熱處理促進淀粉和蛋白質(zhì)中持久性自由基生成的影響

黃曉霞,陳 全,計丕霞,吳 敏,潘 波

(昆明理工大學 環(huán)境科學與工程學院,云南省土壤固碳與污染控制重點實驗室,云南 昆明 650500)

0 引 言

持久性自由基(Persistent Free Radicals,PFRs)[1]是一種比?；?、羥基等自由基壽命更長,能隨著環(huán)境介質(zhì)遷移進入生物體內(nèi)的新型環(huán)境污染物.PFRs通常在高溫熱處理,如燃燒、熱解、水熱碳化等過程中形成[2],其可在環(huán)境中持續(xù)數(shù)小時甚至數(shù)天,嚴重威脅人體健康.PFRs主要通過兩種途徑引起人體暴露風險:一種是在體外產(chǎn)生活性氧,讓機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),第二種是進入人體誘導活性氧產(chǎn)生,損傷生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子[3-4].

食物從消化道攝入是PFRs進入人體的重要途徑之一.研究發(fā)現(xiàn)熱處理不同食品部位產(chǎn)生PFRs的含量不同,如面包外皮的PFRs含量是面包內(nèi)心的2～5倍[5],杏仁片中的PFRs含量是杏仁核中的5倍[6].不同熱處理方式也會使食品產(chǎn)生PFRs的強度不同,微波熱處理大米蛋白形成了以碳為中心的PFRs,其產(chǎn)生的PFRs信號強度約為熱傳導方式的3倍[7];微波熱處理水分活度為0.4的大米淀粉產(chǎn)生的PFRs比熱傳導方式高1個數(shù)量級,受其激發(fā)產(chǎn)生PFRs的溫度也低于熱傳導處理[8],其原因是電磁場可直接作用于水分子、淀粉分子或蛋白質(zhì)分子內(nèi)的極性基團,提供斷鍵所需的解離能.而微波和電爐熱處理不飽和脂肪酸,只有電爐加熱使其產(chǎn)生了明顯的自由基信號,這與電爐加熱使不飽和脂肪酸中的C=C和C=O斷裂,而微波沒有改變不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)有關(guān)[9].此外,通過對不同植物油熱處理,發(fā)現(xiàn)多元不飽和脂肪酸含量越豐富的植物油,熱氧化穩(wěn)定性越差,在熱處理過程中更易產(chǎn)生PFRs[10],并且亞麻酸含量越高的植物油產(chǎn)生的自由基信號強度越強[11].但當前研究多關(guān)注于植物油中PFRs的產(chǎn)生情況,油與食物相互作用對食物中產(chǎn)生PFRs的影響以及不同加熱方式對不同成分食品中PFRs的影響仍鮮被關(guān)注.

淀粉類和蛋白質(zhì)類食品是我們?nèi)粘Ｉ畋夭豢缮俚氖澄?油炸方式也是中國傳統(tǒng)烹調(diào)食物的方法之一.因此本研究采用空氣熱解和油浴加熱兩種方式分別對淀粉、蛋白質(zhì)淀粉混合物以及蛋白質(zhì)進行熱處理,采用電子順磁共振(EPR)檢測不同食品組分中的PFRs信號強度,判定其種類并探究不同食品組分產(chǎn)生PFRs差異的原因與產(chǎn)生機制.研究結(jié)果將有助于提高人們對高溫加工食品的健康風險認識,也有利于控制熱處理過程中PFRs的產(chǎn)生,降低食物處理方式不當對人體的傷害.

1 材料與方法

1.1 樣品的制備

分別稱取純馬鈴薯淀粉(購買于源葉生物)和純?nèi)榍宓鞍踪|(zhì)粉(美國西爾瑪配料有限公司)各 20.00 g,加入UP水攪拌均勻,將其揉成一個光滑面團(含水率約30%)后壓制成大小均一的小圓柱體.同理,稱取蛋白質(zhì)粉和淀粉各 10.00 g 混合,制成蛋白質(zhì)淀粉混合物.設(shè)置空氣熱解溫度和油炸鍋溫度分別為220、250、280和 310 ℃,每個溫度下加熱樣品3 min,立即取出適量油浴加熱后的油樣進行EPR測試,同理進行相同溫度加熱大豆油3 min的EPR測試.熱解處理和油浴處理的固體樣品待冷卻后研磨成粉末狀,待進一步測試.

1.2 測試方法

1) EPR測試:用石英毛細管吸取油樣,用固體膠封口后插入干凈的順磁管中;稱量固體樣品置于 4 mm 順磁管中.順磁管置于電子順磁共振波譜儀(Bruker X-band A 300-6/1)內(nèi)腔中進行樣品的EPR光譜測定.調(diào)制頻率為 100 kHz,調(diào)制幅度為 1.00 G,掃描寬度為 100 G,轉(zhuǎn)換時間和時間常數(shù)分別為 40 ms 和 20.48 ms,EPR微波功率為 18 mW,掃描時間為 40.96 s,接收器增益為3.17×103,X軸分辨率為 1 024 點.其中,每個光譜的相對峰高度被估計為自由基信號的相對強度.

2) 紅外光譜(FTIR)測試:將樣品放入干燥的溴化鉀(KBr)中,樣品與KBr的比例為1∶200,充分研磨至混合均勻后使用壓片機壓制成透明薄片,放入傅里葉變換紅外光譜儀(Varian 640-IR,美國)中,扣除背景干擾值后進行樣品的掃描測定.FTIR檢測參數(shù)為:掃描次數(shù)為32次,分辨率為8,掃描范圍為 4 000～400 cm-1.

3) 元素分析(EA)測試:稱取樣品1.95～2.35 mg 至錫箔船中,包裹嚴密,放入元素分析儀(MicroCube,Elementar,Germany)中進行C、N、O、H、S元素分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

紅外譜圖分析采用OMNIC 8.2數(shù)據(jù)處理軟件,所得的譜圖與空氣譜圖進行差減.通過EPR程序Bruker WinEPR處理獲得g值、自由基信號強度和線寬.以上所有測試至少重復3次,實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行統(tǒng)計,Origin 2019b進行作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 油浴加熱和空氣熱解對淀粉類食品產(chǎn)生PFRs的影響

2.1.1 熱處理溫度及方式對淀粉生成PFRs的影響

油浴加熱和空氣熱解淀粉 3 min 產(chǎn)生的PFRs信號強度圖譜可見圖1.從圖中可以看出,隨著溫度的升高,淀粉中的PFRs信號強度逐漸增強,表明淀粉中PFRs的產(chǎn)生與加熱溫度顯著相關(guān).熱處理溫度低于 220 ℃ 時,兩種熱處理淀粉中均未檢測到PFRs信號.280 ℃ 油浴加熱產(chǎn)生的PFRs信號稍高于同溫度下熱解產(chǎn)生,但兩種加熱方式產(chǎn)生的PFRs信號強度無顯著性差異.相比 280 ℃ 溫度條件,310 ℃ 油浴加熱和熱解淀粉產(chǎn)生的PFRs信號強度分別突增約10倍和50倍.通過TG/DTG/DTA對淀粉進行熱分析,發(fā)現(xiàn)在 300 ℃ 有一個明顯的質(zhì)量損失峰[12],質(zhì)量損失69%,證實淀粉結(jié)構(gòu)在 300 ℃ 左右會發(fā)生質(zhì)的變化.溫度為 310 ℃ 時,淀粉分子結(jié)構(gòu)中的烷基側(cè)鏈、羥基、醚基等弱鍵斷裂,產(chǎn)生大量新的自由基,新產(chǎn)生的自由基通過與自身反應(yīng)或與周圍環(huán)境中的穩(wěn)定組分結(jié)合,形成穩(wěn)定自由基[13].

(a) (b)圖1 淀粉在熱解(a)和油浴加熱(b)處理下PFRs信號強度圖譜Fig.1 PFRs signal intensities of starch treated by pyrolysis (a) and oil heating (b)

對熱處理后油中的PFRs信號進行檢測,結(jié)果見圖2.從圖中可知,雖然大豆油含有豐富的不飽和脂肪酸,但提高熱處理溫度和添加淀粉都不會使油中產(chǎn)生PFRs.與Zhao等[9]的研究結(jié)果不同的是,他們在熱處理不飽和脂肪酸純物質(zhì)過程中檢測到PFRs信號,其原因可能是不飽和脂肪酸純物質(zhì)中不含抗氧化劑,而食用油在生產(chǎn)過程中會人為添加一定量的抗氧化劑[14],可與食用油熱氧化過程中產(chǎn)生的烷基、過氧基和烷氧基等脂質(zhì)自由基反應(yīng)[15],減緩油脂的氧化速度,進而阻止PFRs的產(chǎn)生.雖然油脂與淀粉之間的相互作用對油脂產(chǎn)生PFRs的影響較小,但油脂與淀粉之間的相互作用會影響淀粉中PFRs的產(chǎn)生.兩種加熱方式在 310 ℃ 產(chǎn)生的PFRs信號強度有顯著性差異,熱解淀粉產(chǎn)生的PFRs信號強度約為油浴加熱的3倍.其原因可能是升高溫度破壞了淀粉的結(jié)晶區(qū),使支鏈淀粉含量減少、直鏈淀粉含量增加[16],而直鏈淀粉可與脂質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),形成的淀粉-脂質(zhì)復合物可以提高淀粉的結(jié)晶度,抑制淀粉糊化[17],從而減少PFRs的產(chǎn)生.

(a) (b)圖2 熱處理對油中PFRs影響情況:(a)為加熱3 min后的大豆油;(b)為油炸淀粉3 min后的大豆油Fig.2 Effect of heat treatment on PFRs in oil: (a) soybean oil after heating for 3 min;(b) soybean oil after frying starch for 3 min

圖3 不同熱處理方式加工淀粉在 不同溫度下的g值和線寬Fig.3 The g value and line width of starch treated by different treatment methods

EPR信號的波普分裂因子(g值或g因子)是提供分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息的重要特征參數(shù).從圖3的g值變化來看,隨著溫度升高,油浴加熱和空氣熱解均使淀粉產(chǎn)生的PFRs的g值下降,表明PFRs從以O(shè)為中心逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐訡為中心.線寬(ΔHp-p)表示孤對電子從激發(fā)態(tài)的高能狀態(tài)返回低能狀態(tài)所經(jīng)歷的時間長短,這一過程也稱為弛豫時間,ΔHp-p越小弛豫時間越長[18].圖3中,熱解淀粉的ΔHp-p從 9.677 4 降至 4.398 6,油浴加熱淀粉的ΔHp-p從 19.061 6 降至 4.398 9,可見隨著加熱溫度的升高,淀粉的線寬不斷減小,孤對電子從高能態(tài)返回低能態(tài)的弛豫時間不斷增加,其自由基的生成種類逐漸減少[9].此外,大豆油中雖然沒有產(chǎn)生PFRs,但其受熱不穩(wěn)定易產(chǎn)生瞬時性自由基,可攻擊破壞淀粉結(jié)構(gòu)產(chǎn)生以多個原子為中心的PFRs[15],自由基的生成種類多于熱解,因此 250 ℃ 油浴加熱淀粉的ΔHp-p明顯高于熱解.

2.1.2 淀粉分子官能團變化與PFRs之間的關(guān)聯(lián)

圖4的FTIR光譜用于研究熱解和油浴加熱對淀粉分子碳骨架結(jié)構(gòu)的影響.圖4(a)中 1 719 cm-1出現(xiàn)的吸收峰歸因于碳水化合物COO-的拉伸振動;1 020 cm-1、567 cm-1處的吸收峰歸因于α-1,4糖苷鍵(C-O-C)的骨骼振動[19].-CH2吸收峰(2 927 cm-1)和C-O-C(1 020 cm-1)峰在加熱過程中明顯減弱并發(fā)生紅移,表明淀粉分子間氫鍵被削弱,淀粉分子內(nèi)的結(jié)晶區(qū)域被破壞.1 740～1 640 cm-1淀粉出現(xiàn)的較強吸收峰是由半縮醛基引起,并且隨著溫度的升高,此處的吸收峰有分裂成2個峰的趨勢,這2個峰可歸為羰基峰和C=C雙鍵峰[12].圖4(b)在相似位置也能找到相同官能團的振動,除此之外,2 913 cm-1、2 848 cm-1和 1 739 cm-1分別對應(yīng)甲基、亞甲基和酯基的分子振動,這些都是食用油中脂肪酸和甘油三酯的特征官能團[20].

2.1.3 淀粉分子元素變化與PFRs之間的關(guān)聯(lián)

不同溫度熱解和油浴加熱淀粉后其元素變化情況見圖5.熱處理后淀粉的C含量上升,O含量下降,O/C比和H/C比下降,表明淀粉熱處理后含氧官能團降低,芳香化程度上升.其中 310 ℃ 時C含量增加率最大,O含量損失率最大,說明在 310 ℃ 時淀粉的降解速率最快,這與Zhao等[21]報道的熱解淀粉化學結(jié)構(gòu)一致.在熱處理過程中,淀粉結(jié)構(gòu)中的O-H鍵和C-O鍵斷裂,生成烷氧基自由基和烷基自由基,烷氧基自由基通過脫烷基化反應(yīng)生成C=O鍵(1 719 cm-1),淀粉中的羥基通過脫水反應(yīng)還可以形成C=C鍵(1 631 cm-1).用 600 MHz13CNMR深入研究了玉米淀粉在不同溫度下的化學結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)淀粉在 200 ℃ 熱處理后C-4(δ=62 ppm)和C-1(δ=100 ppm)峰開始消失,同時,甲基和亞甲基峰強增加,隨著溫度繼續(xù)升高,到 300 ℃ 時甲基和亞甲基峰強減弱,C=O鍵增強,并形成了苯環(huán)結(jié)構(gòu)[22].Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)淀粉的降解產(chǎn)物主要含有環(huán)酮、苯酚和烷基苯.研究證實,芳環(huán)C=C鍵和C=O鍵與PFRs的產(chǎn)生顯著相關(guān)[24].因此,隨著溫度的升高,淀粉產(chǎn)生的PFRs信號強度越強,并且在 310 ℃ 出現(xiàn)PFRs信號突增的情況,與淀粉在熱處理過程中不斷碳化,淀粉結(jié)構(gòu)不斷芳香化,在形成芳香族化合物過程中產(chǎn)生的C=C鍵和C=O鍵有關(guān).

(a) (b)圖4 熱解(a) 和油浴加熱(b) 淀粉紅外光譜Fig.4 FTIR of starch heated by pyrolysis (a) and oil heating (b)

(a) (b)圖5 不同溫度熱解(a)和油浴加熱(b)淀粉的元素含量Fig.5 Element contents of starch produced by pyrolysis (a) and oil heating (b)

2.2 空氣熱解對不同成分食品產(chǎn)生PFRs的影響

由于熱處理方式不同,食品產(chǎn)生的PFRs也不同,即使是同一食物的不同部位,也具有明顯的自由基強度差異[5],因此需要探究不同成分食品熱處理過程產(chǎn)生PFRs的差異.前面的研究指出,在一定溫度范圍內(nèi),油浴加熱和熱解處理對食品產(chǎn)生PFRs差異不明顯,但油脂的存在會影響食品在熱處理過程中結(jié)構(gòu)變化的判定,因此為排除食用油中油脂成分對食品結(jié)構(gòu)表征的干擾,本實驗采用馬弗爐對日常飲食中常見的食品成分:淀粉,蛋白質(zhì)以及它們的1∶1混合物進行熱解處理.

2.2.1 同溫度下蛋白質(zhì)比淀粉更易產(chǎn)生PFRs

熱處理不同成分食品的PFRs信號強度圖譜見圖6.當加熱溫度達到 280 ℃ 時,才能觀察到淀粉樣品產(chǎn)生的PFRs信號,而蛋白質(zhì)產(chǎn)生的PFRs信號在 220 ℃ 時就能觀察到,這一現(xiàn)象與Wei等[25]的研究結(jié)果相符:玉米淀粉的初始熱解溫度為 280.4 ℃,而大豆蛋白的初始熱解溫度為 217.9 ℃.由此可推測不同成分食品PFRs來源與其結(jié)構(gòu)分解有關(guān).

(a) (b) (c)圖6 熱解不同成分食品產(chǎn)生PFRs信號強度圖譜(a為淀粉,b為蛋白質(zhì)淀粉混合物,c為蛋白質(zhì))Fig.6 PFRs signal intensities produced by pyrolysis of food with different components(a: starch;b: protein-starch mixture;c: protein)

此外,容易觀察到相同溫度下蛋白質(zhì)相較淀粉更容易產(chǎn)生PFRs,其產(chǎn)生的PFRs峰形較淀粉也有所差異.其中,310 ℃ 熱處理蛋白質(zhì)產(chǎn)生的PFRs強度為淀粉的8～10倍,可能是因為蛋白質(zhì)中的氫鍵和二硫鍵會促進蛋白質(zhì)與自由基的反應(yīng)與轉(zhuǎn)移[26].蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂形成巰基,游離的巰基和游離的硫醇基團能促進蛋白質(zhì)之間的聚集,且氨基酸殘基易受到氧自由基的攻擊形成羰基和二酪氨酸,反應(yīng)過程比淀粉更復雜,形成PFRs的途徑更多,因此更容易產(chǎn)生PFRs,進而PFRs信號強度更強[27-28].

圖6中可觀察到不同溫度熱處理蛋白質(zhì)產(chǎn)生的PFRs信號強度均高于蛋白質(zhì)淀粉混合物,這可能與淀粉蛋白質(zhì)混合加熱會產(chǎn)生美拉德反應(yīng)有關(guān).原因在于,碳水化合物的存在能夠增加蛋白質(zhì)的變性溫度,減弱自由基生成反應(yīng)[27],即添加淀粉后,需要更高的能量才能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)充分展開,因此蛋白質(zhì)的PFRs信號強度最高,建議在日常蛋白質(zhì)食品加工中可適當添加淀粉,有助于降低PFRs強度.

馬弗爐熱處理不同成分的食品的g值和線寬見表1.可以看出,不同組分的g值和線寬都隨著溫度的升高而降低.g值的變化表明隨著溫度的升高,不同成分食品產(chǎn)生小分子雜原子自由基減少,而生成了更多大分子芳香烴自由基.在 250 ℃ 時,相對淀粉蛋白質(zhì)混合物和蛋白質(zhì),淀粉存在小分子雜原子自由基更多.由于線寬越小弛豫時間越長,表明不同食品組分在加熱過程中自由基逐漸從低能量狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰繝顟B(tài).

表1 不同成分食品熱解后的g值和線寬

2.2.2 不同成分食品的元素變化與PFRs之間的關(guān)聯(lián)

不同成分食品熱解的元素分析見表2,其中蛋白質(zhì)的C含量最高、O含量最低,熱處理后不同成分食品中的C含量均增加,O含量均降低.隨著加熱溫度的升高,不同食品成分的O/C和H/C均下降,表明不同成分食品的芳香度均隨著熱解溫度的升高而增加,推測食品在熱處理過程中發(fā)生了脫水、脫羧以及環(huán)化等反應(yīng)形成了苯環(huán)結(jié)構(gòu),使芳香度增加[21].但蛋白質(zhì)的O/C和H/C更低,因其變性溫度低,熱穩(wěn)定性較差[29],故在熱處理過程中,蛋白質(zhì)的碳化過程比淀粉更快,在形成芳香族化合物過程中相應(yīng)產(chǎn)生的芳環(huán)C=C和羰基基團更多,形成的PFRs強度更高.值得注意的是,蛋白質(zhì)淀粉混合物的N含量隨著溫度的升高不斷增加,可能是蛋白質(zhì)中的氨基酸脫氮過程與碳水化合物的羰基之間發(fā)生美拉德反應(yīng),促進N雜環(huán)化合物的形成[25].由于含N化合物一般會轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的芳香結(jié)構(gòu)[30],而芳香結(jié)構(gòu)是形成和穩(wěn)定自由基的重要因素[31],因此蛋白質(zhì)的PFRs強度遠高于淀粉也可能與N元素在其中發(fā)揮的作用有關(guān).

表2 熱解不同成分食品元素含量變化

2.2.3 不同成分食品分子官能團變化與PFRs之間的關(guān)聯(lián)

熱解不同食品成分的紅外光譜圖譜對比可見圖7.圖7(b)和7(c)中 3 600～3 200 cm-1歸因于蛋白質(zhì)的O-H和N-H拉伸振動,2 922 cm-1為脂肪族C-H拉伸振動,1 390 cm-1為脂肪族彎曲振動[32].1 650～1 500 cm-1之間的峰對應(yīng)芳環(huán)中雙鍵的振動,如C=C或C=N[33].740 cm-1代表芳香環(huán)的搖擺振動[34].從圖中可見隨著溫度的升高,N-H鍵,C-N鍵(1 525 cm-1)逐漸減弱并消失,C=C鍵或C=N鍵先減弱后增加,可能與蛋白質(zhì)淀粉混合物中產(chǎn)生的N雜環(huán)化合物轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的芳香族化合物有關(guān).由圖7(b)可見,蛋白質(zhì)淀粉混合物 250 ℃ 以下的FTIR圖與淀粉差別不大,280 ℃ 以上的FTIR圖與蛋白質(zhì)的一致,表明淀粉與蛋白質(zhì)混合后初始熱解過程主要由蛋白質(zhì)主導,后續(xù)熱解過程主要由淀粉主導.

(a) (b) (c)圖7 熱解淀粉(a)、蛋白質(zhì)淀粉混合物(b)和蛋白質(zhì)(c)的紅外光譜圖譜Fig.7 FTIR of pyrolyzed starch (a),protein-starch mixture (b) and protein (c)

3 結(jié) 論

本研究闡述了熱處理方式及溫度對淀粉產(chǎn)生PFRs的影響和熱處理對不同成分食品產(chǎn)生PFRs的影響,建立了食品結(jié)構(gòu)變化與PFRs信號之間的關(guān)聯(lián),所得主要結(jié)論如下:

1) 食品中產(chǎn)生PFRs信號強度與加熱溫度顯著相關(guān).熱處理溫度低于 220 ℃ 時,淀粉中不產(chǎn)生PFRs信號.溫度越高,淀粉產(chǎn)生的PFRs信號強度越強.淀粉熱處理過程中生成PFRs可能與淀粉結(jié)構(gòu)不斷芳香化、分子中的O-H鍵和C-O鍵斷裂產(chǎn)生C=C鍵和C=O鍵有關(guān).

2) 在一定的熱處理溫度下,食品中產(chǎn)生的PFRs信號強度與熱處理方式無明顯相關(guān)性.溫度為250～280 ℃,空氣熱解和油浴加熱均能使淀粉產(chǎn)生PFRs信號,但PFRs信號強度之間無顯著性差異.進一步升高溫度時,熱解淀粉產(chǎn)生的PFRs信號強度約為油浴加熱的3倍.為降低淀粉類食品中PFRs對人體的危害,宜采用油浴加熱的方式進行熱處理.

3) 溫度對蛋白質(zhì)類食物產(chǎn)生PFRs影響顯著,其初始熱解溫度比淀粉更低,在 220 ℃ 就檢測出較強的PFRs信號.同一溫度熱處理蛋白質(zhì)產(chǎn)生的PFRs也高于淀粉,可能是蛋白質(zhì)熱解過程比淀粉更復雜,形成PFRs的途徑更多,蛋白質(zhì)中的氫鍵、二硫鍵以及N元素可促進蛋白質(zhì)與自由基的反應(yīng),蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基也易受到氧自由基的攻擊形成羰基.同一溫度蛋白質(zhì)淀粉混合物PFRs信號強度和N/C比低于蛋白質(zhì),因此日常加工蛋白質(zhì)類食品,可適當添加淀粉,有助于減少PFRs的產(chǎn)生.