旱脅迫相關(guān)綠豆VrERF家族基因發(fā)掘及表達(dá)分析

李蒙鑫，丁冬會(huì)，張雨朋，景琳超，魯建榮，劉嘉斐，陳吉寶，楊樹瓊*

（1. 河南省南水北調(diào)中線水源區(qū)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473061；2. 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473061）

綠豆（Vigna radiate(L.) Wilczek），別名菉豆、植豆等，是我國重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物，在中國已經(jīng)有兩千多年的栽培歷史。綠豆在生長過程中始終處于一種土壤條件，不可自行移動(dòng)，具有固定性，其在整個(gè)生長發(fā)育過程中非常容易遭受干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫影響[1]。干旱脅迫不僅是限制綠豆生命活動(dòng)的限制因子，也是決定其地理分布及限制其產(chǎn)量的主要因素[2]。部分綠豆具有一定的抗旱能力，但是在長期干旱的地區(qū)，需要為其定期補(bǔ)充水分，否則會(huì)對綠豆產(chǎn)量造成一定的影響。目前國內(nèi)種植主要集中在北方，內(nèi)蒙古、吉林和黑龍江等省份干旱貧瘠的山區(qū)丘陵地帶[3]，且大部分綠豆產(chǎn)區(qū)自然降雨量少，灌溉條件差。有研究表明，干旱脅迫會(huì)對綠豆的光合作用產(chǎn)生抑制作用，光化學(xué)效率降低導(dǎo)致光能過剩，其光合器官會(huì)因此遭到破壞[2]。而且隨著干旱脅迫程度的增加，綠豆苗期的植株光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度都會(huì)逐步減弱，并且這些指標(biāo)相互之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，隨著干旱脅迫時(shí)間的增加，葉綠素含量和葉片的含水量呈現(xiàn)低—高—低這樣的一個(gè)變化趨勢，進(jìn)而影響綠豆種子的品質(zhì)以及產(chǎn)量[4]。

干旱脅迫不僅會(huì)影響植物的形態(tài)建成[5]，還會(huì)誘導(dǎo)植物相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，對其作出反應(yīng)的主要調(diào)控基因就是轉(zhuǎn)錄因子。作為植物體內(nèi)廣泛存在的超大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子最先在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[6]，依據(jù)所含的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)及其結(jié)構(gòu)域同源性，將擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子分為5 個(gè)亞家族：AP2、ERF、DREB、RAV 和Soloist。AP2/ERF家族基因功能也呈現(xiàn)多樣化，研究發(fā)現(xiàn)AP2/ERF家族參與了植物的高溫、干旱、鹽堿以及機(jī)械損傷等非生物逆境響應(yīng)過程[7-8]。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子可通過調(diào)節(jié)下游基因或相互合作來抵抗干旱脅迫，過表達(dá)ZmERF21顯著增加了玉米葉綠素含量和抗氧化酶活性，并通過調(diào)節(jié)激素信號和脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)來增強(qiáng)玉米幼苗的耐旱性[9]。水稻OsERF83可調(diào)控旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，過表達(dá)OsERF83顯著提高了水稻的耐旱性[10]。大豆GmDREB8可負(fù)向調(diào)控植物的耐旱能力，異源表達(dá)GmDREB8轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型對干旱脅迫更敏感，而大豆GmDREB8沉默株系表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱性[11]。水稻OsERF3基因含有EAR抑制結(jié)構(gòu)域基序，對干旱脅迫起負(fù)調(diào)控作用[12]。上述研究表明，AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對干旱脅迫的分子調(diào)控機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子對研究植物響應(yīng)逆境脅迫生理過程具有十分重要的價(jià)值，然而目前為止，對綠豆AP2/ERF家族基因的逆境響應(yīng)及表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究較少。本課題組前期已篩選到87 個(gè)綠豆VrERF家族基因，并對其結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)等進(jìn)行了初步分析。為進(jìn)一步探究VrERF家族基因在綠豆逆境脅迫中的應(yīng)答機(jī)制，本研究對VrERF家族基因的種間同源性、互作蛋白功能及順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測分析，并通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析了各Vr-ERF基因的組織特異性表達(dá)、干旱脅迫下基因表達(dá)差異情況，篩選了2 個(gè)與干旱脅迫相關(guān)的VrERF基因并進(jìn)行了qRT-PCR 驗(yàn)證。此研究將為進(jìn)一步開展干旱脅迫相關(guān)基因的功能分析奠定了基礎(chǔ)，也將為利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因育種等手段培育綠豆抗逆新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 綠豆VrERF 家族基因的種間同源性、互作蛋白功能預(yù)測與啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

綠豆、豌豆、菜豆與大豆的基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自NCBI-genome（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/）和PlantBioinfoPF（https：//urgi.versailles.inra.fr/Species/Pisum），各物種間全基因組比對、ERF家族基因間的共線性可視化使用Java 環(huán)境下的MCScanX 和TBtools 軟件進(jìn)行分析。VrERF蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析使用String 蛋白互作數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/），物種參數(shù)選擇模式植物擬南芥。使用TBtools 提取VrERF家族基因起始密碼子上游2 000 bp 序列，啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測分析使用在線軟件PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，各順式作用元件的可視化分析使用TBtools進(jìn)行。

1.2 綠豆VrERF 家族基因的組織特異性表達(dá)、干旱脅迫下的表達(dá)及驗(yàn)證分析

從NCBI-SRA（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載綠豆發(fā)育幾個(gè)關(guān)鍵部位：根、下胚軸、葉、花、莖尖和果實(shí)的表達(dá)數(shù)據(jù)，根據(jù)表達(dá)量進(jìn)行綠豆VrERF家族基因的組織特異性表達(dá)分析，使用TBtools繪制熱圖。根據(jù)NCBI-SRA中正常供水和干旱脅迫處理的綠豆栽培種(VC1973A)和野生型（JP226873）V1期幼苗的葉片轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選VrERF家族基因的FPKM值，使用TBtools繪制熱圖。

對盆栽的綠豆栽培種(VC1973A)和野生型（JP226873）V1期幼苗進(jìn)行20% PEG6000 溶液處理來模擬干旱脅迫，提取處理后0、6 及24 h 下的綠豆葉片RNA 后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以綠豆基因VrActin（Vradi03g00210）作為內(nèi)參基因，在Bio-RAD熒光定量PCR 儀上采用兩步法進(jìn)行qRT-PCR 分析，按照2-ΔΔCt法計(jì)算VrERF7和VrERF62基因在不同處理時(shí)間下的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆VrERF 與豌豆、菜豆及大豆ERF 家族基因的同源性

前期研究結(jié)果證實(shí)了VrERF 蛋白與其他物種ERF蛋白在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，本研究進(jìn)一步分析了VrERF與PsERF、PvERF和GmERF家族基因間的同源性（圖1）。各物種ERF家族基因間的同源性分析結(jié)果顯示，PsERF和VrERF家族基因之間有62個(gè)同源基因?qū)?，但并不是所有的ERF基因間存在著1對1關(guān)系，如2對1（Psat2g181560/Psat6g201400-VrERF42）、3 對1（Psat2g181560/Psat4g067400/Psat6g201400-VrERF45）等。PvERF和VrERF家族基因之間有126 個(gè)同源基因?qū)?，同樣存在基因間多對一關(guān)系，如2 對1（PHAVU_008G046400g/PHAVU_010G050600g-VrERF21）、4對1（PHAVU_001G031200g/PHAVU_002G009100g/PHAVU_003G232600g/PHAVU_009G074300g-VrERF76）。GmERF和VrERF家族基因之間有194 個(gè)同源基因?qū)Γ蜷g多對一關(guān)系更普遍，僅有9個(gè)同源基因?qū)κ?對1關(guān)系。綜上可推測VrERF家族基因與其他豆科物種ERF基因間應(yīng)該具有比相似的功能特征。

圖1 綠豆與豌豆、菜豆、大豆ERF家族基因的共線性分析Figure 1 Synteny analysis of ERF genes between mung bean and pea，kidney bean，and soybean

2.2 VrERF互作蛋白的功能預(yù)測

以擬南芥為參考物種，利用string 蛋白數(shù)據(jù)庫對VrERF互作蛋白進(jìn)行了預(yù)測分析，部分結(jié)果如圖2所示。VrERF25/38/40/42/43/44/45/46/48/58 同源蛋白CBF4不僅與VrERF1/13/14/17/18/19/21同源蛋白ERF13 的互作蛋白都包括bZIP，還與VrERF51/52/53/56/57 同源蛋白TINY2 的互作蛋白都包括AP2。VrERF1/13/14/17/18/19/21 同 源 蛋 白ERF13 和Vr-ERF2/33/35/71 同源蛋白ERF-1 的互作蛋白都包括STZ 和WRYK40；VrERF9/10/11/23/30/34/70 同源蛋白TDR1 的 互 作 蛋 白 包 括AMR1、CSN5B 和WRYK30 等；VrERF72/84/85/86/87 同 源 蛋 白PLT1的互作蛋白包括SMB、SHR 和RGF1 等；VrERF78/79/80/81同源蛋白ADAP 的互作蛋白包括ZFP1、BCCP2 和ADCL 等；VrERF73/74/75/76 同 源 蛋 白ANT的互作蛋白包括WUS、CYP78A5和JAG等。綜上結(jié)果推測綠豆VrERF家族基因與同緣關(guān)系較近的擬南芥AtERF13、AtERF028及AtERF98等具有相似的生物學(xué)功能，VrERF 通過與以上蛋白互作參與綠豆生長發(fā)育過程。

圖2 VrERF互作蛋白功能預(yù)測網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Prediction of functional network of interacting proteins of VrERF

2.3 VrERF家族基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

提取綠豆VrERF家族基因上游2 000 bp的基因組序列，利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫對87個(gè)VrERF基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行了分析（圖3）。綠豆VrERF基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件可分為生長發(fā)育相關(guān)、脅迫響應(yīng)及激素響應(yīng)元件，其中生長發(fā)育相關(guān)元件包含胚乳表達(dá)、分生組織表達(dá)等元件，脅迫響應(yīng)元件包含缺氧、干旱和低溫防御等相關(guān)元件，激素響應(yīng)元件有赤霉素、脫落酸和生長素等元件。光響應(yīng)（453 個(gè)）、脫落酸響應(yīng)（180 個(gè)）、厭氧誘導(dǎo)（180 個(gè)）及茉莉酸甲酯響應(yīng)（136 個(gè)）元件是綠豆VrERF家族基因啟動(dòng)子序列所具有的主要順式作用元件，其中光響應(yīng)元件在幾乎所有VrERF基因的啟動(dòng)子區(qū)均有分布，除VrERF58（0 個(gè)）和VrERF14（1個(gè)）外，其余基因包含多個(gè)光響應(yīng)元件，這表明綠豆VrERF家族基因可能參與了植株的光形態(tài)建成或光照相關(guān)的環(huán)境適應(yīng)。啟動(dòng)子區(qū)具有脫落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素和生長素等激素響應(yīng)元件的綠豆VrERF基因數(shù)量分別為72、63、39及33個(gè)，說明綠豆VrERF家族基因廣泛參與了不同植物激素的信號途徑。此外，36個(gè)VrERF基因啟動(dòng)子區(qū)存在干旱響應(yīng)元件，24 個(gè)VrERF基因啟動(dòng)子區(qū)存在低溫響應(yīng)元件，這部分基因也參與了綠豆干旱、低溫等非生物逆境響應(yīng)過程。

圖3 綠豆AP2/ERF基因的激素和非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件分析Figure 3 Analysis of cis-acting elements related to hormone and abiotic stress response of mung bean AP2/ERF genes

2.4 VrERF家族基因的組織特異性表達(dá)分析

利用TBtools 對綠豆87 個(gè)VrERF家族基因的根、下胚軸、葉、莖尖、花和果實(shí)6個(gè)不同器官組織的表達(dá)情況進(jìn)行了分析（圖4）。結(jié)果顯示，在整個(gè)綠豆發(fā)育過程的各個(gè)組織中均有VrERF家族基因表達(dá)，但不同基因在不同器官組織的表達(dá)模式差異較為明顯，其中46個(gè)基因在所有6個(gè)器官組織中均有表達(dá)，6 個(gè)基因只在花中有表達(dá)。依據(jù)基因表達(dá)量來看，多數(shù)VrERF家族基因的表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性，如VrERF7/17/22/26在根中特異性的高表達(dá)，VrERF2/4/8/24/49/61/62在下胚軸中特異性的高表達(dá)。值得注意的是，VrERF4/7/62在所有組織器官中均有較高的表達(dá)，VrERF4在花中的表達(dá)量顯著高于其他基因，VrERF7在根、下胚軸、莖尖和果實(shí)中的表達(dá)量顯著高于其他基因，VrERF62在葉中的表達(dá)量顯著高于其他基因。綜上結(jié)果表明，不同Vr-ERF家族基因在綠豆各組織器官中功能具有差異性。

圖4 VrERF在綠豆VC1973A不同器官組織中的基因表達(dá)情況Figure 4 Expression levels in different organs of VrERFs in mung bean VC1973A

2.5 VrERF 家族基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

與正常澆水相比，綠豆栽培種(VC1973A)和野生型（JP226873）在干旱脅迫處理下，綠豆VrERF基因家族中共檢測到68 個(gè)基因有差異表達(dá)，19 個(gè)基因未檢測到差異表達(dá)（圖5）。與正常澆水相比，干旱脅迫的VC1973A 葉片中有45 個(gè)VrERF基因表達(dá)下調(diào)，其中VrERF7/22/62顯著下調(diào)；18 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，但均未顯著上調(diào)。干旱脅迫的JP226873葉片中有50 個(gè)VrERF基因表達(dá)下調(diào)，其中VrERF7/62顯著下調(diào)；10 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，其中VrERF22顯著上調(diào)。未受脅迫時(shí)，VC1973A 葉片中表達(dá)量高于JP226873的VrERF基因數(shù)量為37，表達(dá)量等于或低于JP226873 的基因數(shù)量也為37；干旱脅迫后，VC1973A 葉片中表達(dá)量高于JP226873 的VrERF基因數(shù)量為30，表達(dá)量等于或低于JP226873的基因數(shù)量同樣為30；表明綠豆VC1973A 和JP226873 對干旱脅迫的響應(yīng)沒有明顯差異。

圖5 正常澆水和干旱脅迫下VC1973A和JP226873中VrERF基因的表達(dá)情況Figure 5 Expression levels of VrERF in VC1973A and JP226873 under normal irrigation and drought stress

2.6 干旱脅迫下VrERF7/62表達(dá)驗(yàn)證分析

根據(jù)RNA-seq 構(gòu)建的綠豆VrERF家族基因表達(dá)譜，挑選了干旱脅迫下在綠豆栽培種(VC1973A)和野生型（JP226873）葉片中均顯著下調(diào)表達(dá)的2個(gè)基因（VrERF7和VrERF62），采用qRT-PCR 對Vr-ERF7/62在干旱脅迫處理下的表達(dá)情況進(jìn)行了驗(yàn)證分析（圖6）。結(jié)果顯示，隨著干旱脅迫處理時(shí)間的增加，綠豆栽培種(VC1973A)和野生型（JP226873）葉片中VrERF7和VrERF62的表達(dá)量均呈顯著下降趨勢。與VrERF7基因在VC1973A葉片中的表達(dá)量變化相比，它在JP226873葉片中的表達(dá)量變化呈現(xiàn)出更顯著的下降趨勢。在同品種綠豆中，VrERF62表達(dá)下降趨勢較VrERF7更顯著。干旱脅迫下，Vr-ERF7/62基因表達(dá)的qRT-PCR 驗(yàn)證分析結(jié)果總體上與轉(zhuǎn)錄組檢測結(jié)果一致。

圖6 VrERF7/62在干旱脅迫處理VC1973A和JP226873中表達(dá)的qRT-PCR分析Figure 6 Expression of VrERF7/62 in VC1973A and JP226873 under different abiotic stress

3 討論與結(jié)論

AP2/ERF基因家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中扮演重要的角色。為篩選綠豆旱脅迫相關(guān)的AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子，基于生物信息學(xué)、轉(zhuǎn)錄組測序及qRT-PCR分析，本研究初步篩選了可能與旱脅迫相關(guān)的VrERF家族基因。自Y. Sakuma等[13]在2002年從擬南芥中鑒定出145 個(gè)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子開始，目前已在水稻[14]、大豆[15]和小麥[16]等植物中分別鑒定出了170、148及565個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，不同物種AP2/ERF家族基因具有相似的結(jié)構(gòu)并在進(jìn)化上可能具有共同的起源。綠豆與豌豆、菜豆和大豆ERF家族基因間的共線性分析發(fā)現(xiàn)，PsERF、PvERF和GmERF分別與VrERF家族基因間至少存在62個(gè)同源基因?qū)Γ@說明豆科植物ERF家族基因具有相同的進(jìn)化起源。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)豆科植物ERF的同源基因?qū)﹂g存在多對一現(xiàn)象，這也表明豆科植物ERF家族基因存在數(shù)量擴(kuò)張現(xiàn)象，特別是多倍體大豆。

啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件是基因功能的重要組分，能夠反映基因潛在的功能和調(diào)控途徑[17]。綠豆AP2/ERF家族基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件主要由光響應(yīng)、激素響應(yīng)及脅迫響應(yīng)等類型組成，不同VrERF基因啟動(dòng)子區(qū)的響應(yīng)元件數(shù)量及類型不同，這表明不同亞家族基因在功能上產(chǎn)生了分化。但不同亞家族基因的啟動(dòng)子區(qū)可能含有同類型的響應(yīng)元件，它們也可能共同參與了相同的調(diào)控途徑[18]。同時(shí)，構(gòu)建的VrERF蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，綠豆、擬南芥等不同植物的AP2/ERF 亞家族蛋白間存在廣泛的互作關(guān)系，這也進(jìn)一步說明不同亞家族的AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子可能參與同一調(diào)控途徑[17-19]。AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)對干旱脅迫時(shí)具有多種調(diào)節(jié)方式，但主要通過激素調(diào)節(jié)，如在水稻中異源表達(dá)番茄TSRF1，誘導(dǎo)水稻脫落酸（ABA）合成相關(guān)基因SDR以及脯氨酸合成和光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻對滲透脅迫和干旱脅迫的抗性[20-21]。在綠豆基因組中，VrERF家族基因的啟動(dòng)子序列中不僅存在脫落酸、赤霉素等激素響應(yīng)元件，還具有一些干旱響應(yīng)元件，這說明綠豆VrERF基因可能通過多種調(diào)節(jié)方式來調(diào)控綠豆應(yīng)對干旱脅迫。

AP2/ERF家族基因具有多樣的生物學(xué)功能，不同亞家族基因在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮不同作用。不同器官組織的特異性表達(dá)分析顯示，大多數(shù)VrERF家族基因在綠豆根、下胚軸和葉等器官組織中普遍都有表達(dá)，但各VrERF家族基因在不同組織器官中的表達(dá)水平存在差異，如VrERF61下胚軸中特異性的高水平表達(dá)，而VrERF7在所有組織器官中均有較高水平的表達(dá)，各VrERF基因表達(dá)模式的分化也表明了其功能上的分化?，F(xiàn)已有研究表明，AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子也可作為響應(yīng)干旱負(fù)向調(diào)控基因發(fā)揮作用，水稻OsERF109基因可通過抑制乙烯的釋放進(jìn)而對水稻的抗旱性起負(fù)調(diào)控作用，蒙古冰草AmERF4-2在干旱脅迫下呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)并呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控作用[22-23]。本研究的干旱脅迫RNA-seq表達(dá)譜分析顯示，與其他VrERF家族基因相比，VrERF7/62基因在干旱脅迫下呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)表達(dá)，qRT-PCR 驗(yàn)證分析也表明VrERF7/62明顯受干旱脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，VrERF7啟動(dòng)子區(qū)具有脫落酸響應(yīng)元件，VrERF7 互作蛋白R(shí)AP2.2為乙烯響應(yīng)蛋白；VrERF62啟動(dòng)子區(qū)具有脫落酸和干旱脅迫響應(yīng)元件，VrERF62 互作蛋白R(shí)AP2.4 為干旱響應(yīng)蛋白。因此，我們推測VrERF7/62參與了綠豆響應(yīng)干旱脅迫過程，可能發(fā)揮了負(fù)向調(diào)控作用，但具體基因功能仍需開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。