• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    應(yīng)用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)研究靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽之間的互作關(guān)系

    2023-04-18 06:03:44梁洪宇劉成倩周佳明司伏生易建中
    關(guān)鍵詞:靶標(biāo)多肽復(fù)合物

    梁洪宇,劉成倩,高 駿,周佳明,司伏生,易建中

    (1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.上海市金山區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201500)

    【研究意義】豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)屬于冠狀病毒科(Alphacoronavirus),是一種線性無節(jié)段、單股正鏈的RNA病毒,是引起豬流行性腹瀉(PED)的主要病原,臨床上對養(yǎng)豬生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。在病毒基因組編碼的眾多蛋白中S蛋白包含誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位,因此,S蛋白在PED基因工程疫苗的研究中倍受關(guān)注[1-3]。研究表明多肽可用于多種病原檢測[4],在臨床上作為一種診斷方法可以進(jìn)行病原監(jiān)測。鑒于S蛋白在PEDV檢測和疫苗研發(fā)中的重要作用以及多肽在病原監(jiān)測中的應(yīng)用,針對S蛋白設(shè)計(jì)多肽來檢測PEDV的流行具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】多肽間的相互作用是多肽用于抗原檢測的基礎(chǔ)。目前有多種方法可研究蛋白質(zhì)間的相互作用,其中能夠用來研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間相互作用的方法是Hu等[5-6]在2002年開發(fā)的雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular fluorescent complimentary,BiFC)技術(shù)。彭也等[7]基于BiFC技術(shù)驗(yàn)證IMM-H004對CKLF1/CCR4結(jié)合的影響;楊迷等[8]利用BiFC技術(shù)對擬南芥的ROP2與GGB蛋白進(jìn)行了互作分析。BiFC技術(shù)也廣泛用于研究病毒與宿主之間的相互作用,研究病毒蛋白之間及其與寄主蛋白之間的互作關(guān)系,構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò),對于研究病毒蛋白的功能和致病機(jī)制等具有非常重要的意義[9]。Hemerka等[10]利用BiFC系統(tǒng)研究了流感病毒聚合酶復(fù)合物PA與PB2亞基的互作,并詳細(xì)分析了PA-PB2二元復(fù)合物的亞細(xì)胞定位與進(jìn)核。BiFC技術(shù)也已被用于一些與人類病毒相關(guān)的研究,如哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中Epstein Barr病毒潛伏膜蛋白1的表征、HIV病毒Vor分子之間的互作[11]等。近年來,多肽技術(shù)在疾病的診斷方面取得長足進(jìn)展。科學(xué)家們已經(jīng)研究出放射性標(biāo)記的肽作為癌癥診斷的有效試劑,Farahani等[12]對放射性肽進(jìn)行了修飾,提高了用于腫瘤診斷和治療的多肽的特異性和敏感性。張蕾等[13]研究根據(jù)ASFV的p30、p54和p72 3種重要抗原設(shè)計(jì)3條合成肽,以此為包被抗原建立了 ASFV間接 ELISA 抗體檢測方法,并驗(yàn)證其敏感性、特異性、穩(wěn)定性。寧靜等[14]發(fā)現(xiàn)RV1737多肽有成為潛伏結(jié)核診斷候選抗原潛力。目前,與靶標(biāo)蛋白相互作用的多肽或蛋白質(zhì)主要是利用噬菌體展示、酵母雙雜交或免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體等方法來篩選獲得,存在篩選周期長、工作量大等缺點(diǎn),且篩選的是線性結(jié)構(gòu)位點(diǎn),對天然蛋白質(zhì)結(jié)合力較弱[15-16]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PEDV的增殖依賴于其自身基因組編碼蛋白的表達(dá),封閉PEDV S蛋白上的受體結(jié)合位點(diǎn),可阻止病毒侵入細(xì)胞。設(shè)想依據(jù)S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)肽段的二級(jí)及空間結(jié)構(gòu),創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)與S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)相互作用的多肽,再結(jié)合當(dāng)前在活細(xì)胞內(nèi)研究多肽間互作的BiFC技術(shù)來探索2個(gè)肽段間互作的可能性以及兩者結(jié)合后形成的復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的定位情況,為進(jìn)一步利用該肽段進(jìn)行臨床檢測奠定前期基礎(chǔ)?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究依據(jù)S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)肽段的特征以及密碼子的偏好性首先設(shè)計(jì)出編碼靶標(biāo)肽(DEFFLIDEDYFD)的氨基酸序列,設(shè)計(jì)理論上與靶標(biāo)肽互補(bǔ)且可能與其發(fā)生相互作用的互補(bǔ)肽(KKFFLLRKYNWK),通過構(gòu)建互補(bǔ)肽和靶標(biāo)肽的BiFC真核表達(dá)載體,研究互補(bǔ)肽和靶標(biāo)肽在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用情況以及形成的BiFC復(fù)合物在活細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。因此,明確2個(gè)肽段間的互作關(guān)系以及兩者結(jié)合后形成復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的定位是本研究擬解決的2個(gè)關(guān)鍵問題。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)基及血清 非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)由實(shí)驗(yàn)室保存;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS),Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)液為美國HyClone公司產(chǎn)品,0.25%胰蛋白酶-EDTA購自Invitrogen公司。

    1.1.2 DNA合成、試劑及BiFC系統(tǒng)載體 編碼靶標(biāo)肽及互補(bǔ)肽的引物由上海捷瑞有限公司合成;Venus雙分子熒光互補(bǔ)載體載體pBiFC-VC155和pBiFC-VN173以及陽性對照載體pBiFC-bFos-VC155與pBiFC-bJun-VN173購自Addgene公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品;NotI、SalI、EcoR I、XhoI等限制性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α為本實(shí)驗(yàn)室制備;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑和T4 DNA連接酶購自Thermo Scientific公司。兔抗Calnexin抗體-ER Marker(ab22595)、鼠抗GM130抗體-Golgi Marker(ab169276)購自Abcam公司;Alexa Flour 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG、4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)購自碧云天生物技術(shù)有限公司,Alexa Flour 594標(biāo)記羊抗兔IgG購自Thermo Scientific公司。

    1.1.3 主要儀器與設(shè)備 核酸電泳儀和凝膠成像分析儀購自上海天能科技有限公司;二氧化碳培養(yǎng)箱和EVOS M7000智能全自動(dòng)活細(xì)胞熒光成像系統(tǒng)購自Thermo Fisher公司;熒光正置顯微鏡購自卡爾ZEISS公司;熱循環(huán)PCR儀為伯樂公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的設(shè)計(jì) 依據(jù)PEDV S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)肽段的氨基酸組成、所帶電荷種類、形成分子間氫鍵的能力、極性強(qiáng)弱、疏水性能、側(cè)鏈基團(tuán)的大小和結(jié)構(gòu)等理化條件設(shè)計(jì)出編碼靶標(biāo)肽:天冬氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸(Asp-Glu-Phe-Phe-Leu-Ile-Asp-Glu-Asp-Tyr-Phe-Asp)的核苷酸序列,根據(jù)靶標(biāo)肽氨基酸序列設(shè)計(jì)理論上與靶標(biāo)肽互補(bǔ)的、可能與靶標(biāo)肽發(fā)生相互作用互補(bǔ)肽:賴氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-賴氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-色氨酸-賴氨酸(Lys-Lys-Phe-Phe-Leu-Leu-Arg-Lys-Tyr-Asn-Trp-Lys)對應(yīng)的核苷酸片段,將設(shè)計(jì)好的2條多肽按照偏愛密碼子轉(zhuǎn)換成核苷酸序列(表1),靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽均為12位氨基酸,36個(gè)堿基;并結(jié)合對載體序列的酶切位點(diǎn)分析分別在多肽對應(yīng)核苷酸序列的5’和3’加上合適的酶切位點(diǎn),經(jīng)分析無誤后送上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成。

    表1 設(shè)計(jì)的多肽編碼的核苷酸序列Table 1 The nucleotide sequence encoding the designed polypeptide

    1.2.2 雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 真核載體pBiFC-VC155和pBiFC-VN173進(jìn)行改造(圖1)。pBiFC-VC155用EcoRΙ/XhoΙ進(jìn)行雙酶切,pBiFC-VN173用NotΙ/SalΙ進(jìn)行雙酶切。上述反應(yīng)體系分別在37 ℃孵育4 h后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收,隨后將合成的核酸序列溶解后分別在10 μL體系經(jīng)95 ℃變性10 min后自然冷卻至室溫進(jìn)行退火處理,冷卻產(chǎn)物分別與經(jīng)雙酶切處理的pBiFC-VC155、pBiFC-VN173載體在22 ℃下連接2 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α并37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證,對測序驗(yàn)證無誤的菌落提取質(zhì)粒后進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定。

    圖1 pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction map of pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide

    1.2.3 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用瑞士生物信息學(xué)研究所開發(fā)的ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)程序?qū)Π袠?biāo)肽與互補(bǔ)肽蛋白肽鏈的疏水性進(jìn)行分析;使用在線工具SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_sopma.html)進(jìn)行多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析;使用SWISS-MODLE與PDBsumGenerate(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)程序?qū)Π袠?biāo)肽與互補(bǔ)肽做建模分析[17-19]。

    1.2.4 重組質(zhì)粒制備 對經(jīng)測序驗(yàn)證序列正確的克隆在37 ℃培養(yǎng)過夜,搖菌后按照Axygen質(zhì)粒小提試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行質(zhì)粒提取并測定濃度,將質(zhì)量合格的質(zhì)粒-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及熒光觀察 將Vero細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每空0.5×106個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至70%~80%匯合度時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染分組如下:①重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽單轉(zhuǎn)染組;②重組質(zhì)粒pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽單轉(zhuǎn)染組;③pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽共轉(zhuǎn)染組;④pBiFC-bFos-VC155與pBiFC-bJun-VN173共轉(zhuǎn)染組;⑤pBiFC-VC155與pBiFC-VN173共轉(zhuǎn)染組。具體轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 3000脂質(zhì)體說明書上的操作進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后36 h用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,隨后在EVOS M7000智能全自動(dòng)活細(xì)胞熒光成像系統(tǒng)下觀察綠色熒光的形成情況。

    1.2.6 間接免疫熒光研究靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的亞細(xì)胞定位 為進(jìn)一步明確靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的亞細(xì)胞定位,對重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽和pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽參考上述轉(zhuǎn)染方法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),研究其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的定位情況。操作步驟參考實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行[20]:細(xì)胞接種于爬片上轉(zhuǎn)染36 h后用4%多聚甲醛室溫固定15 min,然后用0.1%的Triton-X 100室溫透化15 min,3%的山羊血清室溫封閉1 h,隨后用兔抗Calnexin細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白抗體(1∶200)和鼠抗GM130細(xì)胞高爾基體標(biāo)記蛋白抗體(1∶200)作為一抗進(jìn)行雙重染色,室溫孵育60 min,PBS洗3次后用Alexa Flour 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG(1∶50)和Alexa Flour 594標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶50)作為二抗,室溫避光孵育60 min后用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,隨后在正置顯微鏡下觀察靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽的定位情況。

    1.2.7 熒光顯微鏡觀察及拍照 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色后在正置顯微鏡上觀察BiFC的形成情況以及靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽在活細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位,并拍照保存。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)預(yù)測

    2.1.1 親/疏水性預(yù)測結(jié)果 蛋白的親/疏水性主要取決于其分子表面的電荷量[21]。蛋白質(zhì)折疊時(shí)能形成親水表面和疏水內(nèi)核,并于潛在跨膜區(qū)出現(xiàn)高疏水值區(qū)域[22]。為了初步查明本研究中所設(shè)計(jì)的多肽的性質(zhì),首先利用ProtScale程序?qū)Π袠?biāo)肽與互補(bǔ)肽序列進(jìn)行親/疏水性預(yù)測。結(jié)果表明,靶標(biāo)肽的最低分值-0.511位于第10位氨基酸,表明親水性最強(qiáng);最高分值0.544位于第13位氨基酸,說明疏水性最強(qiáng)(圖2-A),整條多肽鏈親水域高于疏水域;而互補(bǔ)肽鏈第14位氨基酸具有最低分值-0.844,親水性最強(qiáng);第8位氨基酸賴氨酸具有最高分值1.200,疏水性最強(qiáng)(圖2-B)。

    2.1.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明,靶標(biāo)肽結(jié)構(gòu)多樣,66.7%為延伸股,16.6%為無規(guī)則卷曲,8.3%為β轉(zhuǎn)角,8.3%為α螺旋;互補(bǔ)肽66.7%為α螺旋,33.3%為無規(guī)則卷曲。與靶標(biāo)肽相比,互補(bǔ)肽結(jié)構(gòu)較為簡單。

    A.靶標(biāo)肽親/疏水性預(yù)測;B.互補(bǔ)肽親/疏水性預(yù)測。A.Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of target peptide;B.Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of complementary peptide.圖2 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽親/疏水性預(yù)測Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of target peptide and complementary peptide

    2.1.3 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 圖3-A為靶標(biāo)肽,紅色標(biāo)記從右向左依次為DEFFLIDEDYFD;同理,圖3-B中紅色標(biāo)記從右向左依次為KKFFLLRKYNWK。結(jié)果顯示靶標(biāo)肽的三維空間結(jié)構(gòu)存在較多延伸股,互補(bǔ)肽多為α螺旋,與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

    2.2 酶切鑒定及測序結(jié)果

    將構(gòu)建好的載體提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定,電泳結(jié)果見圖4。真核重組質(zhì)粒命名為pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽。

    重組載體pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽提取質(zhì)粒后進(jìn)一步進(jìn)行測序,結(jié)果(圖5)表明靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽分別正確插入pBiFC-VC155與pBiFC-VN173載體中。

    2.3 BiFC分析靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽相互作用結(jié)果

    按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn),轉(zhuǎn)染36 h后利用EVOS M7000智能全自動(dòng)活細(xì)胞熒光成像系統(tǒng)觀察BiFC熒光信號(hào)表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中出現(xiàn)BiFC熒光信號(hào),而在pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽單獨(dú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)均沒有熒光出現(xiàn)(圖6),證實(shí)互補(bǔ)肽與靶標(biāo)肽在活細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。

    2.4 BiFC復(fù)合物的亞細(xì)胞定位

    為了進(jìn)一步研究靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽在活細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位,把重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽和pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,并用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體標(biāo)記蛋白的抗體來對細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進(jìn)行染色,最后用間接免疫熒光技術(shù)研究靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽互作后形成的BiFC復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的定位情況。研究結(jié)果表明靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽互作后形成的BiFC復(fù)合物位于細(xì)胞核內(nèi),而不在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)(圖7)。

    A.泳道1:pBiFC-VC155用SacI單酶切;泳道2:pBiFC-VN173用SacI單酶切;泳道3:pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽用SacI單酶切;泳道4:pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽用SacI單酶切;M:Marker DL5000.B.泳道1:pBiFC-VC155 用SacI/NheI雙酶切;泳道2:pBiFC-VN173用SacI/BamHI雙酶切;泳道3:pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽用SacI/NheI雙酶切;泳道4:pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽用SacI/BamHI雙酶切;M:Marker DL5000。A.Lane1:pBiFC-VC155 digested by SacI;Lane2:pBiFC-VN173 digested by SacI;Lane3:pBiFC-VC155-target peptide digested by SacI;Lane4:pBiFC-VN173-complementary peptide digested by SacI;M:DL5000 Marker.B.Lane1:pBiFC-VC155 digested by SacI/NheI;Lane2:pBiFC-VN173 digested by SacI/BamHI;Lane3:pBiFC-VC155-target peptide digested by SacI/NheI;Lane4:pBiFC-VN173-complementary peptide digested by SacI/BamHI;M:DL5000 Marker.圖4 重組載體pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽的酶切鑒定Fig.4 Enzyme digestion of recombinant plasmids pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide

    紅色區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)肽(A)或互補(bǔ)肽(B),藍(lán)色區(qū)域?yàn)檩d體序列。The red region represented the target peptide (A) or complementary peptide (B),and the blue region represented the vector sequence.圖3 靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Three-dimensional structure prediction of target peptide and complementary peptide

    A.pBiFC-VC155空載測序圖;B.pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽測序圖;C.pBiFC-VN173空載測序圖;D.pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽測序圖。A.pBiFC-VC155 empty-load sequencing map;B.pBiFC-VC155-target peptide sequence scheme;C.pBiFC-VN173 empty-load sequencing scheme;D.pBiFC-VN173-complementary peptide sequence scheme.圖5 pBiFC-VC155與pBiFC-VN173空載以及pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽重組質(zhì)粒部分測序圖譜Fig.5 Partial sequencing map of pBiFC-VC155,pBiFC-VN173,pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide

    3 討 論

    通常情況下多肽是指由3個(gè)或者3個(gè)以上氨基酸分子組成的肽,寡肽是指氨基酸數(shù)目為2~10個(gè)的生物活性肽,其特點(diǎn)是可以像小分子一樣穿越細(xì)胞膜,通過生理屏障,吸收快速。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要以多肽類藥物的形式參與臨床應(yīng)用,此外,多肽還可以診斷試劑來檢測病毒、細(xì)菌、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體[23]。由于氨基酸序列短,特異性強(qiáng),且易于制備,因此常用作檢測抗原裝配的檢測試劑,其檢測相關(guān)病原微生物抗體的背景和假陽性都很低,易于在臨床上推廣應(yīng)用[24]。當(dāng)前隨著新發(fā)人畜共患病的流行傳播以及城市伴侶動(dòng)物數(shù)量的不斷增多,對病原的快速檢測及質(zhì)量提出了更高的要求,目前的常規(guī)檢查方法已不能滿足現(xiàn)階段的需求,如不及時(shí)作出快速診斷和采取針對性的措施,將會(huì)嚴(yán)重威脅人類公共衛(wèi)生安全[25]。

    本研究基于BiFC技術(shù)研究基于豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)人工設(shè)計(jì)的靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用關(guān)系以及亞細(xì)胞定位,為進(jìn)一步探索在臨床上利用該肽段進(jìn)行抗原檢測提供理論基礎(chǔ)。研究中為了初步了解目標(biāo)多肽的基本理化特性,首先利用生物信息學(xué)技術(shù)對設(shè)計(jì)的靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽的親/疏水性、二/三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測,結(jié)果顯示,靶標(biāo)肽整體呈親水性,二級(jí)結(jié)構(gòu)包含延伸股、無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角、α螺旋;互補(bǔ)肽二級(jí)結(jié)構(gòu)2/3為α螺旋,1/3為無規(guī)則卷曲,表明靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽分別帶有親水性和疏水性結(jié)構(gòu)域,親水性結(jié)構(gòu)域都帶有正負(fù)電荷,能夠產(chǎn)生靜電引力;其次酶切鑒定和測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽和pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽真核表達(dá)質(zhì)粒;最后細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染后靶標(biāo)肽和互補(bǔ)肽能夠在Vero細(xì)胞內(nèi)形成在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光的BiFC復(fù)合物,表明兩者發(fā)生了相互作用;為進(jìn)一步了解該復(fù)合物的基本特性,本研究對其在細(xì)胞內(nèi)的定位情況進(jìn)行了初步研究,間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該BiFC復(fù)合物主要分布于細(xì)胞核中,為進(jìn)一步解析其功能提供了可能。本研究針對靶標(biāo)肽的局部位點(diǎn)人工設(shè)計(jì)出與該位點(diǎn)相互作用的多肽,大大提高了針對性并設(shè)計(jì)出與蛋白質(zhì)不同功能域相互作用的多肽,為進(jìn)一步開發(fā)基于蛋白質(zhì)相互作用的病原檢測新方法和篩選抗PEDV藥物積累了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    A.重組質(zhì)粒pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽單轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞;B.重組質(zhì)粒pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽單轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞;C.pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞;D.pBiFC-bFos-VC155與pBiFC-bJun-VN173共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞(陽性對照);E.pBiFC-VC155與pBiFC-VN173共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞(陰性對照)。A.Transfection of pBiFC-VC155-target peptide into Vero cells;B.Transfection of pBiFC-VN173-complementary peptide into Vero cells;C.Co-transfection of pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide into Vero cells;D.Co-transformation of pBiFC-bFos-VC155 and pBiFC-bJun-VN173 into Vero cells(positive control);E.Co-transformation of pBiFC-VC155 and pBiFC-VN173 into Vero cells(negative control).圖6 pBiFC-VC155-靶標(biāo)肽與pBiFC-VN173-互補(bǔ)肽在Vero細(xì)胞中的雙分子熒光互補(bǔ)Fig.6 BiFC of pBiFC-VC155-target peptide and pBiFC-VN173-complementary peptide in Vero cells

    A.BiFC復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位;B.BiFC復(fù)合物在高爾基體中的定位。A.BiFC complex in the endoplasmic reticulum;B.BiFC complex in the Golgi apparatus.圖7 BiFC復(fù)合物在Vero細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of BiFC complex in Vero cells

    4 結(jié) 論

    本研究選取較為成熟的真核表達(dá)載體pBiFC-VC155與pBiFC-VN173作為骨架載體,將基于豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)合域設(shè)計(jì)的靶標(biāo)肽插入pBiFC-VC155載體中,互補(bǔ)肽插入pBiFC-VN173,構(gòu)建一對真核重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染活細(xì)胞后通過觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào),證實(shí)靶標(biāo)肽與互補(bǔ)肽能在細(xì)胞內(nèi)形成BiFC復(fù)合物,存在相互作用;進(jìn)一步通過間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)該互作復(fù)合物定位在細(xì)胞核內(nèi)。綜上所述,基于豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)構(gòu)位點(diǎn)肽段人工設(shè)計(jì)與之相互作用的多肽方法可行,這為以后利用該肽段進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒抗原檢測和相關(guān)診斷提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持,具有潛在的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

    猜你喜歡
    靶標(biāo)多肽復(fù)合物
    BeXY、MgXY(X、Y=F、Cl、Br)與ClF3和ClOF3形成復(fù)合物的理論研究
    “百靈”一號(hào)超音速大機(jī)動(dòng)靶標(biāo)
    納米除草劑和靶標(biāo)生物的相互作用
    柚皮素磷脂復(fù)合物的制備和表征
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:18
    黃芩苷-小檗堿復(fù)合物的形成規(guī)律
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:18
    高多肽含量苦瓜新品種“多肽3號(hào)”的選育
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    復(fù)雜場景中航天器靶標(biāo)的快速識(shí)別
    前列腺特異性膜抗原為靶標(biāo)的放射免疫治療進(jìn)展
    胎盤多肽超劑量應(yīng)用致嚴(yán)重不良事件1例
    久久九九热精品免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 99精品欧美一区二区三区四区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲美女黄片视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产成人av教育| 两个人看的免费小视频| 国产午夜福利久久久久久| 久久亚洲精品不卡| 国产精品久久视频播放| 亚洲avbb在线观看| 成人国产综合亚洲| 精品国产三级普通话版| 嫩草影院入口| 级片在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 五月玫瑰六月丁香| 欧美乱妇无乱码| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜两性在线视频| 一区福利在线观看| 午夜福利在线观看吧| 午夜福利成人在线免费观看| 婷婷精品国产亚洲av| 久久人人精品亚洲av| 综合色av麻豆| 欧美丝袜亚洲另类 | 91av网站免费观看| 欧美黄色淫秽网站| 国产毛片a区久久久久| 国产男靠女视频免费网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产成年人精品一区二区| 国产成人影院久久av| 国产精品永久免费网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 色视频www国产| 99久久精品一区二区三区| av在线蜜桃| 五月玫瑰六月丁香| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品一区二区免费欧美| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品一区二区三区四区久久| 在线观看免费午夜福利视频| 成人一区二区视频在线观看| 男人舔奶头视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99精品久久久久人妻精品| 99热这里只有是精品50| 亚洲中文字幕日韩| 变态另类丝袜制服| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日本精品一区二区三区蜜桃| 熟女人妻精品中文字幕| 一区二区三区国产精品乱码| 2021天堂中文幕一二区在线观| or卡值多少钱| 无人区码免费观看不卡| 麻豆一二三区av精品| 999久久久精品免费观看国产| 国产成年人精品一区二区| 香蕉国产在线看| 天堂网av新在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 97超视频在线观看视频| 国产成人aa在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久人人精品亚洲av| 日本免费a在线| 女人被狂操c到高潮| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜福利18| 欧美日韩乱码在线| 国产精品永久免费网站| 熟女电影av网| 色综合站精品国产| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 99re在线观看精品视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩免费av在线播放| 久久精品综合一区二区三区| www国产在线视频色| 日韩国内少妇激情av| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美大码av| 日本黄色视频三级网站网址| 精品久久久久久久毛片微露脸| 在线免费观看不下载黄p国产 | 精品久久久久久久末码| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品久久久av美女十八| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美极品一区二区三区四区| 超碰成人久久| 午夜视频精品福利| 露出奶头的视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 美女免费视频网站| 男人的好看免费观看在线视频| 国产精品一区二区免费欧美| 老熟妇仑乱视频hdxx| 淫秽高清视频在线观看| 99热这里只有精品一区 | 黄频高清免费视频| 99久国产av精品| 国产成人av激情在线播放| 在线观看66精品国产| 国产精品一及| 亚洲人成伊人成综合网2020| 网址你懂的国产日韩在线| 香蕉av资源在线| 久久九九热精品免费| 国产激情偷乱视频一区二区| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美激情在线99| www.熟女人妻精品国产| 好男人电影高清在线观看| 成在线人永久免费视频| 香蕉丝袜av| 欧美丝袜亚洲另类 | 麻豆国产97在线/欧美| 九色国产91popny在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 免费在线观看影片大全网站| 波多野结衣高清作品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜免费激情av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产免费男女视频| 国产精品99久久久久久久久| 国产乱人伦免费视频| 男女午夜视频在线观看| 久久久久久久午夜电影| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产1区2区3区精品| 999精品在线视频| 香蕉av资源在线| 色播亚洲综合网| 狂野欧美激情性xxxx| 韩国av一区二区三区四区| 91字幕亚洲| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜福利成人在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲自拍偷在线| 国产三级黄色录像| 最近最新免费中文字幕在线| 日本黄色片子视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 日本黄大片高清| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| x7x7x7水蜜桃| 一级毛片精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品国产清高在天天线| 日韩欧美免费精品| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 午夜福利18| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人欧美大片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线观看日韩欧美| 亚洲专区国产一区二区| 最近视频中文字幕2019在线8| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 色综合站精品国产| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女免费视频网站| 美女 人体艺术 gogo| www日本在线高清视频| 国产精品,欧美在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品福利观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品久久久久久,| a在线观看视频网站| 人人妻人人看人人澡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 老司机午夜十八禁免费视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日本在线视频免费播放| 少妇人妻一区二区三区视频| av女优亚洲男人天堂 | 成在线人永久免费视频| 看免费av毛片| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲国产欧美人成| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 三级毛片av免费| 中文字幕高清在线视频| 此物有八面人人有两片| 国产精品av久久久久免费| 日本黄色片子视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 美女黄网站色视频| 在线观看日韩欧美| 久久久久久久久中文| 日韩成人在线观看一区二区三区| 制服丝袜大香蕉在线| 免费看日本二区| 老司机在亚洲福利影院| 色综合亚洲欧美另类图片| 青草久久国产| 欧美高清成人免费视频www| 久久国产乱子伦精品免费另类| 一个人免费在线观看电影 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久国产欧美日韩av| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久性生活片| 91九色精品人成在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲av第一区精品v没综合| 美女扒开内裤让男人捅视频| 曰老女人黄片| avwww免费| 国产成人影院久久av| 国产精品一区二区免费欧美| 色哟哟哟哟哟哟| 成人特级av手机在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| a级毛片a级免费在线| 国产高清videossex| 最好的美女福利视频网| 色播亚洲综合网| 成年女人毛片免费观看观看9| 色播亚洲综合网| 成人18禁在线播放| ponron亚洲| 亚洲av熟女| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 波多野结衣高清无吗| 久久亚洲真实| 少妇的逼水好多| 男人舔奶头视频| 久久久久久久精品吃奶| 丝袜人妻中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久| 午夜视频精品福利| 69av精品久久久久久| 成人一区二区视频在线观看| www日本黄色视频网| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一本综合久久免费| 日韩欧美三级三区| aaaaa片日本免费| 一区二区三区国产精品乱码| 此物有八面人人有两片| 淫秽高清视频在线观看| 国产97色在线日韩免费| 成人永久免费在线观看视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美黑人巨大hd| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国内精品美女久久久久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 麻豆成人午夜福利视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲美女黄片视频| 午夜福利在线观看吧| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜a级毛片| 老鸭窝网址在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜两性在线视频| 久久久久国内视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 一级黄色大片毛片| 免费人成视频x8x8入口观看| 无限看片的www在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 国产高清三级在线| 国产精品,欧美在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一本一本综合久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久亚洲真实| 欧美日韩精品网址| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲最大成人中文| 欧美激情在线99| 欧美乱色亚洲激情| 日本免费a在线| 欧美日本视频| 久久久久久大精品| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精品美女久久av网站| 天堂影院成人在线观看| 国产高清激情床上av| 99久国产av精品| 日本与韩国留学比较| 亚洲人与动物交配视频| 国产三级中文精品| 热99re8久久精品国产| 12—13女人毛片做爰片一| 一边摸一边抽搐一进一小说| 黄色日韩在线| 麻豆av在线久日| 国产精品国产高清国产av| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 成年女人看的毛片在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲精品在线美女| 一本一本综合久久| 两个人的视频大全免费| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲专区中文字幕在线| 美女cb高潮喷水在线观看 | 在线免费观看不下载黄p国产 | 午夜福利成人在线免费观看| 午夜福利欧美成人| 国产激情久久老熟女| av国产免费在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲真实伦在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品综合久久久久久久免费| 最近在线观看免费完整版| 亚洲熟女毛片儿| 久久亚洲真实| 女同久久另类99精品国产91| 美女cb高潮喷水在线观看 | 两人在一起打扑克的视频| 好男人电影高清在线观看| 国产美女午夜福利| 亚洲精品在线观看二区| 最新在线观看一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人亚洲精品av一区二区| 国产一区在线观看成人免费| 日本三级黄在线观看| avwww免费| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产av一区在线观看免费| 国产主播在线观看一区二区| 国产高清videossex| 久久精品国产清高在天天线| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产高清视频在线观看网站| 国产1区2区3区精品| 久久精品综合一区二区三区| 国产亚洲精品一区二区www| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国内精品一区二区在线观看| a级毛片在线看网站| 国产黄片美女视频| 又大又爽又粗| 欧美日韩黄片免| 好男人在线观看高清免费视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美日韩一级在线毛片| av天堂在线播放| 美女高潮的动态| 成人三级黄色视频| 色尼玛亚洲综合影院| 精品国产美女av久久久久小说| 黄色丝袜av网址大全| 18禁国产床啪视频网站| 中文字幕最新亚洲高清| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产成人av激情在线播放| 变态另类丝袜制服| 国产亚洲精品av在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲av第一区精品v没综合| 色老头精品视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 麻豆成人av在线观看| 国产精华一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 在线看三级毛片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 99久久无色码亚洲精品果冻| 看黄色毛片网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美日韩福利视频一区二区| h日本视频在线播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美激情久久久久久爽电影| 色精品久久人妻99蜜桃| 身体一侧抽搐| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲人成网站高清观看| 欧美性猛交黑人性爽| 韩国av一区二区三区四区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 青草久久国产| 久久欧美精品欧美久久欧美| 色av中文字幕| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕高清在线视频| 成人午夜高清在线视频| 国产精品久久久久久久电影 | 成人欧美大片| 免费观看人在逋| 婷婷亚洲欧美| 两性夫妻黄色片| 久久精品人妻少妇| 99久国产av精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产精品久久久人人做人人爽| 美女午夜性视频免费| 丝袜人妻中文字幕| 欧美乱码精品一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产高清videossex| 久久天堂一区二区三区四区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 村上凉子中文字幕在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 母亲3免费完整高清在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 午夜福利免费观看在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 免费电影在线观看免费观看| 99热6这里只有精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 99热6这里只有精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 悠悠久久av| 亚洲欧美日韩高清专用| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久久久精品吃奶| 香蕉久久夜色| 午夜福利免费观看在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜免费观看网址| 中出人妻视频一区二区| 亚洲真实伦在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 国产午夜福利久久久久久| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 88av欧美| 国产精品一区二区免费欧美| 香蕉av资源在线| www.熟女人妻精品国产| 国产高清激情床上av| 国产激情久久老熟女| 午夜福利欧美成人| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一a级毛片在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 麻豆国产av国片精品| 久久人人精品亚洲av| 精品久久久久久久久久久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一个人看视频在线观看www免费 | 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲九九香蕉| 又紧又爽又黄一区二区| 99热6这里只有精品| 国产主播在线观看一区二区| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美激情在线99| 999精品在线视频| 性欧美人与动物交配| 免费电影在线观看免费观看| 在线观看舔阴道视频| 国产精品久久视频播放| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲国产中文字幕在线视频| 成年女人永久免费观看视频| 成年版毛片免费区| 精品熟女少妇八av免费久了| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线观看66精品国产| 操出白浆在线播放| av欧美777| 久久久精品大字幕| 91av网站免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产91精品成人一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美又色又爽又黄视频| av黄色大香蕉| 综合色av麻豆| 黄色成人免费大全| 热99re8久久精品国产| 国产免费av片在线观看野外av| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品 国内视频| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产主播在线观看一区二区| 中文字幕高清在线视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜免费成人在线视频| 欧美大码av| 久久中文字幕人妻熟女| 成人特级黄色片久久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av | 免费av不卡在线播放| 99久久国产精品久久久| 国产主播在线观看一区二区| 少妇的逼水好多| 日本 欧美在线| 成人国产一区最新在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品九九99| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲激情在线av| 一本综合久久免费| 香蕉国产在线看| 国产一区在线观看成人免费| 窝窝影院91人妻| 久久亚洲真实| 欧美又色又爽又黄视频| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品女同一区二区软件 | 国产单亲对白刺激| 国产欧美日韩精品亚洲av| 色老头精品视频在线观看| 一进一出抽搐动态| 亚洲激情在线av| 国产熟女xx| 好男人在线观看高清免费视频| 在线观看一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜影院日韩av| 91老司机精品| 欧美成人性av电影在线观看| 久久精品人妻少妇| 久久国产精品人妻蜜桃| 91在线精品国自产拍蜜月 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国语自产精品视频在线第100页| 久久这里只有精品19| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品99久久久久久久久| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日本黄色片子视频| 久久精品影院6| 国产乱人伦免费视频| 精品无人区乱码1区二区| 黄片小视频在线播放| 亚洲最大成人中文| 国产麻豆成人av免费视频| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 在线免费观看的www视频| 国产毛片a区久久久久| 很黄的视频免费| 男女床上黄色一级片免费看| 白带黄色成豆腐渣|