焦錦彪　黃雷　林鋒　姚嘉赟　袁雪梅　蘇勝齊　張海琪

摘要：為探究中華鱉（Pelodiscus sinensis）循環(huán)水養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)體表穿孔和潰瘍的病因，對(duì)患病中華鱉的肝、脾、肺和腎等部位取樣并進(jìn)行病原菌分離及革蘭氏染色，利用16S rRNA測(cè)序和生化鑒定相結(jié)合進(jìn)行細(xì)菌鑒定，通過毒力基因PCR檢測(cè)和人工回感試驗(yàn)評(píng)估細(xì)菌的致病性，以紙片擴(kuò)散法評(píng)估幾種抗生素的抑菌效果，利用瓊脂打孔法評(píng)估中藥提取物的抑菌效果。結(jié)果顯示，從病鱉的臟器中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌AH0421，該菌為革蘭氏陰性菌，菌體呈短桿狀；菌株AH0421與嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）模式菌株 ATCC 7966的16S rRNA序列相似性高達(dá)99.66%。菌株AH0421能利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，具有O/129耐受性，其攜帶act、aerA、aha、ahh、ahp、ahpA、alt、ast、hlyA、lip、ompA毒力基因。回感試驗(yàn)出現(xiàn)與自然發(fā)病相似病癥，菌株AH0421半致死濃度（LC50）為1.7×106 CFU/mL。中藥五味子提取物、諾氟沙星、多西環(huán)素、恩諾沙星、新霉素以及頭孢克肟、頭孢曲松等頭孢類抗生素對(duì)該菌有較強(qiáng)的抑制作用。研究表明，五味子和多數(shù)頭孢類抗生素可作為治療菌株AH0421感染的參考藥物。

關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌；中華鱉；中草藥；抗生素；循環(huán)水養(yǎng)殖

中圖分類號(hào)：S947.1+2? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：1674-3075（2023）03-0136-08

中華鱉（Pelodiscus sinensis）是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，各類疾病頻頻暴發(fā)，已嚴(yán)重阻礙中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是對(duì)中華鱉養(yǎng)殖危害最大的細(xì)菌性病原之一，可引發(fā)穿孔病、腐皮病等，主要表現(xiàn)為背腹部穿孔、皮膚糜爛、肝臟充血等癥狀，具有傳染性強(qiáng)、死亡率高的特點(diǎn)（鄭杰夫等，2016）；嗜水氣單胞菌的致病性與毒力因子有關(guān)，主要包括外毒素、外膜蛋白、胞外蛋白酶、脂多糖等（Nhinh et al，2021）。嗜水氣單胞菌的外毒素普遍具有溶血性、細(xì)胞毒性及腸毒性，會(huì)破壞水生動(dòng)物呼吸和消化器官等組織，造成機(jī)體抵抗力下降，從而導(dǎo)致肌體出現(xiàn)出血性敗血癥等疾病，進(jìn)而造成其死亡（殷海成，2007）。

在養(yǎng)殖過程中，中華鱉嗜水氣單胞菌源疾病的防控主要以施用抗生素和消毒劑為主。朱凝瑜等（2017）對(duì)10株分離自患病中華鱉的嗜水氣單胞菌進(jìn)行了耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)新霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星等對(duì)嗜水氣單胞菌均具有較強(qiáng)抑制作用。中草藥因其具有毒副作用小、殘留少的特點(diǎn)，被廣泛用于增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能以及嗜水氣單胞菌感染等防治（曹麗萍等，2011）。He等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加100 mg/kg的梔子苷可顯著增強(qiáng)鯽的血清溶菌酶活性，并能提高其在嗜水氣單胞菌感染下的存活率；黃東宇（2019）將白藜蘆醇、姜黃素和黃芩多糖進(jìn)行配伍，可顯著提高嗜水氣單胞菌感染下異育銀鯽的抗氧化能力和存活率。目前，中藥主要用在魚病防治中，鮮有用于抗鱉源嗜水氣單胞菌的報(bào)道。

室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)具有產(chǎn)量高、污染少等特點(diǎn)，近年來在名優(yōu)水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的應(yīng)用日趨廣泛（李紅艷等，2020）。由于循環(huán)水養(yǎng)殖集約化程度高，養(yǎng)殖病害問題也愈發(fā)突出。因此，建立針對(duì)該系統(tǒng)下的病原鑒定技術(shù)和病害防控方法顯得尤為重要。2021年5月，浙江省湖州市某循環(huán)水養(yǎng)殖場(chǎng)的中華鱉出現(xiàn)體表穿孔、潰爛等癥狀并伴隨大規(guī)模死亡，隨即采集了病鱉樣品進(jìn)行病原菌分離、鑒定和毒力因子檢測(cè)，通過回感試驗(yàn)確定病原菌的致病性，最后篩選出多種對(duì)病原有體外抑制作用的抗生素藥物和中草藥，以期為該病的診斷與治療提供參考依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

患病和健康中華鱉均取自浙江省湖州市某中華鱉循環(huán)水養(yǎng)殖場(chǎng)?；疾€(gè)體（約250 g/只）具有體表潰爛和背腹部穿孔等癥狀；健康個(gè)體（約200 g/只）活力、攝食正常，經(jīng)檢測(cè)無腮腺炎病毒、黃病毒、虹彩病毒等常見病毒感染，取內(nèi)臟組織研磨后涂布未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染。

TSA、TSB培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，PCR試劑盒購(gòu)自New England Biolab公司。試驗(yàn)涉及引物的合成及細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序由蘇州金唯智公司完成，藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，中草藥購(gòu)自杭州華東中藥飲片有限公司。

1.2? ?細(xì)菌分離與鏡檢

觀察和記錄患病中華鱉的體表癥狀。剖檢病鱉，觀察內(nèi)臟器官病變情況，包括肝臟、脾臟、腎臟、腸道等，并拍照記錄。在無菌條件下解剖患病中華鱉，獲取肝、脾、肺、腎等病灶組織。部分組織進(jìn)行核酸提取，用于腮腺炎病毒、黃病毒、虹彩病毒等常規(guī)檢測(cè)；另取部分組織分別研磨后，劃線接種于TSA平板，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌落劃線接種于TSA平板，進(jìn)行菌種純化培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。參照張嫻（2014）的方法對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下放大1 000倍鏡檢。

1.3? ?細(xì)菌鑒定

1.3.1? ?16S rRNA基因擴(kuò)增與測(cè)序? 用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取分離細(xì)菌的DNA，通過NanoDrop 2000檢測(cè)DNA濃度及純度。采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增（表1）。設(shè)置25 μL的PCR反應(yīng)體系，包括Taq Master Mix （2×） 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL，正反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智公司測(cè)序，下機(jī)序列輸入EZbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行序列比對(duì)以獲得物種分類信息；用MEGA7.0軟件的鄰接法（neighbor-joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2? ?生理生化鑒定? ?取試驗(yàn)純化后的分離菌，利用梅里埃全自動(dòng)鑒定儀VITEK進(jìn)行生化反應(yīng)，包括葡萄糖發(fā)酵，麥芽糖、蔗糖、甘露醇和檸檬酸鹽利用以及O/129耐受等指標(biāo)。鑒定依據(jù)參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（布坎南，1984；東秀珠和蔡妙英，2001）。陽(yáng)性菌株參考何亮銀等（2022）從大黃魚所分離的嗜水氣單胞菌菌株NDLc-P。

1.4? ?毒力基因檢測(cè)

以細(xì)菌基因組DNA為模板，參照1.3.1中的PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，稍作調(diào)整后，對(duì)分離菌的11種毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增（表1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

1.5? ?回感試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)不同濃度的細(xì)菌攻毒組以及1個(gè)未攻毒對(duì)照組，每個(gè)養(yǎng)殖缸隨機(jī)放入10只健康中華鱉。將待測(cè)菌在30 ℃下培養(yǎng)12 h（濃度為6.8×109 CFU/mL），5 000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌磷酸緩沖液（PBS）洗滌3次并重懸菌液，之后用PBS進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋，得到用于攻毒的4個(gè)菌懸液濃度（6.8×107、6.8×106、6.8×105、6.8×104 CFU/mL）。攻毒組每只鱉腹腔注射0.2 mL相應(yīng)濃度的菌懸液，對(duì)照組注射等量的PBS。連續(xù)2周觀察中華鱉的體表癥狀、活力等，記錄死亡情況，用改良寇氏法（刁菁等，2018）計(jì)算半致死濃度（LC50）。選擇活力減弱、四肢無力、浮于水面的瀕死中華鱉進(jìn)行解剖，觀察內(nèi)臟器官的病變情況，并分離鑒定其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

1.6? ?藥敏試驗(yàn)

采用瓊脂紙片擴(kuò)散法測(cè)定各類抗生素藥物的抗菌活性，具體步驟如下：取100 μL培養(yǎng)12 h的菌液（約6×109 CFU/mL）均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，用無菌鑷子夾取14種常用藥敏紙片貼在含有菌液的培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.7? ?抑菌中草藥篩選

1.7.1? ?中草藥活性物提取? ?稱取金銀花、黃芩、連翹、大黃、五味子粉末各5 g，以6：100加入75%乙醇，55 ℃水浴孵育過夜，4 000 r/min離心10 min后取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去乙醇后定容至10 mL，即獲得濃度為500 mg/mL的中藥提取物母液。

1.7.2? ?抑菌試驗(yàn)? ?參考向雙云等（2016）的瓊脂平板打孔法，在無菌操作臺(tái)中，將100 μL培養(yǎng)12 h的菌液均勻涂布于TSA平板上，用7 mm直徑打孔器在平板上打孔，分別吸取等量的不同藥物提取液加于孔內(nèi)，正置平板至藥液完全吸收后倒置培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；同樣，將有效藥物按2倍梯度稀釋至不同濃度（500、250、125、62.5、31.25 mg/mL）后加于孔內(nèi)，培養(yǎng)12 h后記錄抑菌圈直徑。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?自然患病的中華鱉癥狀

自然患病中華鱉個(gè)體背腹甲存在白斑和孔洞，背部出現(xiàn)潰爛，腹腔內(nèi)有血性腹水，內(nèi)臟均有明顯的出血或充血，其中肝臟有明顯的充血癥狀，充血點(diǎn)呈花斑狀，腸道粘膜充血無彈性（圖 1）。

2.2? ?優(yōu)勢(shì)細(xì)菌形態(tài)特征

病毒檢測(cè)顯示，腮腺炎病毒、黃病毒、虹彩病毒在病鱉組織中均為陰性，因此懷疑可能是細(xì)菌感染。從肝、脾、肺、腎中分離到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌落形態(tài)一致，呈圓形、米白色半透明狀，表面光滑濕潤(rùn)，直徑1～2 mm（圖 2-A）；進(jìn)一步將優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性菌，呈兩端鈍圓的短桿狀，大多單個(gè)排列，少有雙個(gè)排列（圖 2-B），將該株菌命名為AH0421。

2.3? ?細(xì)菌鑒定

2.3.1? ?16S rRNA基因? ?菌株AH0421的16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 500 bp，與EZbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的Aeromonas hydrophila ATCC 7966（CP000462）序列相似性最高，達(dá)到99.66%；系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，菌株AH0421與Aeromonas hydrophila ATCC 7966聚為同一分支（圖 3）。

2.3.2? ?生理生化特征? ?生理生化鑒定結(jié)果顯示，該分離菌能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇，可利用檸檬酸鹽，并具有O/129耐受性，而L-阿拉伯醇、H2S產(chǎn)生、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶等指標(biāo)顯示為陰性（表 2）。AH0421的生理生化特征與大黃魚源嗜水氣單胞菌參考菌株NDLc-P（何亮銀等，2022）基本一致。

2.4? ?毒力基因鑒定

毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，act、aerA、aha、ahh、ahp、ahpA、alt、ast、hlyA、lip和ompA的毒力基因擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性，其中ompA擴(kuò)增出的條帶較弱（圖 4）。

2.5? ?分離菌的致病性

人工感染發(fā)病的中華鱉活力減弱并出現(xiàn)死亡，解剖后可見明顯腹水，肝臟和腸道均存在充血，腸道韌性較差，與自然發(fā)病的病癥一致（結(jié)果未展示）。從人工感染死亡的中華鱉臟器中再次分離到優(yōu)勢(shì)菌，其菌落形態(tài)以及16S rRNA基因序列信息與AH0421一致。中華鱉的死亡率與細(xì)菌攻毒濃度呈正相關(guān)，其中6.8×107 CFU/mL濃度感染組的死亡率為100%，6.8×106、6.8×105和6.8×104 CFU/mL濃度感染組的死亡率分別為70%、30%和10%，對(duì)照組無死亡（圖5）?；诟牧伎苁戏ㄓ?jì)算得出該菌對(duì)中華鱉的半致死濃度（LC50）為1.7×106 CFU/mL。

2.6? ?藥敏試驗(yàn)

菌株AH0421對(duì)頭孢克肟、頭孢曲松、拉氧頭孢、頭孢哌酮和頭孢西丁等頭孢類抗生素以及諾氟沙星、多西環(huán)素、恩諾沙星、新霉素等高度敏感，對(duì)氟苯尼考中度敏感，對(duì)頭孢氨芐、新生霉素、復(fù)方新諾明、利福平表現(xiàn)出耐藥性（表 3）。

2.7? ?中草藥抑菌效果

中草藥提取物的體外抑菌試驗(yàn)顯示，金銀花、連翹、大黃、黃芩4種中草藥的提取物對(duì)該菌株AH0421無明顯抑制作用（圖 6-A）；五味子提取物對(duì)菌株AH0421具有明顯抑制作用，其最小抑菌濃度（MIC）為62.5 mg/mL（圖 6-B）。

3? ?討論

3.1? ?藥敏與回感試驗(yàn)證實(shí)AH0421為嗜水氣單胞菌

嗜水氣單胞菌可通過消化道感染并引發(fā)人類食物中毒、腸胃炎和感染性腹瀉等病癥（Yamauchi et al，2021；Yuwono et al，2021），也能引發(fā)魚類、蛙類、鱉等多種水生動(dòng)物出現(xiàn)細(xì)菌性敗血癥（王貴平等，1999；Huys et al，2003）。本研究從患病中華鱉中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌AH0421，經(jīng)16S rRNA序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌與Aeromonas hydrophila ATCC 7966相似度最高，初步判定為嗜水氣單胞菌。菌株AH0421可利用D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-甘露糖、D-甘露醇和蔗糖，β-半乳糖苷酶和ELLMAN呈陽(yáng)性，這與何亮銀等（2022）分離的大黃魚源嗜水氣單胞菌NDLc-P的生化特征基本一致，進(jìn)一步說明菌株AH0421可能是嗜水氣單胞菌。根據(jù)以往的研究報(bào)道，嗜水氣單胞菌感染中華鱉主要表現(xiàn)為背腹部出現(xiàn)瘡痂及孔洞、肝臟充血腫大（杜愛芳和蔡渭明，2000）以及體表皮膚糜爛壞死等癥狀（吳惠仙和楊志堅(jiān)，2006）。這與本研究中自然患病的中華鱉癥狀一致，同時(shí)回感試驗(yàn)也得到了相似癥狀，這些結(jié)果表明此輪病害是由嗜水氣單胞菌所引起。

3.2? ?菌株AH0421對(duì)水生動(dòng)物的毒力效應(yīng)

在人工感染試驗(yàn)中，菌株AH0421對(duì)中華鱉的半致死量為1.7×106 CFU/kg，低于之前的多項(xiàng)報(bào)道（徐先棟等，2016；左洋洋等，2019），說明菌株AH0421對(duì)中華鱉的毒力較強(qiáng)。本研究中，嗜水氣單胞菌AH0421攜帶act、aerA、aha、ahh、ahp、ahpA、alt、ast、hlyA、lip、ompA毒力基因，多于以往鱉源嗜水氣單胞菌所攜帶的毒力基因數(shù)量（黃鈞等，2013）。aerA、ahpA、hlyA、act、alt等基因被認(rèn)為是嗜水氣單胞菌毒力強(qiáng)的重要指標(biāo)。朱大玲等（2006）發(fā)現(xiàn)對(duì)鯽致病力強(qiáng)的嗜水氣單胞菌菌株均表現(xiàn)為aerA、hlyA、ahpA基因陽(yáng)性；陳婷婷（2014）研究也表明，嗜水氣單胞菌對(duì)團(tuán)頭魴的致病力與aerA、ahpA和hlyA等毒力基因存在顯著相關(guān)性；劉杰等（2015）研究認(rèn)為包含hly和act 4種以上毒力基因的嗜水氣單胞菌為黃沙鱉的高致病性菌株。據(jù)報(bào)道，氣溶素aer可破壞宿主細(xì)胞的膜通透性屏障，導(dǎo)致細(xì)胞死亡（Dong et al，2021）；溶血素hly可通過插入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層并產(chǎn)生跨膜孔進(jìn)而破壞細(xì)胞膜（Bhakdi et al，1986）；act具有溶血功能，其可在紅細(xì)胞細(xì)胞膜上形成孔洞導(dǎo)致裂解（Tomás，2012）。在本研究中，嗜水氣單胞菌AH0421感染中華鱉也出現(xiàn)了血性腹水、肝臟和腸道充血等癥狀，這與aer、hly和act的致病作用相吻合，說明菌株攜帶的這些毒力基因可能發(fā)揮了致病作用。

3.3? ?抗生素類可用于中華鱉嗜水氣單胞菌病治療

抗生素是中華鱉中最常用的病害防治藥物，對(duì)嗜水氣單胞菌病具有良好的作用效果。在體外抑菌試驗(yàn)中，冷闖等（2012）認(rèn)為中華鱉肝臟中分離的嗜水氣單胞菌LCDJYC01對(duì)頭孢曲松高度敏感，而對(duì)利福平表現(xiàn)出耐藥性；林鋒等（2014）從中華鱉肺部分離到的菌株對(duì)頭孢西丁敏感，但對(duì)復(fù)方新諾明產(chǎn)生耐藥性；本研究發(fā)現(xiàn)頭孢曲松和頭孢西丁對(duì)嗜水氣單胞菌AH0421具有抑制性，而利福平和復(fù)方新諾明則無抑制效果，與上述研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌AH0421也對(duì)恩諾沙星、多西環(huán)素、頭孢克肟、新霉素、諾氟沙星高度敏感，這與異育銀鯽（張熒熒等，2020）、鯽（高東民等，2017）中分離的嗜水氣單胞菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致。在中華鱉的體內(nèi)藥物試驗(yàn)方面，王高學(xué)和王英珍（1998）通過腹腔注射硫酸慶大霉素、硫酸丁胺卡那霉素和復(fù)方諾氟沙星，對(duì)嗜水氣單胞菌引起的穿孔病起到良好的治療效果。這些研究進(jìn)一步說明，抗生素藥物可用于中華鱉嗜水氣單胞菌病的治療。本研究藥敏試驗(yàn)中涉及到水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥，僅限用于試驗(yàn)室水平對(duì)細(xì)菌的耐藥性研究，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格依照法律法規(guī)選擇合適藥物并科學(xué)用藥。

3.4? ?五味子是治療嗜水氣單胞菌的綠色候選藥物

由于抗生素藥物存在藥物殘留、耐藥性等問題，尋求綠色安全的抗生素替代藥物勢(shì)在必行。中草藥作為一種天然來源的藥物，具有毒副作用小、無抗藥性的特點(diǎn)，已被廣泛用于水產(chǎn)病害的防治中（張平，2020）。在體外試驗(yàn)中，喻運(yùn)珍等（1999）研究認(rèn)為鱉源嗜水氣單胞菌對(duì)五味子高度敏感；張文青等（2012）也發(fā)現(xiàn)五味子對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)生體外抑制作用，并且與兒茶、五倍子、烏梅配伍的作用效果更好。在體內(nèi)試驗(yàn)中，Wang等（2016）研究認(rèn)為飼喂五味子多糖可顯著提高鯽抵抗嗜水氣單胞菌的能力。與這些研究結(jié)果一致，本研究同樣發(fā)現(xiàn)五味子的乙醇提取物對(duì)嗜水氣單胞菌具有明顯的抑制效果；除抗病功能外，五味子還能增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，改善動(dòng)物腸道菌群的平衡（徐良梅等，2008；路晶晶等，2018）。這些研究均表明，五味子可作為水產(chǎn)動(dòng)物嗜水氣單胞菌病治療的綠色候選藥物。

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（責(zé)任編輯? ?萬月華）

Identification and Antibiotic Susceptibility Test of Hypervirulent Aeromonas

hydrophila in a Recirculating Aquaculture System

JIAO Jin‐biao1，2， HUANG Lei2， LIN Feng2， YAO Jia‐yun2， YUAN Xue‐mei2， SU Sheng‐qi1， ZHANG Hai‐qi2

（1. Conservation and Research Center for Aquatic Biodiversity in the Upper Reaches of Yangtze River，

Research Center of Fishery Resources and Environment， College of Fisheries，

Southwest University， Chongqing? ?400715， P. R. China;

2. Agriculture Ministry Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture，

Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province，

Key Laboratory of Fishery Environment and Aquatic Product Quality and Safety of Huzhou City，

Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries， Huzhou? ?313001， P. R. China）

Abstract：In May 2021， serious mortality of cultured Pelodiscus sinensis （Chinese softshell turtle） occurred in a recirculating aquaculture farm in Huzhou， Zhejiang Province and the infected turtles presented symptoms of perforations and ulcers. To identify the pathogen infecting the turtles and find effective inspection and prevention strategies for the disease， the dominant pathogenic strain was isolated from the liver， spleen， lung and kidney of diseased P. sinensis and labeled the AH0421 strain. Bacterial identification of the AH0421 strain was accomplished through gram staining， 16S rRNA sequencing and determination of the virulence factor， as well as morphological， physiological and biochemical characteristics. The AH0421 strain is rod-shaped and gram-negative， and phylogenetic tree analysis， based on 16S rRNA gene sequences， shows that the AH0421 strain clusters with a strain of Aeromonas hydrophila ATCC 7966 with homology of 99.66%. The AH0421 strain can utilize glucose， sucrose， and maltose and has O/129 tolerance. According to PCR amplification， the AH0421 strain possesses 11 virulence genes， including act， aerA， aha， ahh， ahp， ahpA， alt， ast， hlyA， lip， and ompA. Simultaneously， an artificial infection study was carried out on healthy P. sinensis by injecting different concentrations of a bacterial suspension of the AH0421 strain identified as A. hydrophila.? P. sinensis （body mass， ～200 g） were randomly assigned to four treatment groups （6.8×107， 6.8×106， 6.8×105 and 6.8×104 CFU/mL） and a control group， with 10 P. sinensis in each group. The symptoms of the artificially infected turtles were identical to those of naturally infected turtles， and the concentration of strain AH0421 that was lethal for half of the test turtles （LC50） was 1.7×106 CFU/mL. Drug susceptibility of the AH0421 strain was tested by the paper extension and agar punch methods using antibiotics and Chinese herbal medicines. The results show that the A. hydrophila strain is highly sensitive to the antibiotics norfloxacin， doxycycline， enrofloxacin， neomycin， cephalosporin， cefixime and ceftriaxone， and to the extract of Schisandra chinensis. In conclusion， A. hydrophila （AH0421） was the pathogen responsible for the mortality observed in the P. sinensis recirculating aquaculture system and cephalosporin antibiotics can be considered as therapeutic agents for the treatment of P. sinensis infected with A. hydrophila.

Key words：Aeromonas hydrophila; Pelodiscus sinensis; Chinese herbal medicine; antibiotic; recirculating aquaculture

收稿日期：2021-10-04? ? ?修回日期：2023-02-02

基金項(xiàng)目：浙江省“十四五”育種專項(xiàng)水產(chǎn)協(xié)作組項(xiàng)目（編號(hào)：2021C02069）；浙江省“三農(nóng)六方”科技協(xié)作計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2021SNLF026）。

作者簡(jiǎn)介：焦錦彪，1998年生，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物病害防治。E-mail：jiaojinb@126.com

通信作者：張海琪，1977年生，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事水產(chǎn)育種和病害防治教研工作。E-mail：zmk407@126.com