酶聯(lián)免疫吸附試驗操作中的注意事項

鄒子云 光澤縣動物疫病預防控制中心 福建光澤 354100

ELISA 是獸醫(yī)實驗室中最普遍使用的試驗種類之一，具有良好的準確性和靈敏性，操作步驟簡單，不易產(chǎn)生試驗環(huán)境污染。 因此，被廣泛用于豬瘟、口蹄疫、 小反芻獸疫和豬繁殖與呼吸綜合征抗體實驗室檢測項目中。 根據(jù)日常操作和試驗步驟中細節(jié)問題的處理， 總結分析ELISA 試驗中常見的細節(jié)問題，以減少試驗過程中由主觀因素造成的誤差，從而提高試驗的準確性。

1 試驗前準備注意事項

1.1 樣品 樣品在采集、制備、保存過程中，要注意以下幾點。 首先，采集的每份樣品應保證之后試驗、復檢、留樣的使用數(shù)量；其次，采集完的樣品豎直向上擺放，避免劇烈震蕩，如果出現(xiàn)嚴重溶血現(xiàn)象，后期難以清洗干凈，容易出現(xiàn)假陽性；最后，樣品保存時不能反復凍融，2～8 ℃保存3 d，-20 ℃可長期保存。 此外，使用前須將樣品輕柔地上下顛倒混勻，保證離心管中各個位置抗體濃度一致， 不可劇烈晃動混勻。

1.2 試劑盒 試劑盒在使用前需平衡至室溫 （20～25 ℃），若放置于實驗室中自然回溫，耗時較長且各組件回溫程度不均勻。 建議將試劑盒各組件放在恒溫箱中回溫，包括配制洗滌液使用的純凈水。恒溫箱溫度設定在25 ℃，內(nèi)部放置溫度計，確保箱內(nèi)溫度能準確達到25 ℃，每一步使用時將所要用到的試劑組件取出。 不同批次的試劑不可混合使用。 試劑盒嚴格按照要求保存， 放在冰箱中應避免靠在冰箱內(nèi)壁上，以免造成結冰。未使用完的反應板要保存在放有干燥劑的密封袋內(nèi)。

2 試驗操作過程注意事項

2.1 加樣 在加入第一個樣品與最后一個樣品之間存在時間差，因此，每個樣品與孔板接觸和反應的時間就存在細微差異。 為保證每個孔的反應時間大致一樣，在加樣過程中要把握移液槍的熟練使用，每次加樣都要勻速準確。 此外，在加入不同試劑時，都要選擇相同的方向和順序， 如果一開始加入樣品是從左往右，那么之后每一步都應該從左往右，中途不能更換， 這樣可以有效減小和抵消反應時間差帶來的不利影響。

2.2 孵育 目前使用的試劑盒通常有25 ℃室溫孵育和37 ℃恒溫箱孵育兩種方式。 室溫孵育時，溫度控制在20～25 ℃，反應板應避免放置在陽光直射、冷熱風出口、潮濕桌面等溫度不均勻的地方。恒溫箱孵育時，反應板由25 ℃升至37 ℃需要時間，因此，可以推遲幾分鐘開始計時。 孵育開始前要用封膜蓋緊反應板，避免液體蒸發(fā)。撕開封膜時要緊緊按住反應板中部， 否則反應板容易被黏性封膜帶起后砸落在桌面上，造成液體飛濺。 多個反應板不能疊加擺放，以免受熱不均。

2.3 洗版 洗滌液要按照試劑盒說明書的要求按比例稀釋。 稀釋之前應該注意濃縮液中是否有結晶沉淀，如果有，就需要讓濃縮液繼續(xù)回溫直至沒有結晶沉淀才能進行下一步稀釋。 通常使用多道移液器添加洗滌液，在吸取洗滌液時，應稍微留意每個吸頭的液面是否一樣，而在打入洗滌液時，要避免太過用力，推力過大會導致洗滌液飛濺。吸水紙應當選擇干凈、 無塵、 吸水效果好的材料。 目前， 試驗使用的ELISA 反應板通常都是可拆卸的，而在棄去廢液時，容易造成反應板脫落、 掉入廢液池中， 導致試驗失敗。 因此，建議在試驗開始前，可用白色膠帶固定反應板四周，一是方便標記橫豎序號，二是可以固定反應板，避免松動、脫落。

2.4 顯色 顯色反應是試驗的最后一個反應步驟，酶催化反應產(chǎn)生有色物質(zhì)，陰性不變，而陽性會隨著反應時間延長而顏色加深。因此，影響因素除了之前的溫度和時間外，還有光照。 在加入反應底物后，可將反應板裝在深色紙袋中， 按說明書要求的溫度放入恒溫箱或置于室溫環(huán)境。 加入終止液，溫和震蕩，讓液體充分混合、終止反應，注意不要灑出，并盡快讀數(shù)。 在使用前要查看反應底物和終止液是否無色透明，如果出現(xiàn)變色則不能使用。

2.5 讀數(shù) 讀數(shù)開始前，用干凈的紙巾輕輕擦拭反應板底部，去除底部吸附的雜質(zhì)和液體，避免影響反應板的透光度。按照說明書要求調(diào)整好波長，酶標儀在使用前半小時打開預熱，以提高讀數(shù)的準確性。

2.6 其他 本地區(qū)除夏季外，其他季節(jié)早晚溫差較大，尤其是秋季集中監(jiān)測，通常在11 月底至12 月初進行試驗。早晨時試驗環(huán)境溫度較低，回溫時間應當加長。 值得注意的是，當環(huán)境溫度達到試驗要求時，試驗工作臺臺面依然溫度過低， 用紅外測溫儀測量發(fā)現(xiàn)二者間溫差達6～7 ℃。因此，可以在臺面與反應板之間放置一塊泡沫板， 從而減少溫度差異產(chǎn)生的不利影響。

3 總 結

ELISA 試驗簡單易懂， 但是每個步驟都有可能影響試驗結果的準確性，從開始的樣品、試劑準備到最后的顯色、讀數(shù)都有可能產(chǎn)生誤差。 因此，精密的儀器、 良好的檢測試劑以及準確無誤的操作都是試驗是否準確的組成部分。作為試驗人員，所能把握的便是操作嚴格按照說明書要求進行， 尤其是對細節(jié)的把控，是試驗結果真實、準確的保障。