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    miR-34a-5p模擬物與KRASG12C抑制劑ARS-1620協(xié)同用藥對非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移效果的研究

    2023-04-25 12:34:16龐曉曉袁浩棟王輝徐國新
    中國醫(yī)藥科學(xué) 2023年7期
    關(guān)鍵詞:報告基因熒光素酶靶點

    龐曉曉 袁浩棟 王輝 徐國新

    [關(guān)鍵詞]微小RNA-34a-5p;間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子;ARS-1620;轉(zhuǎn)移;非小細胞肺癌

    肺癌是全球范圍內(nèi)常見腫瘤,發(fā)病率位列所有腫瘤第三位,其中非小細胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLC)是其最常見的組織學(xué)類型,現(xiàn)已構(gòu)成嚴重的全球健康問題[1-2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類對基因表達有調(diào)節(jié)作用的非編碼小分子RNA,其主要調(diào)控靶基因蛋白表達從而調(diào)節(jié)增殖、凋亡等多種細胞生物學(xué)功能[3-5]。據(jù)分析,miR-34a和miR-4664-3p、let-7a-2-3p等miRNAs聯(lián)合使用顯著抑制腫瘤增殖[6]。在抗NSCLC腫瘤細胞轉(zhuǎn)移方面,miR-34a與多種藥物協(xié)同作用效果顯著。KRAS基因突變被認為是NSCLC的預(yù)后不良因素,其中G12C位點突變約占14%[7-8]。因此臨床已將KRASG12C作為一個極好的肺癌治療靶點。KRASG12C抑制劑ARS-1620是一種快速持續(xù)占據(jù)靶點的高效價共價化合物,它通過抑制KRASG12C激活從而阻斷RAS-RAF-MEK-ERK信號傳遞,在小鼠移植瘤模型中已證實其抑制人類胰腺癌和結(jié)直腸癌細胞系生長的能力[9]。由此,本研究將探究miR-34a通過調(diào)控靶基因與ARS-1620協(xié)同作用時對KRASG12CNSCLC轉(zhuǎn)移的影響,為臨床治療KRASG12CNSCLC提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    NSCLC細胞株:H2030與人正常肺上皮細胞Beas-2b均購于中國上海富衡細胞庫。miR-34amimic(miR10000255-1-5)由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成,Lipo2000(11668027)購于Invitrogen;ARS-1620(S8707)購于SELLECK生物科技有限公司;4%多聚甲醛(P0099)和結(jié)晶紫染液(C0121)購于碧云天生物技術(shù)有限公司;PCR試劑盒等(RR820A,638315)購于TaKaRa生物技術(shù)有限公司。MET(8198S)、β-actin(3700T)抗體等購于賽信通生物試劑有限公司(CST)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將含10%胎牛血清的DMEM完培于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。將ARS-1620[溶于二甲基亞礬(DMSO)中]直接滴加于培養(yǎng)基,工作濃度為300nM。轉(zhuǎn)染過程是分別將濃度0、50、100、150nM的miR-34a-5pmimic和Lipo3000分別加入120μlDMEM基培中,混勻室溫靜置20min后將緩慢加入已接種細胞的6孔板內(nèi)。

    1.2.2 生物信息學(xué)分析 DAVID(thedatabaseforannotation,visualizationandintegrateddiscovery)分析miR-34a靶基因調(diào)控功能。TCGA(thecancergenomeatlas)下載肺癌表達差異基因,R語言制作火山圖(篩選條件為foldchange=2,adj.P=0.001),GEO數(shù)據(jù)庫下載關(guān)于肺癌轉(zhuǎn)移的系列:GSE42407(篩選條件為|logFC|>1,adj.P<0.01)。

    1.2.3 Transwell實驗 將細胞懸液200μl接種于Transwell上室中,下室加500μl培養(yǎng)基于24孔板并于培養(yǎng)箱孵育18~24h。將上下室培養(yǎng)基吸盡,加入4%多聚甲醛固定細胞,15min后再用結(jié)晶紫染色。

    1.2.4 熒光素酶報告基因?qū)嶒?將MET3UTR克隆至報告基因pmiR-RB-Report?的hRluc(海腎熒光素酶)基因下游,構(gòu)建雙報告基因載體(MET3UTR靶位點:51-57:CACTGCC,突變靶位點:51-57:CACTGCC)。將基因載體與miR-34amimic或陰性對照共轉(zhuǎn)染293T細胞并測定熒光素酶活性。

    1.2.5 qRT-PCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30s;循環(huán)40次;95℃5s;60℃30s。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

    1.2.6 (WesternBlot)WB 將上清注入電泳槽中,90V電泳1.5h,90V2h轉(zhuǎn)至PVDF膜,結(jié)束后用5%脫脂牛奶室溫封閉2h,加入一抗4℃孵育過夜,次日加入熒光素標記二抗,掃膜儀成像。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用GraphPadPrism7.0軟件及SPSS26.0進行圖片處理及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,組間比較比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 過表達miR-34a抑制H2030轉(zhuǎn)移

    qRT-PCR結(jié)果顯示:與人正常肺上皮細胞Beas-2b比較,H2030中miR-34a表達(0.13±0.10)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.820,P=0.004)。見圖1A。Transwell實驗結(jié)果顯示:miR-34amimic組(1035.00±61.81)細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量低于空轉(zhuǎn)mock組(1321.00±107.50),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.931,P=0.039)。見圖1B。

    2.2 生信分析篩選并驗證miR-34a靶基因

    通過TargetScan、miRDB、PicTar預(yù)測miR-34a靶基因并交集得出125個基因(圖2A)。通過DAVID預(yù)測miR-34a靶基因涉及遷移功能(圖2B)。將來自TCGA數(shù)據(jù)庫肺癌表達上調(diào)差異基因、GSE42407有關(guān)基因以及125個靶基因交集得出11個基因,分別為F2RL2、CCNE2、NRIP3、SEPT3、SEMA4B、ALDOA、BTBD11、ZFHX4、NAV1、JAG1、MET(圖2C~D)。

    選擇MET進行下一步實驗,熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,相對于MET-WT+NC(1.00±0.07),MET-WT+miR-34a組相對熒光值下降(0.57±0.02),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.954,P=0.015),提示miR-34a負調(diào)控靶基因MET表達。見圖3A。qRT-RCR結(jié)果顯示:miR-34amimic(100nM)組(0.49±0.05)中METmRNA表達低于對照mock組(1.18±0.09),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.570,P=0.003)(圖3B)。WB結(jié)果顯示,miR-34amimic(100nM)(0.49±0.03)組中MET蛋白表達低于對照mock組(0.79±0.03),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.790,P=0.004,圖3C)。

    2.3 過表達miR-34a聯(lián)合ARS-1620對H2030轉(zhuǎn)移的影響

    為了探究聯(lián)合用藥的效果,本研究分為con組、mock+DMSO組、miR-34a-5pmimic組、ARS-1620組和miR-34a-5pmimic+ARS-1620組Transwell實驗結(jié)果顯示,miR-34a-5pmimic+ARS-1620組(551.70±53.29)細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量顯著低于mock+DMSO組(1421.00±28.02),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.020,P<0.05)。見圖4。

    3 討論

    臨床腫瘤治療中常表現(xiàn)出對藥物的耐藥性,多種藥物協(xié)同治療是臨床上的最優(yōu)選擇。miR-34a與其他藥物協(xié)同治療取得了一定效果,已有研究表明,治療肺癌可協(xié)同多個miRNAs同時靶向多個致癌因子,由此癌癥相關(guān)旁路同時被抑制,發(fā)生耐藥的概率降低[6]。IGF1R、mTOR抑制劑和ARS-1620組合可抑制KRAS突變下游PI3K-AKT和RAF-MEK-ERK信號通路的傳遞,并完全抑制S6磷酸化,誘導(dǎo)肺腫瘤消退[9]。miRNAs是一類對基因表達有調(diào)節(jié)作用的非編碼小分子核糖核酸,異常miRNAs通過其靶基因異常表達從而對細胞產(chǎn)生影響,導(dǎo)致許多疾病,如NSCLC[10-12]。miR-34a異常表達是NSCLC患者復(fù)發(fā)的不良預(yù)測因子,所以恢復(fù)miR-34a表達對于NSCLC治療方面具有一定效果[13-14]。miR-34a靶基因MET是除EGFR、ALK和ROS1之后在NSCLC中的另一個重要腫瘤驅(qū)動基因和治療靶點,抑制MET蛋白表達對治療NSCLC有一定效果[15]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-34a在H2030中表達下降,當恢復(fù)miR-34a表達后顯著抑制MET表達并一定程度抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn),KRASG12C抑制劑ARS-1620聯(lián)合miR-34amimic共同作用于H2030可顯著抑制其遷移,效果顯著于單一使用miR-34amimic處理H2030。

    綜上所述,將miR-34a和KRASG12C作為靶點是一種很有前景的治療方案。但NSCLC的發(fā)展涉及到復(fù)雜信號通路,需要和其他靶向藥物甚至是放化療整合到臨床治療方案中。如何將不同治療方案結(jié)合起來將是臨床的一個挑戰(zhàn)。

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