不同來源木聚糖酶在模擬胃液和腸液中的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

■姚丹丹 錢宇英 石學(xué)剛

（1.杰能科(中國)生物工程有限公司，江蘇無錫 214028；2.丹尼斯克動(dòng)物營養(yǎng)，廣東廣州 510620）

由于小麥、黑麥和燕麥等谷物飼料中含有較高含量的抗?fàn)I養(yǎng)因子——阿拉伯木聚糖，因此，嚴(yán)重制約了這些谷物在動(dòng)物飼料中的使用。如何有效降低抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)的影響越來越受到人們的關(guān)注。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸意識(shí)到在小麥基礎(chǔ)飼糧中添加木聚糖酶，可有效降解飼料中的阿拉伯木聚糖，從而消除飼料原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的不利效應(yīng)[1-3]。通過補(bǔ)充外源的木聚糖酶，能夠有效改善飼料的利用效率，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。目前，小麥基礎(chǔ)飼糧中添加木聚糖酶已成為消除其抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能影響的常用方法[4]。然而，由于各種木聚糖酶來源不同，其生物學(xué)效價(jià)及穩(wěn)定性也存在很大差異。此外，酶制劑隨同食糜進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，還面臨著體內(nèi)蛋白酶的分解作用，因此，在選擇酶制劑時(shí)應(yīng)該綜合考慮各方面因素，選擇生物學(xué)效價(jià)高、穩(wěn)定性好的酶制劑，才能真正發(fā)揮酶制劑的生物學(xué)功效，從而有效改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)采用體外模擬胃腸道環(huán)境，研究不同來源木聚糖酶在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性，為木聚糖酶進(jìn)一步在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所選8種木聚糖酶產(chǎn)品均來自市售不同木聚糖酶廠家產(chǎn)品，實(shí)測(cè)酶活性見表1。

表1 8種不同來源木聚糖酶的酶活(U/g)

1.2 試驗(yàn)試劑

1.2.1 G-con溶液

2 mg/ml NaCl，用HCl調(diào)pH值至2.0。

1.2.2 I-con溶液

0.05 M KH2PO4，用NaOH調(diào)pH值至6.8。

1.2.3 模擬胃液SGF[5]

3.8 mg胃蛋白酶(Sigma P6887)加到5 ml G-con溶液中，用HCl調(diào)pH值至2.0。

1.2.4 模擬腸液SIF[5]

10 mg胰蛋白酶(Sigma P1750)加到1 ml I-con溶液中，用NaOH調(diào)pH值至6.8。

1.2.5 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液

溶解10.19 g的單水檸檬酸(國藥)和18.33 g的二水合磷酸氫二鈉(國藥)于1 000 ml蒸餾水中。測(cè)pH值，如果需要，調(diào)pH值至5.00。2～5℃儲(chǔ)存1個(gè)月。

另外，玻璃濾紙ADVANTEC（GA-55）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定重量(記下重量)的酶樣品，使其在加入50 ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液后的濾液濃度約為300 U/ml，加入50 ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌30 min后，用玻璃濾紙過濾得到濾液。

9.5 ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液與0.5 ml處理后的酶液混合，此時(shí)計(jì)為0 h，開始計(jì)時(shí)，在1、2、3 h取樣測(cè)定木聚糖酶酶活。

1.3.2 模擬胃液(SGF)對(duì)木聚糖酶酶活的影響

準(zhǔn)確稱取一定重量(記下重量)的酶樣品，使其在加入50 ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液后的濾液濃度約為300 U/ml，加入50 ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌30 min后，用玻璃濾紙過濾得到濾液。

9.5 ml SGF與0.5 ml處理后的酶液混合[6]，此時(shí)計(jì)為0 h，開始計(jì)時(shí)，在1、2、3 h取樣測(cè)定木聚糖酶酶活。

1.3.3 模擬腸液(SIF)對(duì)木聚糖酶酶活的影響

準(zhǔn)確稱取一定重量(記下重量)的酶樣品，使其在加入50 ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液后的濾液濃度約為300 U/ml，加入50 ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌30 min后，用玻璃濾紙過濾得到濾液。

9.5 ml SIF與0.5 ml處理后的酶液混合[6]，此時(shí)計(jì)為0 h，開始計(jì)時(shí)，在1、2、3 h取樣測(cè)定木聚糖酶酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖液(Buffer)對(duì)木聚糖酶活性的影響(見圖1)

飼用木聚糖酶作為一種生物催化活性蛋白，其酶活性會(huì)受到環(huán)境pH值的影響。這主要是由于酶的催化活性依賴于其質(zhì)子移變基因在酶的活性位點(diǎn)上產(chǎn)生的靜電荷數(shù)量；同時(shí)，pH值可以通過影響酶活性中心某些必須基團(tuán)、輔酶及底物的解離狀態(tài)以及水解反應(yīng)過程中中間絡(luò)合物的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶活性部位與底物結(jié)合或催化的效率，抑制酶解產(chǎn)物的生成。只有當(dāng)木聚糖酶的酶學(xué)特性（如溫度、pH值等）與動(dòng)物胃腸道生理特點(diǎn)相吻合時(shí)，才能充分發(fā)揮其催化活性。一般來講，畜禽胃腸道前段主要呈偏酸性，后段則呈偏中性的環(huán)境；同時(shí)添加于飼料中的木聚糖酶在動(dòng)物胃腸道內(nèi)的生物催化作用是一個(gè)連續(xù)的過程，隨著食糜向腸道后段的推移，其酶解作用的環(huán)境或條件（如：pH值、底物濃度及內(nèi)源性蛋白酶等）均不斷發(fā)生變化。其次，溫度對(duì)酶蛋白的影響比較大，選擇適宜的試驗(yàn)測(cè)定溫度是必要的。在選擇體外評(píng)估木聚糖酶的生物學(xué)功效時(shí)，其所選的處理溫度應(yīng)接近動(dòng)物的體溫[7]，因此，本試驗(yàn)選擇37℃的溫度條件下進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果表明，酶Ⅰ在緩沖液中的存留率最低，為85%，其余7種酶活均比較穩(wěn)定，存留率均在90%以上。由此可見，在37℃條件下，在本試驗(yàn)中溫度對(duì)8種木聚糖酶的活性影響不大。

圖1 3 h內(nèi)Buffer對(duì)8種酶存留率的影響(37℃恒溫)

2.2 模擬胃液（SGF）對(duì)木聚糖酶酶活的影響（見圖2）

圖2 3 h內(nèi)SGF對(duì)8種酶存留率的影響(37℃恒溫)

由于動(dòng)物胃內(nèi)的pH值較低，約為2.5左右,過酸的pH值環(huán)境會(huì)明顯降低酶的活性，且這種活性損失是不可逆的，因此酶在經(jīng)過胃內(nèi)酸性環(huán)境的作用下，其酶活性會(huì)有較大損失，從而影響了其在后腸道內(nèi)的繼續(xù)酶解作用；在選擇酶制劑時(shí)，要選擇的木聚糖酶對(duì)酸性環(huán)境一定要有較好的耐受性，在經(jīng)過胃到達(dá)后腸道時(shí)，其仍具有良好的生物催化活性。除此之外，酶本身也是一種蛋白質(zhì)，添加于飼料中的木聚糖酶在隨著食糜一起經(jīng)過動(dòng)物的胃腸道時(shí)，體內(nèi)胃蛋白酶水解作用可能會(huì)破壞木聚糖酶的活性。同時(shí)，不同來源的木聚糖酶對(duì)蛋白酶的抵抗力也有一定的差異。因此，飼用木聚糖酶對(duì)胃蛋白酶的耐受性也是評(píng)價(jià)其飼用價(jià)值的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在模擬胃液(SGF)中，酶Ⅰ中木聚糖酶的活性影響最大，酶活存留率最低，僅為4%，酶活基本完全損失；在胃內(nèi)酶活存留率最高的為酶Ⅳ、酶Ⅶ和酶Ⅷ。由此可見，酶Ⅳ、酶Ⅶ和酶Ⅷ對(duì)酸性環(huán)境和胃蛋白酶具有較高的耐受性，在胃環(huán)境中能夠保持很高的活性，在經(jīng)過胃內(nèi)酸性的消化階段到達(dá)后腸道時(shí)，仍具有良好的生物催化活性。

2.3 模擬腸液(SIF)對(duì)木聚糖酶酶活的影響(見圖3)

圖3 3 h內(nèi)SIF對(duì)8種酶存留率的影響(37℃恒溫)

隨著食糜向腸道后段的推移，其酶解作用的環(huán)境條件也隨之發(fā)生變化，動(dòng)物小腸中的pH值約為7.5左右，隨同食糜一起進(jìn)入腸道中的酶不但要面臨酸度的變化，而且還要面臨蛋白酶的降解作用。因此，所選的酶制劑一定要能夠耐受pH值變化和蛋白酶的降解作用，才能使酶制劑在動(dòng)物胃腸道中保持較高的活性，發(fā)揮其功效。本試驗(yàn)用體外法模擬動(dòng)物腸道中的環(huán)境，研究模擬腸液對(duì)不同來源木聚糖酶的影響。結(jié)果表明，在37℃溫度條件下，在模擬腸液中酶Ⅳ的耐受性最差，經(jīng)過3 h處理后，酶活存留率僅為44%，酶Ⅰ的耐受性最好，存留率高達(dá)99%，酶活基本沒有損失。由此可見，不同來源木聚糖酶對(duì)模擬腸液的耐受性不同。這可能是由于腸液中pH值和蛋白酶的影響所致，腸液中環(huán)境的變化，嚴(yán)重影響了酶制劑的生物學(xué)功效，因此，在動(dòng)物飼料中選擇使用酶制劑時(shí)應(yīng)該綜合考慮各項(xiàng)指標(biāo)，確保酶制劑能夠真正發(fā)揮其生物學(xué)功效，有效降解底物，改善營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。

3 結(jié)論

在模擬胃液中，耐受性最好的是酶Ⅳ、酶Ⅶ和酶Ⅷ，耐受性最差的為酶Ⅰ；在模擬腸液中，耐受性最好的是酶Ⅰ，耐受性最差的為酶Ⅳ。

酶Ⅲ的初始酶活最高為26 318 U/g,但在模擬胃液中和腸液中的存留率分別為32%和84%，均不是最高，由此可見木聚糖酶的耐受性與自身的酶活大小不成正比。