miRNA-155靶向SOCS5對(duì)無乳鏈球菌誘導(dǎo)羅非魚腦星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的影響

張 祥，黃 瑜，蔡 佳，簡紀(jì)常，王 蓓

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制廣東省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactis）屬革蘭陽性菌，是一種人、畜及水產(chǎn)動(dòng)物共患的致病菌，近年在羅非魚養(yǎng)殖中呈高暴發(fā)態(tài)勢(shì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。腦是無乳鏈球菌感染的一個(gè)重要靶器官[3]，感染機(jī)制是無乳鏈球菌通過黏附吞噬細(xì)胞逃避免疫，后隨巨噬細(xì)胞游走侵染其他組織，并透過血-腦屏障引發(fā)腦膜炎破壞腦-神經(jīng)系統(tǒng)，最終由于過度炎癥反應(yīng)，魚體免疫系統(tǒng)崩潰[4]。

微小核糖核酸155（microRNA-155，miR-155）是由23 個(gè)核苷酸組成的一組單鏈小分子RNA，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平上起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]，其在炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155通過與靶mRNA的3＇-非翻譯區(qū)（3＇-untranslated region，3＇-UTR）堿基互補(bǔ)配對(duì)，阻礙靶mRNA的翻譯或?qū)е缕浣到鈁6]，miR-155與炎癥反應(yīng)等病理過程息息相關(guān)[7,8]。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，感染無乳鏈球菌后包括miR-155 在內(nèi)的多個(gè)miRNA 在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）腦及免疫器官中呈顯著的時(shí)間依賴性表達(dá)，這進(jìn)一步說明miR-155 的表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[9]。目前關(guān)于miR-155 與靶基因互作調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的報(bào)道多集中于哺乳動(dòng)物中，如在小鼠的特應(yīng)性皮炎和人體的潰瘍性結(jié)腸炎中均有miR-155參與并發(fā)揮作用[10,11]。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子5（Suppressor of cytokine signaling 5，SOCS5）屬于免疫抑制分子家族，是一類調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑，可以被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而產(chǎn)生，又可反過來抑制眾多促炎癥因子[12,13]。如TNF-α、IL-6等是JAK/STAT 通路上重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因素。目前關(guān)于SOCS5參與炎癥反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道主要集中在人、小鼠等哺乳動(dòng)物中[14,15]，關(guān)于SOCS5與miRNA 互作參與炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚未見報(bào)道。

基于此，本研究通過生物信息學(xué)分析和qRTPCR、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)無乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-155 和SOCS5基因表達(dá)模式，預(yù)測(cè)miR-155 和SOCS5的靶結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建尼羅羅非魚SOCS5基因野生型和突變型報(bào)告質(zhì)粒，驗(yàn)證miR-155和SOCS5的靶向關(guān)系，通過進(jìn)一步過表達(dá)和敲降miR-155，檢測(cè)miR-155對(duì)SOCS5基因表達(dá)的影響和調(diào)控模式，為后續(xù)深入研究miR-155靶向SOCS5在無乳鏈球菌誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及菌株 尼羅羅非魚星形膠質(zhì)細(xì)胞系TA-02 由本課題組分離并建系成功[16]。細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素混合液的L15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HEK-293T 細(xì)胞系由廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。無乳鏈球菌ZQ0910 株由廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存[17]。

1.1.2 主要試劑 pGL3-Basic、PRL-TK 雙熒光素酶質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室保存）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；RNA 提?。═ransZol Up Plus RNA Kit）、cDNA合成（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix）及熒光定量（TransStart Green qPCR Super Mix）試劑（北京全式金生物公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibico）；LipofectamineTM3000（賽默飛世爾科技）；Endo-free Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒小提試劑盒、Universal DNA Purification Kit DNA 純化回收試劑盒（Omega Bio-Tek）；KpnI、SmaI 內(nèi)切酶（寶日生物技術(shù)（北京）有限公司）；所有引物和尼羅羅非魚miR-155 mimics、miR-155 inhibitor 及其mimics NC、inhibitor NC 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1 無乳鏈球菌感染TA-02 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將無乳鏈球菌ZQ0910 菌株和培養(yǎng)基按體積比1∶100 的比例接種到BHI 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化、擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃震蕩培養(yǎng)至飽和，離心收集菌體，用1×磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.3±0.1）沉淀菌體，重復(fù)兩次將培養(yǎng)液清洗干凈，用PBS重懸菌體至終濃度為1×107cfu/mL 備用。取生長狀態(tài)良好的TA-02 細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)。每孔加入5 μL無乳鏈球菌菌懸液與TA-02細(xì)胞共孵育，分別在0、2、4、6 h收集細(xì)胞。吸去培養(yǎng)液，用PBS（pH 7.3 ± 0.1）洗滌2次，每孔加1 mL Trizol Reagent混勻，室溫放置5 min，轉(zhuǎn)移到無RNase 的EP 管中，-80 ℃凍存，待同一批各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集完畢后一并提取RNA。

1.2.2 TA-02 細(xì)胞RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)TransZol Up Plus RNA Kit 說明書提取羅非魚腦星形膠質(zhì)細(xì)胞RNA。取1 μL 的RNA 檢測(cè)其濃度，瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA 的質(zhì)量。按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix說明書將提取的羅非魚腦星形膠質(zhì)細(xì)胞總RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA。

通過NCBI 設(shè)計(jì)尼羅羅非魚SOCS5定量引物，從miRNA Base 數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org）獲取尼羅羅非魚miR-155 成熟體序列，莖環(huán)法合成miR-155 莖環(huán)引物和定量引物。miRNA 須加入特異莖環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為模板，miRNA 逆轉(zhuǎn)錄方法參考廖寧馨[18]的方法進(jìn)行。

1.2.3 無乳鏈球菌誘導(dǎo)TA-02 細(xì)胞中miR-155、炎癥因子和SOCS5基因表達(dá)量檢測(cè) 通過羅氏LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)感染無乳鏈球菌的TA-02中miR-155和SOCS5基因的相對(duì)表達(dá)量，觀察其隨時(shí)間變化而變化的規(guī)律。以TA-02 細(xì)胞cDNA為模板，qPCR 反應(yīng)體系參考TransStart Green qPCR Super Mix 說明書進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱60 s；95 ℃10 s、60 ℃20 s、72 ℃20 s，40 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)SOCS5基因和miR-155 的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin 為內(nèi)參基因，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，用2-ΔΔCT法計(jì)算結(jié)果。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 從miRNA Base 數(shù)據(jù)庫（http://www.Mirbase.org）獲得尼羅羅非魚miR-155成熟體序列，對(duì)比在各個(gè)物種間的保守性，利用生物信息學(xué)方法（TargetScan、PicTar、miRanda）分析預(yù)測(cè)SOCS5與miR-155 的靶向關(guān)系及靶位點(diǎn)，NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取尼羅羅非魚SOCS5基因3＇UTR序列。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增 根據(jù)NCBI 中查找的尼羅羅非魚SOCS5基因3＇UTR 序列設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，在序列兩端添加KpnI、SmaI 酶切位點(diǎn)，克隆得到野生型序列（WT）。同時(shí)對(duì)SOCS5結(jié)合位點(diǎn)堿基進(jìn)行突變，使用搭橋法（重疊PCR）設(shè)計(jì)SOCS5基因PCR 擴(kuò)增引物，克隆得到突變型序列（mut）。并根據(jù)SOCS5基因3＇UTR 序列設(shè)計(jì)定量引物（包含結(jié)合位點(diǎn)），送生工生物工程（上海）有限公司合成，擴(kuò)增片段大小為533 bp。以TA-02細(xì)胞cDNA為模板，擴(kuò)增SOCS53＇UTR 序列，PCR 擴(kuò)增體系：（總體積20 μL）Extaq 酶10 μL，上下游引物（33 μg/mL)添加各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖電泳分析。

1.2.6 產(chǎn)物純化與酶切 根據(jù)Universal DNA Purification Kit DNA 純化回收試劑盒說明書進(jìn)行產(chǎn)物純化，用限制性內(nèi)切酶KpnI、SmaI分別對(duì)純化產(chǎn)物和pGL3-Basic 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。酶切體系（50 μL）：載體和SOCS5純化產(chǎn)物各1 000 ng/μL，KpnI、SmaI 各2 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 補(bǔ)足50 μL。37 ℃酶切30 min。酶切后的載體和SOCS5基因片段純化步驟同產(chǎn)物純化。

1.2.7 連接轉(zhuǎn)化和測(cè)序鑒定 根據(jù)T4 DNA Ligase說明書將酶切純化后的目的片段與pGL3-Basic載體進(jìn)行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，加入LB（無抗生素）培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min 震蕩培養(yǎng)1～2 h。離心后留100 μL 菌液混勻沉淀，涂于含100 μg/mL Amp 抗生素的LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h。挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)分析正確后，提取質(zhì)粒保存，質(zhì)粒提取根據(jù)Endo-free Plasmid Mini Kit I 質(zhì)粒小提試劑盒說明進(jìn)行。

2011年，在立足博愛竹林資源現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上提出的博愛竹林發(fā)展目標(biāo)、總體布局和保護(hù)利用等重點(diǎn)工程，通過了我國首個(gè)國家級(jí)專家評(píng)審的縣級(jí)產(chǎn)業(yè)規(guī)劃——《博愛縣竹林資源保護(hù)利用總體規(guī)劃》，對(duì)于保護(hù)利用竹林稀缺資源、弘揚(yáng)竹產(chǎn)業(yè)文化具有重要意義[29]。

1.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶活性檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長期的HEK-293T細(xì)胞在細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)接種到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL 在37 ℃（含體積分?jǐn)?shù)5% CO2）的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)（濃度為1×106mL-1）。細(xì)胞匯合度70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法和用量按照Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)共分為6組：pGL3-Basic-NC+miR-155 mimics-NC 組、pGL3-Basic-NC+miR-155 mimics組、SOCS5-3＇UTR-WT+miR-155 mimics-NC 組、SOCS5-3＇UTR-WT+miR-155 mimics 組、SOCS5-3＇UTR-mut+miR-155 mimics-NC 組、SOCS5-3＇UTRmut+miR-155 mimics組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔總體積50 μL。6 h 后，更換含血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染48 h 后吸出培養(yǎng)基，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.2.9 miR-155 對(duì)SOCS5 表達(dá)量的影響 將miR-155 mimics、mimics NC、miR-155 inhibitor、inhibitor NC 分別轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞樣本，進(jìn)行RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR 檢測(cè)miR-155 的表達(dá)量，評(píng)估m(xù)imics 及inhibitor 的效果。將miR-155 mimics、mimics NC、miR-155 inhibitor、inhibitor NC 分別和SOCS5共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞樣本，進(jìn)行RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄，利用熒光定量PCR 檢測(cè)SOCS5基因的相對(duì)表達(dá)量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，用2-ΔΔCT方法計(jì)算結(jié)果。

1.2.10 質(zhì)粒和miR-155 inhibitor 共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞 將miR-155 mimics 和miR-155 inhibitor 以及SOCS5野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞。miR-155 mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染濃度為20 μmol/μL，每孔以體積比1:1 的比例將miR-155 mimics/inhibitor 與SOCS5-WT-3'UTR 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染miR-155 mimics 和SOCS5-WT-3'UTR 質(zhì)粒做對(duì)照。分別在轉(zhuǎn)染后6 h 和12 h 收集細(xì)胞樣本，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-155和SOCS5表達(dá)量。

1.2.11 HEK-293T 細(xì)胞RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS（pH 7.3±0.1）洗滌2 次，加入1 mLTrizol Reagent，充分混勻，室溫放置5 min，轉(zhuǎn)移到無RNase 的EP 管中，-80 ℃凍存，待同一批各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品收集完畢后一并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后cDNA放-20 ℃保存。

1.2.12 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 后尼羅羅非魚miR-155 和SOCS5 表達(dá)量檢測(cè) 通過羅氏LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)共轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor后HEK-293T 細(xì)胞中miR-155 和SOCS5基因的相對(duì)表達(dá)量。以上述反轉(zhuǎn)錄的HEK-293T 細(xì)胞cDNA 為模板，檢測(cè)SOCS5和miR-155 的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH 為內(nèi)參，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，用2-ΔΔCT方法計(jì)算結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05 作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)，使用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 無乳鏈球菌感染對(duì)TA-02 細(xì)胞中miR-155 和SOCS5基因表達(dá)的影響

圖1 無乳鏈球菌感染TA-02細(xì)胞中的miR-155和SOCS5表達(dá)Fig.1 Expression of miR-155 and SOCS5 in TA-02 cells infected with Streptococcus agalactiae

2.2 無乳鏈球菌感染對(duì)TA-02細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響

無乳鏈球菌ZQ0910感染TA-02細(xì)胞0、2、4、6 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)炎癥因子表達(dá)量如圖2 所示。隨著感染時(shí)間增長，促炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)量與對(duì)照組相比逐漸升高，IL-1β在2、4 和6 h分別升高0.74、0.62和0.39倍，TNF-α分別升高0.04、0.51 和0.42 倍。而抑炎癥因子TGF-β和IL-10與對(duì)照組相比逐漸降低，TGF-β在2、4 和6 h 分別降低0.06、0.10 和0.40 倍，IL-10在2、4 和6 h 分別降低0.22、0.30和0.52倍。

圖2 無乳鏈球菌感染TA-02細(xì)胞中的炎癥因子表達(dá)Fig.2 Expression of inflammatory cytokines in TA-02 cells infected with Streptococcus agalactiae

2.3 miR-155和SOCS5靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過比對(duì)證明miR-155成熟體序列在包括人在內(nèi)的多個(gè)物種間具有高度保守性，通過TargetScan等數(shù)據(jù)庫查詢到miR-155與SOCS5存在堿基互補(bǔ)序列，具有一個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖3），這提示SOCS5可能是miR-155的靶基因。

圖3 miR-155-5p與SOCS5結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of binding sites between miR-155-5p and SOCS5

2.4 PCR擴(kuò)增與酶切產(chǎn)物鑒定

PCR 擴(kuò)增尼羅羅非魚SOCS5野生型和突變型目的片段長度應(yīng)為533 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明經(jīng)酶切純化后的SOCS5野生型和突變型片段大小與預(yù)期片段長度一致，為533 bp，將目的片段構(gòu)建至pGL3-Basic載體中，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定，將符合目標(biāo)片段大小的樣品送生工進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期片段一致（圖4）。

圖4 SOCS5基因3＇UTR區(qū)和pGL3-Basic載體酶切純化產(chǎn)物電泳條帶Fig.4 Electrophoretic map of the 3＇UTR region of SOCS5 gene and the purified product digested by pGL3-Basic vector

2.5 測(cè)序分析

對(duì)含有尼羅羅非魚SOCS5基因結(jié)合位點(diǎn)的野生型序列及缺失尼羅羅非魚SOCS5基因結(jié)合位點(diǎn)的突變型序列進(jìn)行克隆測(cè)序，尼羅羅非魚SOCS5-WT 載體和SOCS5-mut 載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證均構(gòu)建成功，成功將靶序列TGCATTA 突變?yōu)镃TAGCGC，可用于后續(xù)靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（圖5）。

圖5 SOCS5野生型與突變型重組質(zhì)粒部分測(cè)序結(jié)果Fig.5 Partial sequencing of SOCS5 wild type and mutant recombinant plasmid

2.6 miR-155對(duì)SOCS5的調(diào)控作用

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖6），共轉(zhuǎn)染miR-155 模擬體和野生型報(bào)告質(zhì)粒后，與轉(zhuǎn)染的miRNA的陰性對(duì)照相比，miR-155 模擬物可極顯著（P＜0.000 1）抑制其活性，抑制效果達(dá)72.9%。miR-155模擬體在和突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的情況下，miR-155模擬體抑制作用顯著（P＜0.000 1）減弱，與野生型組相比減弱53.7%。以上結(jié)果初步表明miR-155可以靶向調(diào)控尼羅羅非魚SOCS5基因。

圖6 各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)Fig.6 Luciferase expression of cells after transfection in each group

2.7 miR-155對(duì)SOCS5表達(dá)量的影響

如圖7所示，與mimics NC 組相比，miR-155 mimics 極顯著（P＜0.000 1）的提高miR-155 表達(dá)量，升高5.24倍。與inhibitor相比，miR-155 inhibitor極顯著（P＜0.01）的抑制miR-155 的表達(dá)，降低2.05倍。

圖7 miR-155相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of miR-155

miR-155 mimics、mimics NC、miR-155 inhibitor、inhibitor NC 分別和SOCS5-WT-3＇UTR 共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)尼羅羅非魚SOCS5基因表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8 所示。與mimics NC組相比，miR-155 mimics組SOCS5的表達(dá)量極顯著（P＜0.001）下調(diào)，降低0.93 倍，表明miR-155 能顯著抑制尼羅羅非魚SOCS5基因的表達(dá)。而加入miR-155 inhibitor 后，SOCS5的表達(dá)量顯著（P＜0.05）上調(diào)，升高0.62倍，證明miR-155 inhibitor能抑制miR-155的表達(dá)，從而降低對(duì)SOCS5的調(diào)控作用。

圖8 SOCS5基因相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of SOCS5 gene

2.8 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 后尼羅羅非魚miR-155對(duì)SOCS5的調(diào)控作用

miR-155 mimics和miR-155 inhibitor以及SOCS5野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在6、12 h 時(shí)極顯著降低了miR-155 的表達(dá)量（P＜0.01），分別降低0.43 和0.64 倍，表明轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 后，能成功抑制miR-155 表達(dá)。而SOCS5表達(dá)量在6 h 時(shí)顯著上調(diào)（P＜0.05），12 h 時(shí)表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0.000 1），分別升高0.42和2.47倍（圖9）。

圖9 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor后尼羅羅非魚中miR-155和SOCS5基因相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression of miR-155 and SOCS5 genes in Oreochromis niloticus after miR-155 inhibitor transfection

3 討論

無乳鏈球菌感染羅非魚可以誘導(dǎo)大量炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致急性死亡從而增加致病性[19,20]，其中腦是無乳鏈球菌感染的一個(gè)重要靶器官，當(dāng)無乳鏈球菌感染細(xì)胞后，細(xì)胞的模式識(shí)別受體與病原體相關(guān)分子模式結(jié)合，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答[21,22]。因此本實(shí)驗(yàn)以TA-02 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚腦細(xì)胞誘發(fā)炎癥反應(yīng)的炎癥水平變化及miR-155靶向SOCS5基因參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。目前無乳鏈球菌感染羅非魚主要有兩種途徑：一種是通過在宿主血液中增殖后侵染其他組織引發(fā)病變；另一種是透過血-腦屏障，侵入羅非魚腦組織誘發(fā)腦膜炎，進(jìn)而引發(fā)一系列生理和病理變化[23,24]。本研究通過無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚腦星形膠質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-155 在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)上調(diào)，證明在清除無乳鏈球菌病原菌的免疫反應(yīng)中，miR-155 確實(shí)參與了尼羅羅非魚腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。同時(shí)在無乳鏈球菌誘導(dǎo)的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中，檢測(cè)到炎癥因子IL-1β、TNF-α的釋放，并且這兩種炎癥因子的表達(dá)模式與miR-155一致，其表達(dá)量都是隨著時(shí)間增加。這說明在應(yīng)對(duì)無乳鏈球菌入侵時(shí)，miR-155 是起到保護(hù)機(jī)體、對(duì)抗其入侵的作用。同時(shí)檢測(cè)到IL-10、TGF-β的表達(dá)量降低，這與陳秀慧等[25]關(guān)于子宮內(nèi)膜炎研究中對(duì)IL-10的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)論一致；另趙瑾[26]研究證明經(jīng)治療后的膝骨性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)TGF-β表達(dá)水平下調(diào)，說明IL-10、TGF-β的下調(diào)可以適量減輕炎癥反應(yīng)，使炎癥水平維持在一個(gè)適度范圍內(nèi)。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA主要通過與靶基因mRNA的3＇-UTR堿基互補(bǔ)配對(duì)，來阻礙靶基因mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)或?qū)е缕浣到猓磪⑴c基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控作用[27,28]。已有研究證明miR-155 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要調(diào)控作用[29,30]，廣泛參與炎癥反應(yīng)等多種生理活動(dòng)，因此對(duì)靶基因預(yù)測(cè)和相互作用關(guān)系掌握是了解miR-155參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的前提[31]。目前關(guān)于miR-155與SOCS5靶向關(guān)系的研究報(bào)道較少，石瑜等[32]通過實(shí)驗(yàn)證明miR-155-5p 靶向調(diào)控SOCS5促進(jìn)大鼠（Rattus norvegicus）腦缺血-再灌注損傷。本研究通過生物信息學(xué)方法成功預(yù)測(cè)尼羅羅非魚miR-155與SOCS5之間存在一個(gè)靶位點(diǎn)，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-155 能極顯著抑制SOCS5基因的表達(dá)，但突變結(jié)合位點(diǎn)后，miR-155 對(duì)SOCS5基因的抑制能力顯著減弱。這證明SOCS5是miR-155 的靶基因。將miR-155 mimics、mimics NC、miR-155 inhibitor、inhibitor NC 分別轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞過表達(dá)miR-155 后，檢測(cè)到SOCS5表達(dá)量與對(duì)照組相比下降0.93 倍，而敲降miR-155后，SOCS5表達(dá)量上調(diào)0.62倍，證明miR-155 能靶向調(diào)控SOCS5的表達(dá)，結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步說明miR-155可以通過與SOCS5基因3＇UTR特異性結(jié)合，從而抑制SOCS5基因表達(dá)。

SOCS5屬于免疫抑制分子家族（包括SOCS1-7和CIS），是由細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生并反饋性調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)傳遞過程的負(fù)調(diào)節(jié)因子[33]。SOCS 家族基因的異常表達(dá)與機(jī)體炎性疾病及惡行腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[34,35]，已有研究證明SOCS5在機(jī)體癌癥等疾病中發(fā)揮重要作用[36,37]，而癌癥發(fā)展早期都伴有炎癥反應(yīng)的發(fā)生，二者有潛在聯(lián)系，這提示未來SOCS5可能作為癌癥診斷和治療的切入點(diǎn)。陳景行等[15]發(fā)現(xiàn)SOCS5在小鼠氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究在無乳鏈球菌感染的TA-02細(xì)胞中檢測(cè)到SOCS5表達(dá)量升高，提示SOCS5參與了TA-02 細(xì)胞炎癥反應(yīng)，有研究表明，SOCS5是一種對(duì)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)通路有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的因子，能有效抑制炎癥因子表達(dá)[38]。這說明在信號(hào)通路中可能存在某種抑制SOCS5過度激活的機(jī)制，正是這種機(jī)制的協(xié)同作用，才避免在病原菌感染后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)初期，miR-155過度調(diào)控SOCS5表達(dá)，抑制抗炎因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致免疫失衡。本研究與廖寧馨[18]關(guān)于新生隱球菌（Filobasidiella bacillispora）介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中SOCS1的表達(dá)模式相同。

本研究通過轉(zhuǎn)染miR-155 的inhibitor 抑制尼羅羅非魚腦細(xì)胞中miR-155 的表達(dá)，觀察miR-155 對(duì)靶基因SOCS5的調(diào)控作用，在轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor后，成功抑制了miR-155 的表達(dá)，相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SOCS5表達(dá)量升高，說明在敲降miR-155 表達(dá)后能部分解除對(duì)靶基因SOCS5的抑制作用。miRNA 調(diào)控靶基因參與機(jī)體生命活動(dòng)是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，研究表明[39,40]，SOCS5是JAK-STAT 通路中起關(guān)鍵作用的負(fù)調(diào)控因子，而JAK-STAT 通路參與了多種與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的炎癥反應(yīng)，因此推測(cè)miR-155 可能通過調(diào)控SOCS5來調(diào)節(jié)下游JAKSTAT 信號(hào)通路。張琴和張賀[39,40]研究中關(guān)于SOCS5參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的報(bào)道與本研究中SOCS5的研究結(jié)果一致，這說明在無乳鏈球菌介導(dǎo)的TA-02 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的早期階段，正是由于miR-155 對(duì)SOCS5的這種負(fù)向調(diào)控機(jī)制，才將炎癥水平控制在在一個(gè)合理范圍內(nèi)，從而避免過度抑制炎癥因子產(chǎn)生使免疫系統(tǒng)損傷，不能有效清除病原體。

綜上所述，本研究證實(shí)miR-155 與靶基因SOCS5在無乳鏈球菌誘導(dǎo)的TA-02細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，且miR-155 負(fù)向調(diào)控SOCS5參與炎癥發(fā)應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。目前關(guān)于miRNA 與靶基因互作參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的研究多集中于哺乳動(dòng)物中[41,42]，在魚類中的對(duì)其調(diào)控機(jī)制的研究處于初級(jí)階段。但miR-155靶向調(diào)控SOCS5的蛋白表達(dá)機(jī)制及miR-155靶向SOCS5與相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)miR-155和SOCS5參與了無乳鏈球菌介導(dǎo)的TA-02細(xì)胞炎癥反應(yīng)。通過生物信息學(xué)方法獲得尼羅羅非魚miR-155和SOCS5基因的靶向結(jié)合位點(diǎn)，并成功構(gòu)建尼羅羅非魚SOCS5基因3＇-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因野生型和突變型載體，證明SOCS5基因是miR-155 直接作用的靶基因，且miR-155 結(jié)合于SOCS5基因的3＇-UTR 區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)SOCS5有直接抑制作用。通過敲降尼羅羅非魚miR-155 表達(dá)，證明miR-155 可以靶向負(fù)調(diào)控SOCS5表達(dá)，從而影響炎癥變化的發(fā)生發(fā)展。