中草藥抑制及殺滅水產(chǎn)病原維氏氣單胞菌效果研究

陳安婷，張紫瑞，姜群，張曉君，王春波，高曉建*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇甲客行蟹業(yè)有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225116）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）隸屬于氣單胞菌科（Aeromonadaceae），氣單胞菌屬（Aeromonas），是一種人-獸-魚共患的革蘭陰性兼性厭氧桿菌[1]。該菌廣泛存在于海水、淡水、污水、土壤和動(dòng)物消化系統(tǒng)等環(huán)境中，對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性[2]。近年來，維氏氣單胞菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物危害日益嚴(yán)重，并且死亡率高，可感染大口黑鱸（Micropterus salmoides）[3]、斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）[4]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[5]、羅非魚（Oreochromis niloticus）[6]、異育銀鯽（Carassius gibelio）[7]、河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）等魚類[8]，也可感染羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[9]、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[10]、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）[11]、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）等甲殼類[12]，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

目前，對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病大多采用抗生素進(jìn)行治療，雖然見效快，但其不易降解，會(huì)殘留在水生動(dòng)物和環(huán)境中，造成環(huán)境污染，并且威脅人類健康[12]。此外，濫用抗生素，還會(huì)造成多重耐藥菌株和耐藥基因的產(chǎn)生與傳播，給病害防控造成極大困難[13]。以抗生素為主的防控措施，已不符合水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展的要求，亟需開發(fā)綠色、安全、有效的抗生素替代生物制劑。

中草藥在預(yù)防和治療動(dòng)物疾病過程中發(fā)揮了重要作用，具有成本低、副作用小、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，是抗生素理想的替代品[14]。諸多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中草藥對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原具有不同程度的抑殺效果[15-18]。文獻(xiàn)[19-20]研究發(fā)現(xiàn)，中草藥含有多糖、有機(jī)酸類、生物堿、鞣質(zhì)等多種活性物質(zhì)，能夠激活動(dòng)物機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)，從而提高其機(jī)體免疫力與抗病力。目前中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治方面也有較多報(bào)道，在抵抗病原微生物以及增強(qiáng)魚、蝦、蟹等水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能方面發(fā)揮了重要作用[21]?，F(xiàn)選取42 種具有廣譜抗菌活性的中草藥，評(píng)價(jià)其水浸液對(duì)羅氏沼蝦病原維氏氣單胞菌的抑殺效果，以期篩選出對(duì)其抑制作用較好的中草藥，為防治維氏氣單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從患病羅氏沼蝦體內(nèi)分離出菌株維氏氣單胞菌JDM1-1（16S rRNA 登錄號(hào)：ON365878），由實(shí)驗(yàn)室保存。

供試中草藥有黃芪（Astragalus membranaceus）、石榴皮（Punica granatum）、黃柏（Phellodendri chinensis cortex）、五倍子（Rhus chinensis）、苦地?。–orydalis bungeana）、仙鶴草（Agrimonia pilosa）、烏梅（Armeniaca mume Sieb.）、地榆（Sanguisorba officinalis）、鹿含草（Pyrola calliantha）、大黃（Rheum palmatum）、老鶴草（Geranium wilfordii）、佩蘭（Eupatorium fortunei Turcz）、萹蓄（Polygonum aviculare）、紅藤（Sargentodoxa cuneata）、艾葉（Artemisia argyi）、仙茅（Rhizoma Curculiginis）、紫蘇（Perilla frutescens）、番瀉葉（Senna alexandrina）、山楂（Crataegus pinnatifida）、玫瑰花（Rosa rugosa）、訶子（Terminalia chebula）、板藍(lán)根（Radix isatidis）、木瓜（Carica papaya）、重樓（Paridis Rhizoma）、黨參（Codonopsis pilosula）、金銀花（Lonicera japonica）、天南星（Arisaema heterophyllum）、法半夏（Rhizoma Pinelliae）、秦皮（Fraxini cortex）、青蒿（Artemisia caruifolia）、青黛（Indigo naturalis）、野菊花（Chrysanthemum indicum）、海金沙（Lygodium japonicum）、合歡皮（Albiziae Cortex）、小薊（Cirsium arvense var. integrifolium）、金櫻子（Rosa laevigata）、鉤藤（Uncaria rhynchophylla）、白頭翁（Pulsatilla chinensis）、赤芍（Paeoniae radix rubra）、白芍（Cynanchum otophyllum）、車前子（Plantago asiatica）、女貞子（Ligustrum lucidum）共42 種中草藥，購于揚(yáng)州市同仁堂藥房。

1.2 藥液的制備

稱取上述中草藥各50 g，于500 mL 蒸餾水中浸泡30 min 后煎煮，煮沸后轉(zhuǎn)小火煎60 min，用4層紗布過濾并收集濾液；剩余藥渣采用上述步驟重復(fù)煎煮，收集濾液；將2 次濾液合并濃縮至50 mL，即中草藥初始濃度為1 000 g/L；最后將中草藥水浸液121 ℃滅菌20 min，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹22]。

1.3 菌懸液的制備

將供試菌株維氏氣單胞菌JDM1-1 接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，用無菌生理鹽水稀釋至1×107cfu/mL，制成菌懸液。

1.4 藥物體外抑菌試驗(yàn)

采取瓊脂打孔法，測(cè)定中草藥對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 體外抑菌活性。取菌懸液100 μL（1×107cfu/mL），均勻涂布于LB 固體平板上，待菌液晾干后，用直徑6 mm 的滅菌打孔器于平板上均勻打3 個(gè)孔，每孔加入1 000 g/L 中草藥水浸液30 μL，并于4 ℃靜置30 min，使中草藥向四周擴(kuò)散，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑（d）。判定標(biāo)準(zhǔn)[22]：d<10 mm 為耐藥（R）、10≤d<15 mm 為中度敏感（I）、d≥15 mm 為高度敏感（S）。

1.5 測(cè)定最小抑菌濃度

根據(jù)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，選取抑菌效果較好的中草藥，采用二倍稀釋法，測(cè)定各中草藥水浸液對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 的最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）。無菌條件下將中草藥提取液加入LB 液體培養(yǎng)基中，采用2 倍稀釋法，使中草藥水浸液終濃度分別為500.00，250.00，125.00，62.50，31.25，15.63，7.81 和3.91 g/L，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照組；將100 μL 維氏氣單胞菌JDM1-1 懸液（1×107cfu/mL）接種至上述不同濃度藥液的試管中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，重復(fù)測(cè)定3 次。若試管內(nèi)清澈透明，則表示無細(xì)菌生長(zhǎng)，其最低藥物濃度即為最小抑菌濃度。

1.6 測(cè)定最小殺菌濃度

根據(jù)最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果，從清澈透明無渾濁現(xiàn)象的試管中，吸取100 μL 菌液均勻涂布固體平板，于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以瓊脂平板上菌落數(shù)不超過5 個(gè)的最低藥物濃度作為該藥物對(duì)該菌株的最小殺菌濃度（Minimal Bacteriacidal Concentration, MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 42 種中草藥提取液的體外抑菌效果

42 種中草藥提取液對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1的體外抑菌效果見表1。由表1 可見，石榴皮、黃柏、五倍子、木瓜、青黛、女貞子6 種中草藥抑菌圈直徑為10~15 mm，判定為I；地榆、白芍、訶子、赤芍4 種中草藥的抑菌圈直徑為15~20 mm，判定為S；另外32 種中草藥d<10 mm，判定為R。體外抑菌結(jié)果表明，防治維氏氣單胞菌的首選抗菌中草藥為地榆、白芍、訶子、赤芍。

表1 維氏氣單胞菌JDM1-1 對(duì)42 種中草藥的敏感性

2.2 MIC

11 種中草藥對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 的MIC見表2。地榆、訶子、赤芍的抑菌作用最好，MIC 值為31.25 g/L，白芍、五倍子、石榴皮、烏梅、女貞子、黃柏對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 效果次之，木瓜與青黛對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 效果一般。

2.3 MBC

11 種中草藥對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 的MBC見表3。由表3 可見，地榆、訶子、赤芍、黃柏、女貞子的殺菌作用較好，MBC 值均為62.50 g/L；其次為白芍、五倍子、石榴皮、烏梅，MBC 值均為125.00 g/L；木瓜與青黛對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 效果一般，MBC 值均為250.00 g/L。

表3 11 種中草藥對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 的MBC①

3 討論

3.1 中草藥抑菌作用

中草藥作為天然藥物，種類豐富，含有多種抑制細(xì)菌繁殖的活性成分，其抗菌效果方面的研究結(jié)果已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。與抗生素相比，中草藥具有無耐藥性、毒副作用小、無殘留、不易對(duì)環(huán)境造成污染等優(yōu)點(diǎn)[23]。目前，中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物病害防控方面的應(yīng)用也越來越廣泛。王寶屯等[24]探究了83 種中草藥對(duì)花鱸（Lateolabrax maculatus）源維氏氣單胞菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)烏梅、蘇木、五倍子、丁香和艾葉對(duì)維氏氣單胞菌抑制作用較強(qiáng)；馬秀慧等[25]測(cè)定了27 種中草藥對(duì)羅非魚（Oreochromis niloticus）維氏氣單胞菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)五味子對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌效果為高度敏感；張桓橋等[26]采用牛津杯法以及用二倍稀釋法，測(cè)定了31 種中草藥對(duì)昆明裂腹魚（Schizothorax grahami）源維氏氣單胞菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)五倍子、地榆、訶子、蘇木、黃芩、黃連等6 種中草藥抑菌效果最好。本研究探究了42 種中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的體外抑菌和殺菌效果，發(fā)現(xiàn)訶子、地榆、赤芍三味中草藥對(duì)羅氏沼蝦病原維氏氣單胞菌抑制及殺滅作用最強(qiáng)，其MIC和MBC 均為31.25 和62.50 g/L，可作為羅氏沼蝦病原維氏氣單胞菌防治的理想中草藥。

3.2 中草藥抑菌成分分析

中草藥對(duì)細(xì)菌的抑制作用與其有效成分有關(guān)。中草藥含有多種生物堿、苷類、有機(jī)酸、黃酮類、鞣質(zhì)、多聚糖等多種免疫活性物質(zhì)，由于每種中草藥的成分不同，對(duì)與之相關(guān)的疾病的防治效果也不同[27]。地榆中存在鞣質(zhì)等生物活性成分，其通過改變細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞來達(dá)到抑菌效果，對(duì)革蘭陽性菌具有抑制作用[28]。訶子的主要生物活性物質(zhì)為鞣質(zhì)及酚酸，是其主要抗菌成分，具有廣泛的抗微生物活性，對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有高度敏感性，有望用于細(xì)菌感染性疾病，特別是耐藥菌所致感染的治療[29]。白芍與赤芍含有的生物活性化學(xué)成分相似，主要為單萜及其苷類、三萜類、黃酮類、揮發(fā)油類、鞣質(zhì)類等多種化學(xué)成分[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)維氏氣單胞菌具有明顯抑制成效的中草藥有地榆、訶子、白芍等。上述研究表明，應(yīng)根據(jù)不同的病原菌選用合適的中草藥。

4 結(jié)論

本研究探究了42 種常用中草藥對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1的體外抑菌效果，篩選出11 種中草藥對(duì)維氏氣單胞菌JDM1-1 具有較好的抑菌殺菌效果，其中地榆、訶子、赤芍等中草藥對(duì)羅氏沼蝦維氏氣單胞菌JDM1-1 的抑菌及殺菌效果最好，其MIC 和MBC 為31.25 和62.50 g/L。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)其MIC 與MBC 值，合理考慮用藥劑量及濃度，使得中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)抑菌以及殺菌效果達(dá)到最佳。