玉米中真菌毒素檢測技術的研究進展

譚 林，陸 陽，王正珅

（1.中央儲備糧遼寧質檢中心有限公司，沈陽 110034；2.中央儲備糧通遼東郊直屬庫有限公司，遼寧 通遼 028012）

玉米又名玉蜀黍，禾本科一年生草本植物，原產于美洲安第斯山脈， 哥倫布發(fā)現(xiàn)美洲大陸后玉米傳至歐洲， 于明代傳入我國， 在我國的種植歷史已有400 多年。 由于玉米富含碳水化合物、脂肪、蛋白質及一些重要的維生素和礦物質，物美價廉，深受消費者喜愛。 玉米是僅次于水稻和小麥的中國第三大谷類作物，通常作為早餐谷物食用，如玉米粉粥、和玉米煎餅， 同時玉米在世界范圍內也被廣泛用作牲畜飼料，成為人與動物的主要營養(yǎng)谷類作物[1]。

真菌毒素是真菌的次級代謝產物， 是糧食作物的主要污染源之一， 這些次級代謝產物被高等動物攝入時會引起毒性反應， 嚴重威脅人類及動物的健康[2]。 我國玉米種植面積大、產量高，但其在收獲、貯藏期間易受到外界環(huán)境因素的影響產生真菌， 其次級代謝產物真菌毒素主要有三種： 黃曲霉B1（AFB1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）。在保證糧食安全過程中，對糧食收購時進行真菌毒素檢測至關重要[3]。

目前國內外對真菌毒素的檢測技術研究主要有酶聯(lián)免疫吸附法 （ELISA）、 高效液相色譜法（HPLC）、膠體金免疫層析法（CGIA）、近紅外光譜法（NIR）等[4]，本文綜述了以上幾種真菌毒素檢測方法，并對其準確度，優(yōu)缺點做了分析，對其在糧食收購過程中的操作復雜度，時效性進行了評估，以期為真菌毒素檢測技術的研究及推廣提供理論依據(jù)。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）作為定量檢測玉米中真菌毒素最常用的一種方法， 不僅能進行定量檢測還可以進行真菌毒素的定性分析。 由于玉米中真菌毒素種類眾多，為達到理想的分離效果，減少各毒素之間的影響，所以選擇的檢測條件也不同。 黃曲霉毒素B1因其產生熒光強度較弱，多采用柱前、柱后衍生，優(yōu)化其流動相，以此來增強熒光檢測信號，從而進行定量檢測。 常用的提取溶劑主要有甲醇-水、乙腈-水，可選用的色譜柱有硅膠固相萃取柱、 免疫親和柱及多功能凈化柱， 其中C18是最實用的用于檢測真菌毒素的SPE 柱[5]。

在提高檢出限和回收率方面， 很多學者探尋了凈化柱方面的改良。 黎睿等[6]通過建立免疫親和柱凈化-高效液相色譜法同時測定糧食中黃曲霉毒素B1等8 種真菌毒素， 根據(jù)信噪比為3 的峰響應值，確定各真菌毒素的檢出限。 樣品中各真菌毒素的平均加標回收率， 玉米為80.0%~104.5%， 小麥為83.2%~102.8%，方法精密度為2.6%~10.2%。 李輝章等[7]自制DON 凈化柱,采用高效液相色譜法，優(yōu)化了提取條件，選取乙腈—水溶劑進行提取，通過自制的DON 凈化柱凈化， 采用C18分離柱和紫外檢測器測定。 結果表明：樣品通過乙腈—水（體積比為84∶16）混合溶劑和超聲20 min 的提取，可大幅度提高方法回收率； 嘔吐毒素在0.5～8.0 mg/kg 內線性關系好，相關系數(shù)為0.999；在0.5、2.0 和8.0 mg/kg 的加標水平下， 回收率為95.1%～102.3%， 相對標準偏差為1.8%～6.4%，檢出限（信噪比）為50 μg/kg。 在玉米零食產品的檢測方面， 高效液相色譜也發(fā)揮了巨大的作用。Oveisi 等[8]確定了玉米粉中真菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEN）的存在并使用具有熒光檢測功能的高效液相色譜法分析了38個不同品牌樣品（玉米粉和奶酪零食）中的玉米赤霉烯酮。在玉米粉和奶酪零食樣品中檢測到玉米赤霉烯酮，其平均含量分別為0.377 mg/kg （最大，0.889 mg/kg） 和0.832 mg/kg （最大，1.471 mg/kg）。加標玉米粉和奶酪零食樣品的回收率在70%~87%之間。 該方法的檢出限為0.01 μg/mL。確定了方法的線性（y= 5.88x+ 0.25，r2= 0.9999），最佳測定范圍是0.05~30 μg/mL。

目前高效液相色譜法檢測糧食中的真菌毒素以靈敏度、回收率高、準確性強、可檢測真菌毒素種類多的優(yōu)點在科研單位和學校應用廣泛， 但由于設備不易攜帶且檢測時間過長，樣品前處理方式復雜，對檢測人員的素質要求高，檢測成本高等原因，無法在中小型糧食企業(yè)中進行推廣應用， 同時在糧食收購期間， 由于收儲量過大， 無法進行大規(guī)模的篩選檢測、實時和現(xiàn)場分析檢測，因此在優(yōu)化檢測程序、降低檢測成本等方面有廣闊的發(fā)展空間。

2 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）最早起源于20 世紀70 年代，是主要用于檢測各種生物化學物質的免疫分析方法。 ELISA 分析技術具有快速、簡單、準確和靈敏度高等優(yōu)點，廣泛應用于真菌毒素的檢測[9]。 國內外許多生物公司制成了ELISA 快速檢測真菌毒素試劑盒，采用間接競爭ELISA 方法，使樣品中的真菌毒素和抗原競爭毒素抗體， 同時毒素抗體與酶標物相結合，經(jīng)TMB 底物顯色，再進行定量分析即可。

為了提高酶聯(lián)免疫的敏感度，Zhan 等[10]開發(fā)了一種DLS 增強型直接競爭性酶聯(lián)免疫吸附法（DLSdcELISA）， 用于檢測玉米中的黃曲霉毒素B1（AFB1）。 利用羥基自由基誘導的金納米粒子(AuNP)聚集放大AuNP 散射信號，開發(fā)的DLS-dcELISA 對玉米中的黃曲霉毒素B1的檢測具有超高靈敏度、高準確度和較強的實用性。同時，在快速檢測試劑盒方面酶聯(lián)免疫方法也取得了很大的進展，Chandra 等[11]利用競爭性酶聯(lián)免疫吸附技術對從勒克瑙市當?shù)厥袌鍪占挠《扔衩讟悠分械狞S曲霉毒素發(fā)生情況進行了調查， 結果顯示真菌數(shù)量與黃曲霉毒素含量沒有顯著關系。 金福源[12]制備了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體， 成功地建立了可用于DON 檢測的ELISA 方法， 為DON 檢測試劑盒的開發(fā)奠定了基礎，優(yōu)化了DON 檢測條件，確立了用于DON 檢測的間接競爭ELISA 方法，該檢測方法具有良好的重復性，可完全應用于DON 的實際檢測中。

雖然酶聯(lián)免疫吸附法已成為常用的真菌毒素快速檢測方法， 但由于目標化合物是真菌毒素而不是抗原， 因此具有類似化學基團的化合物也會與抗體相互作用。這種所謂的基質效應或基質干擾，在檢測中常會出現(xiàn)這種情況， 可能會導致樣品中的真菌毒素濃度過高或過低影響最終檢測結果， 此外酶聯(lián)免疫吸附法還存在驗證不足等問題[13]。 因此，ELISA 方法的精確性仍有待提高。

3 近紅外光譜檢測法

近紅外光譜檢測法（Near Infrared Spectrumetry Instrument，NIR）起源于20 世紀50 年代，被廣泛應用在谷物、水果、蔬菜、飼料等成分的定量檢測，經(jīng)不斷研究探索發(fā)現(xiàn)近紅外光譜是一種用于檢測物質中有機化合物最為實用的光譜方法， 因此在谷物真菌毒素檢測中也經(jīng)常被使用到。 Berardo 等[14]從意大利中北部16個地區(qū)收集了280個受自然環(huán)境污染的玉米樣品。分析所有樣品的真菌感染。獲得的結果表明，NIR 可以準確地預測被真菌感染的果仁的發(fā)生率，特別是被細小鐮刀菌感染的果仁的發(fā)生率。分別使用玉米粒和玉米粉的校準模型， 可以獲得對總體真菌感染和細小鐮刀菌百分率的最佳預測能力。 玉米籽粒樣品中測得的細小鐮刀菌感染與NIR 預測值的散點圖證實了這種預測性能（r2= 0.80）。NIR 方法可用于監(jiān)測收獲后玉米中的霉菌污染。Wang 等[15]利用近紅外光譜成像系統(tǒng)對健康玉米粒表面的黃曲霉毒素B1（AFB1）污染物進行檢測。 通過制備4 種不同的AFB1溶液， 分別在玉米粒表面進行沉積10、20、100 和500 mg/kg。 同時用同樣的方法在30個健康玉米粒表面滴加20%的甲醇，作為對照樣品。 此外，用150個獨立樣本作為驗證，以此來檢驗方法的可重復性。 結果表明， 高光譜成像技術配合PCAFDA 方法，可用于檢測低至10 mg/kg 濃度的AFB1，并可直接應用于玉米表面，驗證準確率為88%。

近年來由于常規(guī)檢測玉米真菌毒素污染的方法比較耗時，對樣品破壞嚴重，且需要熟練的人員進行操作，因此不可能進行大規(guī)模的無損檢測、實時和現(xiàn)場分析。 因此， 研究了在400~2 500 nm 光譜范圍內的可見-近紅外光譜(Vis-NIR)檢測技術，以快速和無損的方式測定玉米籽粒上的黃曲霉毒素感染被廣泛的應用[16]。 糧食收購期間，由于收購量較大，糧食內的真菌毒素分布不均， 對近紅外光譜檢測造成了一些難度， 同時近紅外光譜技術對真菌毒素含量較低的樣品檢測時準確度不高，穩(wěn)定性差，這些問題還有待解決，同時也具很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法(Colloidal Gold Immunoassay，CGIA)是一種免疫色譜法，其中纖維素膜用作載體， 抗原抗體反應的高度特異性和膠體金特有的顏色反應進行示蹤，顯示出肉眼可見的紅色條帶，膠體金溶液在可見光范圍內有單一吸收峰， 因此可以用分光光度計來鑒定膠體金的質量， 從而實現(xiàn)對待測物質的定性或定量分析[17]。

此外， 膠體金免疫層析技術可同時測量多種真菌毒素。 孔德昭[18]利用膠體金免疫層析技術結合制備的五種真菌（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等）單克隆抗體，優(yōu)化了膠體金試紙條標記抗體的用量、檢測線包被濃度，制備了多重真菌毒素膠體金試紙條，同時也做了大量的驗證實驗，結果表明多重真菌膠體金試紙條實現(xiàn)了快速、準確、便捷的現(xiàn)場檢測。 曹德康等[19]應用膠體金免疫層析法檢測谷物中的三種真菌毒素， 優(yōu)化了膠體金溶液的pH、抗原包被量、金標抗體量，制備了3 種快速檢測試紙條檢測卡， 以高效液相色譜法檢測作為對照實驗， 結果表明檢測卡的檢測結果與高效液相色譜法的檢測結果基本一致，檢測卡靈敏度高、檢測結果準確，室溫條件下保存時間長達12個月。 Xiulan 等[20]研究了黃曲霉毒素B1(AFB1)特異性抗體-膠體金探針的制備及其在開發(fā)黃曲霉毒素B1快速檢測方法中的應用， 同時建立了黃曲霉毒素B1的免疫層析(IC) 分析方法。 該方法可在10 min 內完成分析，與ELISA 法相比,檢測時間縮短了6～10 倍。 通過肉眼觀察,黃曲霉毒素B1標準溶液的檢測下限為2.5 ng/mL 左右,比ELISA 法提高了2 倍。

膠體金免疫層析技術由于其檢測時間短、 準確度高、不使用毒素標準品等優(yōu)勢在糧油檢測機構、糧食企業(yè)被廣泛應用。 美國CHARM 公司利用膠體金免疫層析技術研發(fā)的一款真菌毒素快檢儀， 適用于多種農作物（玉米、小麥、大豆、高粱等），可檢測多種真菌毒素且檢測方法相同、操作簡單、攜帶便捷，適用于糧食收購期間真菌毒素檢測的現(xiàn)場篩查[21]。 此種檢測方法雖適用于真菌毒素現(xiàn)場篩查， 但其檢測成本較高，同時在對潮糧檢測時結果準確性不高，容易出現(xiàn)假陽性、假陰性的情況[22]，在廣大農戶中很難進行推廣。

5 結論

真菌毒素對農業(yè)和食品產品的污染易導致一系列的食品安全問題，影響人類健康。大多數(shù)真菌毒素具有熱穩(wěn)定性，不易被傳統(tǒng)的食品加工方式破壞，所以提高真菌毒素的檢測水平非常重要。 上述各種真菌毒素檢測方法各有優(yōu)缺點， 隨著檢測技術不斷地深入研究， 結合當前的各項檢測技術開發(fā)一種檢測時間短、操作簡單、準確性高、檢測成本低、可推廣性強的檢測方法將是今后真菌毒素檢測的發(fā)展方向。