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      大白菜核不育花藥超顯微結(jié)構(gòu)觀察

      2023-05-08 03:47:38岳艷玲郭瑛琪
      沈陽農(nóng)業(yè)大學學報 2023年1期
      關(guān)鍵詞:絨氈層電子密度花藥

      岳艷玲,郭瑛琪,2

      (1.云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院,昆明 650201;2.中國科學院昆明動物研究所,昆明 650223)

      大白菜(Brassica campestrisL.ssp.pekinensis)屬于十字花科蕓薹屬白菜種,原產(chǎn)于中國,有悠久的栽培歷史,是我國十分重要的蔬菜作物。大白菜為兩性花異花授粉植物,雜種優(yōu)勢非常顯著,但大白菜花器比較小,很難通過人工授粉的方式滿足F1雜交種子的商業(yè)化利用。

      雄性不育(male sterility)是指植物雄蕊退化或不能形成有活力花粉的現(xiàn)象,在自然界中廣泛存在,是大白菜實現(xiàn)雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。應用雄性不育系進行雜交種子生產(chǎn),雜種純度高,不存在母本自交種子混雜問題。因此,雄性不育發(fā)生機理及其應用研究受到生物學家的廣泛關(guān)注。1995 年,F(xiàn)ENG 等[1]發(fā)現(xiàn)了一類大白菜核不育的遺傳機制,提出了“復等位基因遺傳假說”。復等位核雄性不育具有雄蕊退化徹底、不育性穩(wěn)定等特點,不育度和不育株率均為100%,且不受細胞質(zhì)影響,沒有正、反交遺傳效應,是一類比較理想的大白菜雄性不育材料。2005 年,岳艷玲等[2-4]以“復等位基因遺傳假說”為理論基礎(chǔ)設(shè)計了合成轉(zhuǎn)育方法和定向轉(zhuǎn)育方法,成功將該不育基因向不同生態(tài)型大白菜中進行轉(zhuǎn)育,育成多個大白菜核基因雄性不育系,并對其雄性不育的敗育機制進行研究。10L03是在大白菜復等位基因雄性不育系定向轉(zhuǎn)育過程中經(jīng)過多代回交獲得的近等基因系,不育株雄蕊敗育徹底,雌蕊正常,無不良性狀伴生,植株結(jié)籽特性好。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)大白菜花藥絨氈層細胞結(jié)構(gòu)異常,四分小孢子不能發(fā)育成正常的單核小孢子,最終藥腔空癟,發(fā)生敗育[5]。為進一步深入研究該雄性不育材料的敗育機制,本研究采用透射電子顯微技術(shù),觀察小孢子敗育過程花藥絨氈層細胞及小孢子的發(fā)育動態(tài),明確不育發(fā)生時期及敗育細胞的超微特征,為揭示該核不育小孢子的敗育機制提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      大白菜核不育近等基因系10L03,系統(tǒng)內(nèi)兄妹交后代育性保持1∶1 分離,可育株自交后代可育株與不育株3∶1分離,材料由本課題組選育而成。試材種植于云南農(nóng)業(yè)大學蔬菜基地大棚內(nèi),于盛花期取不同育性的大白菜花序的花藥用于固定。

      1.2 方法

      采用2.5%戊二醛固定液(PBS pH=7.4)進行可育、不育花藥前固定,抽真空,4 ℃固定48 h。PBS 浸洗3 次,每次15 min,加入2%的鋨酸后固定4 h。PBS 浸洗3 次,每次15 min。梯度乙醇50%、70%、95%、100%逐級脫水,樹脂包埋。使用LEICA EM TRIM 樹脂修塊機進行修塊,LEICA EM UC6超薄切片機先切600~1000 nm的半薄切片,1%甲苯胺藍染色10 s,OLYMPUS CX31 顯微鏡觀察花藥發(fā)育時期。然后70 nm 連續(xù)切片,100 目銅網(wǎng)撈片,醋酸雙氧鈾染色25 min,雙蒸水涮洗,檸檬酸鉛染色8~15 min,雙蒸水涮洗終止染色,并放入標好號的濾紙上。EOL JEM-1200EX Ⅱ電子顯微鏡觀察,拍照。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 可育花藥細胞發(fā)育過程

      透射電鏡觀察花粉母細胞時期可育花藥結(jié)構(gòu),花藥外層細胞分化明顯,視野中可以清晰地看到花藥中層細胞和絨氈層細胞,絨氈層細胞牙齒狀排列緊湊,徑向長度5 μm以上,可以看到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。花粉母細胞位于藥腔中央,細胞排列緊密,形狀不規(guī)則,細胞核清晰可見,絨氈層和花粉母細胞飽滿,內(nèi)含物充實(圖1A)。進一步放大觀察絨氈層細胞,細胞核核仁電子密度大,幾乎與細胞核等大,細胞質(zhì)中含有淀粉等物質(zhì)(圖1B)?;ǚ勰讣毎^大,可看到核仁和核質(zhì),細胞之中含有豐富的內(nèi)含物(圖1C)。

      花粉母細胞之后,可育絨氈層細胞核完整,細胞核輪廓清晰,核仁較大,電子密度高(圖1D)?;ǚ勰讣毎毎?、核仁明顯,核膜完整,清晰可見(圖1E)??捎ㄋ幚^續(xù)發(fā)育到四分體時期,絨氈層細胞仍可見細胞核,且核仁電子密度明顯大于核質(zhì),有的絨氈層為單層細胞(圖1F),而有的為2層或3層細胞(圖1G),絨氈層細胞質(zhì)內(nèi)含物豐富(圖1F、圖1G),細胞間存在細胞間隙,而絨氈層靠近外層細胞的細胞膜可見,放大可看到絨氈層細胞中的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分泌小泡(圖1H)。四分小孢子圓潤飽滿,小孢子電子密度大,小孢子表面和細胞間可見胼胝質(zhì),小孢子內(nèi)含物豐富,可見脂滴體(圖1I)。

      可育花藥單核早期小孢子呈三葉草形(圖1J)。絨氈層細胞電子密度大,可見細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),細胞邊緣有分泌小泡,絨氈層細胞含有淀粉粒等,可見核小體(圖1K)。單核小孢子細胞核很大位于小孢子中央,核膜清晰可見,核仁染色深,電子密度大,無明顯液泡,但細胞質(zhì)中可見許多囊泡(圖1L)。

      圖1 可育花藥花粉母細胞至單核早期細胞超微結(jié)構(gòu)Figure 1 Cell ultrastructure of the fertile anther during pollen mother cell to early stage of mononuclear microspore

      小孢子繼續(xù)發(fā)育,絨氈層細胞間隙進一步變寬,同一時期絨氈層細胞電子密度比小孢子大(圖2A),絨氈層細胞淀粉粒等物質(zhì)增多,觀察到的細胞核無明顯核膜,但核仁清晰(圖2B),單核小孢子中出現(xiàn)液泡,可見細胞核核仁及核膜、線粒體及分泌小泡,形狀從三葉草形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形(圖2C)。

      到了單核晚期,絨氈層細胞電子密度降低,小孢子繼續(xù)向圓形轉(zhuǎn)變(圖2D),絨氈層細胞進一步降解,細胞內(nèi)的淀粉粒等更為豐富,細胞形態(tài)無規(guī)則,有的絨氈層細胞隱約可見細胞核,細胞周圍有分泌小泡(圖2E)。小孢子內(nèi)有大液泡,液泡膜清楚可見,核膜清晰,核仁色深,細胞質(zhì)內(nèi)可見小囊泡,線粒體以及脂滴體(圖2F)。

      雙核期絨氈層細胞出現(xiàn)大量空泡,徑向變短,橫向變長,此時絨氈層細胞結(jié)構(gòu)基本消失,觀察不到完整的細胞器。小孢子基本圓形,可見兩個細胞核,液泡變?。▓D2G)。絨氈層細胞看不到細胞核、細胞器及細胞膜結(jié)構(gòu),細胞間縫隙進一步變大,絨氈層細胞基本消失(圖2H)。小孢子進一步放大觀察可見分泌小泡、糖類、脂滴體等(圖2I)。

      花藥成熟時期,可育花藥絨氈層細胞結(jié)構(gòu)消失,花粉粒電子密度極大(圖2J),絨氈層細胞只剩薄薄的一層,但不同位置薄厚不一,有的絨氈層細胞已經(jīng)完全消失,外側(cè)細胞含有線粒體和小囊泡(圖2K)?;ǚ哿A形飽滿,電子密度極大,可見細胞核(圖2L)。

      圖2 可育花藥單核至成熟期細胞超微結(jié)構(gòu)Figure 2 Cell ultrastructure of the fertile anther during mononuclear microspore to mature stage

      2.2 不育花藥細胞發(fā)育過程

      透射電鏡觀察花粉母細胞時期不育花藥結(jié)構(gòu),視野中可見花藥表皮細胞、內(nèi)壁細胞、中層細胞和絨氈層細胞,絨氈層細胞狀排列緊湊呈牙齒狀,花粉母細胞位于藥腔中央,排列緊湊,形狀不規(guī)則,細胞核清晰可見,絨氈層和花粉母細胞飽滿,內(nèi)含物充實(圖3A)。絨絨氈層細胞核及核仁明顯,核膜可見,細胞質(zhì)中含有淀粉粒等(圖3B)?;ǚ勰讣毎^大,核仁電子密度大,核質(zhì)電子密度小,細胞之中含有豐富內(nèi)含物(圖3C)。

      花粉母細胞后期,不育絨氈層細胞間出現(xiàn)縫隙,細胞核裂解出現(xiàn)核小體(圖3D),說明絨氈層細胞發(fā)生了細胞程序性死亡?;ǚ勰讣毎募毎?、核仁以及核膜都明顯可見(圖3E);花粉母細胞可以完成減數(shù)分裂發(fā)育成四分體,此時絨氈層細胞膨大,四分小孢子變形(圖3F),細胞內(nèi)有空泡,核內(nèi)可觀察到核小體(圖3G),說明此時小孢子發(fā)生細胞程序性死亡。絨氈層細胞空泡化明顯,細胞核電子密度大,可以看到核小體(圖3H)。

      圖3 不育花藥花粉母細胞至四分體時期細胞超微結(jié)構(gòu)Figure 3 Cell ultrastructure of the fertile anther during pollen mother cell to tetrad stage

      四分體之后,絨氈層細胞空泡化現(xiàn)象加重,細胞或變形(圖4A)或異常膨大(圖4C),之后發(fā)生降解(圖4D)。小孢子有的細胞核皺縮,細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的小囊泡,胼胝質(zhì)仍然包裹小孢子(圖4B),說明包圍四分小孢子的胼胝質(zhì)并未被及時降解,沒能順利釋放單核小孢子。絨氈層細胞和小孢子的敗育過程并不同步,特征也不完全一致,有的絨氈層細胞會發(fā)生徑向伸長繼續(xù)膨大(圖4A、圖4C、圖4E),有許多分泌小泡,同一腔室中小孢子敗育程度也有不同,有的皺縮,有的勉強維持圓形(圖4E),但都已看不到任何細胞器和細胞結(jié)構(gòu),但胼胝質(zhì)仍然存在。成熟期,不育花藥絨氈層細胞和小孢子已經(jīng)無法分清層次結(jié)構(gòu)(圖4F、圖4G)。15K 倍數(shù)下可見細胞壁層疊狀,藥腔中可見電子密度極大的細胞殘體(圖4H)。

      圖4 四分體之后不育花藥敗育的細胞超微結(jié)構(gòu)Figure 4 Cell ultrastructure of the fertile anther during the stage after tetrad

      3 討論與結(jié)論

      花粉發(fā)育是有性繁殖植物完成其世代交替的重要生命過程,涉及到一系列的細胞學和生物化學變化,任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生改變都可能會導致花粉發(fā)育異常,從而引起雄性不育[6]。在大白菜不育系中,敗育可發(fā)生在小孢子發(fā)育的各個時期,如無花粉囊型敗育型,發(fā)生在孢原細胞時期,造孢細胞無法形成或相互黏連;花粉母細胞敗育型,表現(xiàn)為減數(shù)分裂異常,小孢子無法分離,四分體無法散開;單核花粉敗育型表現(xiàn)為花粉壁形成異常,花粉無活性[7-13]。PU 等[5]利用制作石蠟切片,采用光學顯微技術(shù)觀察10L03 不育花藥發(fā)育過程,花粉母細胞經(jīng)減數(shù)分裂可以形成四分體,但小孢子發(fā)生變形,絨氈層變厚,提前降解,說明10L03 花藥不育發(fā)生在四分體時期。本研究對10L03 花藥細胞超微結(jié)構(gòu)進行觀察,發(fā)現(xiàn)的不育花藥絨氈層細胞細胞核在減數(shù)分裂時已經(jīng)分解形成核小體,說明此時絨氈層細胞已經(jīng)發(fā)生細胞程序性死亡,花藥發(fā)生敗育的時期應是花粉母細胞減數(shù)分裂時期,也說明了細胞結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果較組織結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果更準確。

      絨氈層是藥室的最內(nèi)層,由雄蕊原基的L2、L3 層共同發(fā)育而來,包圍著花粉母細胞和小孢子并與其相互作用,絨氈層的發(fā)育及其降解對小孢子的發(fā)生和發(fā)育起著至關(guān)重要作用[14-15]。絨氈層缺失、過早或延遲降解,甚至不降解,均可導致植物雄性不育[16]。郭瑛琪等[17]觀察發(fā)現(xiàn)10L03 不育花藥絨氈層提前降解,本研究電鏡觀察結(jié)果與郭瑛琪等觀察結(jié)果一致,但觀察到絨氈層細胞多泡化、膨大空泡化及縱向延伸膨大空泡化3種不同的敗育形式。通過透射電鏡,本研究觀察到10L03不育花藥絨氈層細胞在減數(shù)分裂時期細胞核裂解形成核小體,敗育小孢子細胞也出現(xiàn)核裂解現(xiàn)象,這是一個明顯的細胞程序性死亡特征,說明10L03不育花藥敗育過程中出現(xiàn)異常PCD過程,這與郭瑛琪等[17]采用TUNNEL法檢測的結(jié)果相一致。

      胼胝質(zhì)(callose)是一種以β-1,3-鍵結(jié)合的葡聚糖,廣泛分布于高等植物的篩管、細胞板和胞間連絲,在植物細胞分裂、細胞到細胞的分子運動及抗生物、非生物脅迫等生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[18]。胼胝質(zhì)還是花粉發(fā)育的重要調(diào)控者特定發(fā)育階段的胼胝質(zhì)沉積和降解是小孢子發(fā)生和花粉形成的重要前提[19]。在減數(shù)分裂前,胼胝質(zhì)開始在花粉母細胞的細胞壁中沉積,減數(shù)分裂后四個子細胞由胼胝質(zhì)隔開,參與胞質(zhì)分裂,整個四分體都被胼胝質(zhì)壁包裹著,隨后胼胝壁被消化而釋放小孢子,花粉外壁形成、花粉萌發(fā)和花粉管生長也需要胼胝質(zhì)的參與[20-21]。四分體周圍的胼胝質(zhì)壁提前降解或延遲降解以及花粉外壁中胼胝質(zhì)沉積異常均會影響小孢子進一步發(fā)育,引起花粉敗育,導致雄性不育[22-23]。PU 等[5]利用Aniline blue 染色和熒光檢測發(fā)現(xiàn)10L03花藥敗育過程中,包裹著小孢子的胼胝質(zhì)不能被降解,不能發(fā)育成單核小孢子,花藥特異表達胼胝質(zhì)酶基因AtA6的同源基因BraA04g008040、BraA07g009320、BraA01g030220、BraA03g040850在不育花藥減數(shù)分裂后低表達可能促進了小孢子胼胝質(zhì)的沉積[5]。胼胝質(zhì)酶是由絨氈層細胞合成并分泌到藥腔中,降解包裹四分體的胼胝質(zhì),從而釋放單核小孢子。本研究電鏡觀察到不育花藥絨氈層細胞提前發(fā)生細胞程序性死亡,導致胼胝質(zhì)酶合成不足,包裹著小孢子的胼胝質(zhì)不能被降解,四分小孢子無法釋放單核小孢子,小孢子無法進一步發(fā)育,最終敗育。

      從本研究觀察結(jié)果可以看到,絨氈層細胞敗育起始早于小孢子敗育,說明絨氈層細胞提前發(fā)生細胞程序性死亡是導致小孢子敗育的重要原因??捎ㄋ幇l(fā)育過程中,絨氈層細胞質(zhì)電子密度大,含有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器;不育花藥敗育過程中,絨氈層細胞質(zhì)的細胞器數(shù)量明顯低于可育花藥,細胞內(nèi)空泡化嚴重,細胞器少,提前降解,說明不育花藥絨氈層細胞無法持續(xù)提供小孢子發(fā)育所需的物質(zhì),因而包裹四分小孢子的胼胝質(zhì)不能被降解,無法釋放單核小孢子,小孢子無法進一步發(fā)育進而發(fā)生敗育。

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