卵黃抗體替代抗生素在抗水生致病菌感染中的應(yīng)用

陳弘立 趙 軒 徐冰洋 秦藝銘 林晨韜＊

（1.福州海洋研究院/海洋生物優(yōu)良種質(zhì)創(chuàng)制與工程化繁育技術(shù)研發(fā)中心 福州 350117；2.福建師范大學南方海洋研究院/福建省微藻種質(zhì)改良工程技術(shù)研究中心 福州 350117；3.福建師范大學生命科學學院/福建省特色海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室 福州 350117）

福建省是海洋大省，2022 年預(yù)計全省海洋生產(chǎn)總值1.2 萬億元，海洋經(jīng)濟規(guī)模繼續(xù)保持全國前列。全省水產(chǎn)品總量862.4 萬t， 其中海水養(yǎng)殖產(chǎn)量548.9 萬t，居全國第一。 大黃魚、南美白對蝦、牡蠣、鮑魚、鰻鱺、紫菜等六大優(yōu)勢品種全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值均超100 億元。 但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，高密度集約化程度增大，病害頻發(fā)，抗生素等藥物濫用情況嚴重，導致部分水產(chǎn)品中藥物殘留超標，不僅威脅到食品安全，也影響水產(chǎn)品的出口，給福建省水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

當前我國養(yǎng)殖業(yè)中病害防治仍以抗生素為主，抗生素在預(yù)防及治療水生動物細菌性疾病方面發(fā)揮著不可替代的重要作用，據(jù)統(tǒng)計我國超過70%的抗生素都用在養(yǎng)殖業(yè)上。 但抗生素濫用易引發(fā)病原耐藥和藥物殘留問題，繼而危害消費者健康。 2006 年起， 歐盟禁止將抗生素用于促進動物生長。 在黨中央、國務(wù)院關(guān)于養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的總體要求下，我國于2018 年4 月制定了《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案（2018-2021）》，并明確了養(yǎng)殖端減抗和限抗的時間表。在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部政策要求下，藥物飼料添加劑已經(jīng)在2020 年8 月全部退出。抗生素的禁用與抗感染形勢的嚴峻性使得水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗生素替代已經(jīng)迫在眉睫。 當前開發(fā)出了溶菌酶、抗菌肽、益生菌、發(fā)酵產(chǎn)物、中草藥、有機金屬微量元素等抗生素替代品， 其中卵黃抗體作為一種綠色高效的抗生素替代品得到了人們的青睞[1]。

卵黃抗體（egg yolk immunoglobulin，IgY）是一種主要存在于禽類、 兩棲動物以及爬行動物中的免疫球蛋白， 與哺乳動物免疫球蛋白IgG 有功能和遺傳學相似性，發(fā)揮了類似的免疫學功能[2]。 目前研究最多的是雞的卵黃抗體，通過抗原刺激蛋雞，產(chǎn)生的特異性抗體富集到蛋黃中， 提取的卵黃抗體可以通過浸泡、注射和飼喂進行被動免疫，因具有不產(chǎn)生耐藥性、制備簡單、產(chǎn)量大、穩(wěn)定性好、符合動物福利要求、不激活哺乳動物的補體系統(tǒng)等優(yōu)勢[3]，越來越受到人們的關(guān)注。 本文從卵黃抗體適合于飼料添加的特性出發(fā)探討其替代抗生素的可能性， 并概述其在抵抗不同的水生致病菌感染中的應(yīng)用研究， 為卵黃抗體作為抗生素替代物的研究及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 卵黃抗體的特性決定其適合于飼料添加

1.1 卵黃抗體的產(chǎn)生及特異性 爬行動物、兩棲動物、 鳥類中的主要血清抗體IgY 在遺傳學上被認為是哺乳動物中IgE 及IgG 的進化前體， 有相當高的保守性，功能上實質(zhì)性發(fā)揮著IgG 的作用。哺乳動物轉(zhuǎn)移IgG 到胎盤中，而IgY 與之類似，特異性抗體能通過血清轉(zhuǎn)移到蛋黃中提供免疫保護[4]。 禽類特有的法氏囊壁上的B 淋巴細胞受到外源抗原的刺激后，分化為漿細胞分泌特異性抗體，經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運結(jié)合到卵黃膜上，形成卵黃抗體[5]。 由于進化上禽類與哺乳動物及魚類親緣關(guān)系較遠， 卵黃抗體往往不易發(fā)生交叉反應(yīng)，而且具有更好的特異性。卵黃抗體通過被動免疫抵抗病原菌感染，效果顯著，已作為抗生素替代品廣泛運用于畜禽疾病的防治[6]。

1.2 卵黃抗體的穩(wěn)定性 IgY 有兩條輕鏈（L）和重鏈（H），分別為25 kD 和70 kD 左右。 其中每條輕鏈和重鏈都有1 個可變區(qū)（VL 或VH），輕鏈有1 個恒定區(qū)（CL）而重鏈有4 個恒定區(qū)（CH），其中輕鏈和重鏈通過二硫鍵進行連接[2]。 與IgG 相比，IgY 的重鏈沒有鉸鏈區(qū)域的存在， 這恰恰增加了它結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性。IgY 具有較好的耐熱、耐酸和耐酶解能力。IgY在4 ℃下可貯存6～7 年，在室溫下可保持6 個月，而65 ℃時也可保持24 h 以上，在70 ℃時加熱90 min后其活性才明顯下降。 IgY 在弱酸及弱堿性（4＜pH＜10）時比較穩(wěn)定，抗菌活性較高。 IgY 對胃蛋白酶有較高的抵抗力，能抵抗幼齡動物的胃酸屏障。有研究表明，通過添加糖類物質(zhì)如甘露糖、葡萄糖會改善熱穩(wěn)定性， 添加巖藻糖或者山梨醇能增強卵黃抗體在胃部環(huán)境時的酸穩(wěn)定性[7-8]。 因此，卵黃抗體的穩(wěn)定性使其適合在飼料生產(chǎn)過程中添加[4]。

1.3 產(chǎn)量高及分離純化便捷 在蛋雞免疫后，IgY會被輸送到蛋中，收集雞蛋就可方便獲得卵黃抗體，相比采集兔等動物血清要方便得多， 而且更加符合動物福利要求，避免規(guī)模養(yǎng)殖后生物倫理問題。在合適條件下蛋雞每天能產(chǎn)一枚雞蛋， 約15 mL 的卵黃，其中卵黃抗體數(shù)量可觀，卵黃抗體的產(chǎn)量高也使得其作為飼料添加的成本相對較低[9]。

卵黃抗體是卵黃中水溶性γ 活性蛋白，從卵黃中獲得卵黃抗體包括分離和提取， 其中分離的原理是去除卵黃中的脂肪以及脂蛋白，獲得水溶性組分，提取工藝是通過水稀釋法、 三氯甲烷萃取法和聚乙二醇法分離蛋黃中脂肪、脂蛋白，單獨獲得其中的水溶性γ 活性蛋白[10-11]。 獲得的水溶性蛋白通過水稀釋法和硫酸銨沉淀法[12]將其與其他水溶性組分分離開， 再使用蛋白純化方法獲得較為純凈均一的卵黃抗體。當然，卵黃本身也可以作為營養(yǎng)物質(zhì)直接在飼料中添加[6]。

2 卵黃抗體在預(yù)防和治療水生致病菌感染中的應(yīng)用

2.1 弧菌屬 弧菌屬常見于淡水和海洋中，作為革蘭氏陰性桿菌，喜好溫暖的咸水，具有季節(jié)性暴發(fā)的特點[13]。 而在水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)的哈維氏弧菌合并鰻弧菌感染在全球海洋漁業(yè)弧菌病中較為常見， 提示迫切需要一種抗生素替代品來解決[14-15]。

蛋雞注射兩種弧菌屬菌種產(chǎn)生的特異性卵黃抗體能特異性抵抗這兩種菌。Gao X J 等[16]同時注射被福爾馬林滅活的哈維氏弧菌和副溶血弧菌， 使蛋雞產(chǎn)生的抗弧菌（哈維氏弧菌和副溶血弧菌）卵黃抗體IgY 并加入白蝦幼苗中， 經(jīng)過特異性抗弧菌蛋黃粉激活，用哈維氏弧菌和副溶血弧菌攻毒，平均死亡率分別為38.2%、41.6%， 顯著低于用對照蛋黃粉的85.6%和86%。

在特異性卵黃抗體中加入免疫佐劑， 能顯著性增加卵黃抗體的特異性免疫能力。Kumaran T 等[17]注射抗哈維氏弧菌IgY 抗體V.h wo 和添加不同佐劑的特異性IgY 抗體V.h A 及V.h G，可將印度白蝦的存活率分別提高到63%、88%、89%， 空白對照全部死亡，非特異性IgY 對照組的存活率只有44%，具有顯著性差異。 飼喂抗哈維氏弧菌IgY 抗體V.h wo 30 d 后攻毒， 印度白蝦死亡率達30%的時間為15 d， 而飼喂非特異IgY 印度白蝦在7 d 的死亡率為100%。喂食抗哈維氏弧菌V.h wo、V.h A 和V.h G膳食60 d 的累計死亡率分別為50%、30%和15%，顯著優(yōu)于非特異性IgY 的100%死亡率。

無脊椎動物（海參）、節(jié)肢動物（蝦）、軟體動物（鮑魚）和脊椎動物（魚）等常見水生養(yǎng)殖動物都能使用卵黃抗體進行被動免疫， 以降低水生致病弧菌帶來的危害和經(jīng)濟損失。 Li X 等[18]對海參注射和浸泡濃度梯度（1、5、10 mg/mL）溶藻弧菌特異性IgY 的存活率分別為45%、60%、80%， 顯示出濃度相關(guān)的特異性抗菌能力，而非特異性IgY 組的存活率為35%，空白對照為20%，有顯著差異性。 Gao X 等[19]發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨分別飼喂含抗鰻弧菌蛋黃粉、 普通蛋黃粉和基礎(chǔ)膳食的死亡率分別為30%、86.7%、93.3%。Arasteh N 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒魚在1、3、7、14 d 感染鰻弧菌后腹腔注射抗鰻弧菌IgY 抗體的死亡率在30%以下， 非特異性抗體和PBS 對照組的死亡率在80%左右。Wu C J 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，小鮑魚在溶藻弧菌注射攻毒前1 周飼喂含5%、10%抗溶藻弧菌IgY，14 d 后存活率約為70%，而非特異性IgY 對照組在2 d 內(nèi)全部死亡。

2.2 氣單胞菌屬 氣單胞菌作為革蘭氏陰性菌，一般存在于各種水環(huán)境中（地表水、地下水、氯化飲用水），在自然環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖的魚類、爬行類、兩棲類中分離到蛙氣單胞菌及嗜水氣單胞菌等[22]。 Jin L等[23]試驗中銀鯽浸泡特異性IgY 抗體后，使用嗜水氣單胞菌注射攻毒，死亡率為30%，而非特異性IgY抗體組及空白對照組的死亡率都是80%。

有時在宿主尚未感染致病菌前， 預(yù)防性注射特異性卵黃抗體相較于感染后治療具有更好的抑菌效果和存活比率。Li X L 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，銀鯽對嗜水氣單胞菌感染中，注射特異性IgY（s-IgY）和在攻毒前(預(yù)防)存活率為60%，攻毒后（治療）為30%，非特異性IgY（n-IgY）和PBS 對照組預(yù)防和治療的存活率為0。 銀鯽腎臟中的平均細菌數(shù)量，特異性IgY 組相較于非特異性IgY 和對照組在預(yù)防中降低了3 個數(shù)量級，而在治療嗜水氣單胞菌感染（攻毒后）中降低了2 個數(shù)量級， 更好的抑菌性使得特異性IgY 在早期細菌預(yù)防中發(fā)揮效果相對于治療有顯著性差異。卵黃抗體不僅可以通過注射，采用浸泡、飼喂的方式也可以能夠起到較好的被動免疫的保護效果。 鄒棟良等[25]發(fā)現(xiàn)黑龍江銀鯽腹腔注射嗜水氣單胞菌特異性IgY（4 mg/尾），與對照組相比可降低累計死亡率50%左右。飼料添加5%特異性IgY 的被動保護效果最佳，累計死亡率在50%左右，浸泡400 mg/mL 特異性IgY 預(yù)防效果最好，累計死亡率30%，對照組全部死亡。 Gan H 等[26]將錦鯉浸泡中濃度（0.2 g/L）和高濃度（0.5 g/L）特異性抗殺鮭氣單胞菌卵黃粉后，死亡率分別為50%和70%，而非特異性卵黃粉和空白對照組累計死亡率均高于90%。Qin Z D 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，鈍吻鯛感染前（預(yù)防）注射5 mg 抗嗜水氣單胞菌IgY 和在感染后12 h（治療）注射5 mg 抗嗜水氣單胞菌IgY 的存活率分別為60%和50%，相較于非特異性IgY 和對照組的存活率（10%和0）有顯著性差異。

2.3 愛德華氏菌屬 愛德華氏菌在淡水和海水中廣泛分布，遲緩愛德華氏菌、殺魚愛德華氏菌、安圭拉愛德華氏菌、伊氏愛德華氏菌等都從魚體中發(fā)現(xiàn)，如日本比目魚、歐洲鰻魚、大菱、斑點叉尾鮰等[28]。Gutierrez M A 等[29]研究顯示，口服給藥日本鰻鱺抗遲緩愛德華氏菌IgY（400 mg/尾），在104-6CFU 劑量的遲緩愛德華氏菌感染下有100%的存活率，在107CFU 劑量下仍有60%的存活率，遠高于缺少IgY抗體保護、感染劑量104-7CFU 的最高存活率25%。Xu L 等[30]發(fā)現(xiàn)，口服含有5%、3%和1%微囊化特異性抗遲緩愛德華氏菌IgY 飼料的大菱鲆存活率分別為63.3%、56.7%和20%， 相比于陽性對照組和非特異性IgY 組中大菱鲆第10 d 的存活率為0， 具有顯著差異性。

3 結(jié) 語

卵黃抗體由于不易產(chǎn)生耐藥性、制備簡單、產(chǎn)量大、穩(wěn)定性好、符合動物福利要求等優(yōu)勢，有望成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中安全有效的抗生素替代品。 但由于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的復(fù)雜性， 卵黃抗體在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用還有一些問題需要解決。 腹腔注射往往能有更高的存活率， 但在養(yǎng)殖生產(chǎn)上侵入性地對每尾魚進行注射不僅帶來很高的人工成本，還可能引起創(chuàng)口感染?？诜暳贤ㄟ^食道進入胃部， 可能是更好的免疫方式。人們也在研究增加卵黃抗體穩(wěn)定性的方法，如添加NaHCO3作為抗酸劑， 脫氧膽酸鈉作為黏液溶解劑和膜增溶劑，提高卵黃抗體吸收效率，降低途經(jīng)胃部時變性水解的幾率[31]。浸泡也是有效的保護方式，但對于卵黃抗體的純度要求會更高。目前，卵黃抗體的成本還是會高于傳統(tǒng)的廣譜的抗生素產(chǎn)品。 卵黃抗體規(guī)?；a(chǎn)與工廠化蛋雞的雞蛋生產(chǎn)具有一定的環(huán)節(jié)共通性， 但是后續(xù)對雞蛋組分中卵黃抗體提取工藝的自動化和工廠化可能還需要進一步研究和開發(fā)。 在環(huán)境保護的需求下隨著研 究的深入，卵黃抗體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用會越來越廣泛。