn)，SBP 的主要組成成分人參、麝香和肉桂提取物均可降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MIRI 和心肌梗死面積［19］。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，與模型組比較，不同濃度SBP 使缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的存活率均升高，表明SBP對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

Fig.2 Comparison of relative expression levels of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 proteins between different cell groups圖2 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

Tab.1 Comparison of apoptosis and relative expression levels of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins between different cell groups表1 各組細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=12，±s）

Tab.1 Comparison of apoptosis and relative expression levels of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins between different cell groups表1 各組細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組2 g/L SBP組F凋亡率（%）4.04±1.60 34.16±1.55a 12.78±0.13ab 435.023＊＊Bcl-2 0.74±0.08 0.95±0.08 1.34±0.18ab 12.027＊＊Bax 0.91±0.02 1.28±0.04a 1.02±0.05ab 41.336＊＊Caspase-3 0.78±0.08 1.39±0.14a 1.03±0.05ab 19.641＊＊Bcl-2/Bax 0.80±0.08 0.74±0.04a 1.30±0.11ab 27.897＊＊

大量研究表明，MIRI 發(fā)生后，Bax 和Caspase-3表達(dá)升高，而Bcl-2表達(dá)降低，這與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)［20］。因此，調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)可能是治療MIRI的潛在靶點(diǎn)。心肌細(xì)胞凋亡是由MIRI 引起的不可逆事件，減少細(xì)胞凋亡可有效預(yù)防MIRI［21］。Bcl-2 家族由促凋亡Bax 和抗凋亡Bcl-2 組成，Bcl-2/Bax 比也通常用于評(píng)估細(xì)胞在外部刺激下的抗凋亡能力，比值越大，說明抗凋亡能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，與模型組比較，2 g/L SBP 組Bcl-2/Bax 比值增大，說明SBP 可增強(qiáng)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的抗凋亡能力。Caspase-3表達(dá)量直接反映細(xì)胞凋亡程度，是細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵的執(zhí)行分子［22］。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，與模型組比較，2 g/L SBP組使缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡率、Bax、Caspase-3 相對(duì)表達(dá)水平下降，而Bcl-2 相對(duì)表達(dá)水平升高，證實(shí)了SBP 通過抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡發(fā)揮減輕MIRI的作用。