中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在肺部疾病中作用的研究進(jìn)展

丁 雨，吳 艷，卞 濤

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院 呼吸與危重癥科，江蘇 無(wú)錫 214023

中性粒細(xì)胞是對(duì)抗入侵病原體的第一道防線，同時(shí)也是參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答、急性損傷修復(fù)、腫瘤等發(fā)生發(fā)展的免疫細(xì)胞。中性粒細(xì)胞受刺激后，可通過(guò)吞噬、脫顆粒等方式發(fā)揮作用；近年來(lái)發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞是以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酶依賴(lài)為主要方式釋放裝飾有抗菌顆粒蛋白的解凝染色質(zhì)而發(fā)揮作用的，并將其稱(chēng)為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)，這一過(guò)程被稱(chēng)為“NETosis”。最初發(fā)現(xiàn)NETs時(shí)，認(rèn)為其主要發(fā)揮中性粒細(xì)胞的傳統(tǒng)功能，即殺滅病原體和對(duì)抗感染，但越來(lái)越多的研究表明大量中性粒細(xì)胞的NETs反應(yīng)與許多疾病的不良預(yù)后有關(guān)，特別是新型冠狀病毒肺炎/感染(corona virus disease 2019,COVID-19)、細(xì)菌性肺炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘和肺部轉(zhuǎn)移性腫瘤等肺部疾病。

1 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)概述

1.1 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的形成

NETs首次于2004年被發(fā)現(xiàn)并描述，病原體侵入肺部時(shí)，活化的中性粒細(xì)胞發(fā)揮抗感染的作用，除吞噬、脫顆粒外，同時(shí)也釋放出NETs[1]。至今為止，除病原體外，佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macro-phage colony-stimulating factor，GM-CSF)、一氧化氮、自身免疫相關(guān)抗體以及血小板等均可刺激中性粒細(xì)胞發(fā)生NETosis。刺激因素不同，NETs成分有差異，但NETs始終包含一組固定的蛋白質(zhì)，如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、瓜氨酸組蛋白 3 (citrul-line histone 3，CITH3)、鈣保護(hù)素、α-防御素、抗菌肽和細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)等[2]。

中性粒細(xì)胞受到刺激后，細(xì)胞膜上受體如G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors,GPCRs)，趨化因子和細(xì)胞因子受體、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)和Fc受體將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，氧化產(chǎn)物的上游分子Raf-MEK-ERK通路啟動(dòng)，隨后的下游信號(hào)NADPH氧化酶復(fù)合物激活。NETs的形成依賴(lài)于細(xì)胞骨架重排、糖酵解產(chǎn)生的ATP與線粒體功能障礙和NADPH氧化酶復(fù)合物激活狀態(tài)下產(chǎn)生的高濃度活性氧(reactive oxygen species，ROS)[3]。ROS產(chǎn)生后，NE從膜相關(guān)復(fù)合物解離到細(xì)胞質(zhì)中，并以依賴(lài)MPO的方式激活其蛋白水解活性,隨后，NE轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，NE和MPO驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)解凝和組蛋白切割，這可以由依賴(lài)肽?；彼崦搧啺访?(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)的組蛋白瓜氨酸化支持,此外，也有NE和PAD4各自獨(dú)立參與的途徑被描述[4]。抑制白細(xì)胞信號(hào)抑制受體-1可以在不影響氧化產(chǎn)物的情況下阻止NETs的產(chǎn)生,最終的細(xì)胞裂解和NETs釋放涉及GasderminD，它能夠在顆粒和質(zhì)膜上形成孔，染色質(zhì)和抗菌蛋白組成的混合物以囊泡的形式從中性粒細(xì)胞釋放到胞外，形成NETs，這種NETs的形成最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，通常被描述為溶解性NET釋放或NETosis,此過(guò)程一般需要3～8 h,是NETs形成的主要方式[5]。

1.2 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的降解

NETs可以被脫氧核糖核酸酶(DNase)降解，生理量的DNase不足以在體外完全降解NETs，樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在NETs的降解中發(fā)揮著重要作用，巨噬細(xì)胞以依賴(lài)抗菌肽LL-37復(fù)合物的方式吞噬NETs，巨噬細(xì)胞對(duì)NETs的降解依賴(lài)于TREX1(也稱(chēng)為DNaseⅢ)、DNase1和DNase1L3，其中，DNase1L3由樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生,DNase1L3與DNaseI一起成為重要的細(xì)胞外NETs降解核酸酶，TREX1參與巨噬細(xì)胞吞噬NETs后的細(xì)胞內(nèi)降解[6]。關(guān)于NETs這些細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的具體清除機(jī)制，目前所知甚少。因此，探索NETs清除和降解的機(jī)制可能有助于理解炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病，并為未來(lái)的治療提供新思路。

2 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)與感染性肺部疾病

2.1 抑制NETs可有效控制病毒感染

在感染性肺部疾病中，NETs的產(chǎn)生增強(qiáng)和清除不足是導(dǎo)致組織損傷的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，當(dāng)前的COVID-19大流行背景突出了探索NETs的重要性。COVID-19危重患者血清誘導(dǎo)NETs釋放[7]，NETs與炎性反應(yīng)嚴(yán)重程度和免疫介導(dǎo)的微血栓相關(guān)，并且可預(yù)測(cè)不良預(yù)后[8]。

首先，在病毒入侵和輕微癥狀的初始階段，NETs的主要成分NE從細(xì)胞表面切割S蛋白進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)病毒的感染性[9]。同時(shí)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS，加重免疫反應(yīng)。ROS進(jìn)一步促進(jìn)NETs的產(chǎn)生，NETs捕獲病毒并阻止其傳播。在涉及凝血異常和呼吸道癥狀的第二階段，NETs的細(xì)胞外陽(yáng)離子組蛋白，發(fā)揮細(xì)胞毒活性，促進(jìn)IL-1β的生成，并通過(guò)激活TLR2、TLR4和TLR9介導(dǎo)促炎作用[10]。NETs能增強(qiáng)各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括IL-1β和TNF-α，以增強(qiáng)炎性反應(yīng)。此外，IL-1β和TNF-α作為主要激活因子，誘導(dǎo)IL-6水平升高[11]。NETs成分也可以通過(guò)炎性小體激活物和損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)介導(dǎo)補(bǔ)體激活促進(jìn)炎性反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和纖維化,近期發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2可通過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)和絲氨酸蛋白酶活性軸刺激中性粒細(xì)胞釋放NETs, NETs直接誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞死亡[12]。在全身血栓形成和炎性反應(yīng)的第三階段，隨著炎性反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，更多的中性粒細(xì)胞被招募，巨噬細(xì)胞清除NETs的能力受損，二者共同導(dǎo)致了高水平的NETs。NETs的抗菌肽LL-37和MPO引起免疫細(xì)胞趨化并使巨噬細(xì)胞極化成M1型巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞分泌促炎物質(zhì)加重炎性反應(yīng)和肺損傷[13]。此外，NETs通過(guò)TLR4/TLR9/NF-κB信號(hào)通路觸發(fā)巨噬細(xì)胞中NLRP3炎性小體激活和IL-1β釋放,隨后，大量的細(xì)胞因子又反過(guò)來(lái)促進(jìn)了NETs的產(chǎn)生[14]。表明作用于巨噬細(xì)胞的NETs與促炎細(xì)胞因子的增加有關(guān)，而促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致了NETs形成的失調(diào)，進(jìn)一步形成細(xì)胞因子風(fēng)暴，維持異常的全身炎性反應(yīng)。

事實(shí)上，抑制中性粒細(xì)胞和NETs在各種流感病毒相關(guān)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)中具有保護(hù)作用，其他大流行性病毒，包括H1N1流感、SARS冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒，都與感染部位的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和ARDS的發(fā)展有關(guān)。因此，抑制NETs是治療包括COVID-19在內(nèi)的病毒性感染的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

2.2 細(xì)菌降解NETs實(shí)現(xiàn)免疫逃逸

NETs在幾種與細(xì)菌相關(guān)的肺部疾病中發(fā)揮抗感染的作用，一些細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出了避免被NETs捕獲和殺死的策略。例如：銅綠假單胞菌是臨床上導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要條件[15]，嚴(yán)重的銅綠假單胞菌感染在免疫功能低下的個(gè)體中普遍存在，包括中性粒細(xì)胞減少、嚴(yán)重?zé)齻?、囊性纖維化和慢性阻塞性肺疾病患者，此外，銅綠假單胞菌導(dǎo)致的機(jī)械通氣相關(guān)肺炎在危重患者導(dǎo)致高發(fā)病率和病死率。銅綠假單胞菌分泌大量的胞外蛋白酶，使其能夠逃脫宿主的免疫攻擊，如彈性蛋白酶和堿性蛋白酶(AprA)。AprA是一種由Ⅰ型分泌系統(tǒng)分泌的金屬蛋白酶。首先，AprA降解NETs組分，幫助介導(dǎo)銅綠假單胞菌的免疫逃逸。其次，AprA誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，抗體作為激動(dòng)劑，又增強(qiáng)AprA的活性，進(jìn)一步幫助逃脫，但銅綠假單胞菌逃脫NETs殺傷的更加確切的機(jī)制尚不明確[16]。因此，針對(duì)其他銅綠假單胞菌產(chǎn)生的酶抗體是否也有類(lèi)似的效應(yīng)，還有待進(jìn)一步研究。

3 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)與慢性氣道炎性疾病

3.1 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)

COPD發(fā)病率、病死率和所致的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)是全球共同關(guān)注的重大問(wèn)題,中性粒細(xì)胞被認(rèn)為是COPD患者氣道炎性反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)。尤其是Ig樣凝集素F (SiglecF)中性粒細(xì)胞在加重氣道炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用?？諝馕廴疚锿ㄟ^(guò)細(xì)胞外三磷酸腺苷傳遞DAMP信號(hào)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞上SiglecF的表達(dá)，中性粒細(xì)胞釋放NETs和產(chǎn)生半胱氨酰白三烯來(lái)促進(jìn)2型和3型免疫應(yīng)答，加重COPD氣道炎性反應(yīng)[17]。

目前，使用支氣管擴(kuò)張劑和糖皮質(zhì)激素是治療COPD主要的治療方法。在慢性炎性反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程中，COPD患者的嚴(yán)重程度與氣道內(nèi)NETs水平呈正相關(guān)，因此，新型NETs靶向療法可能是治療COPD的一種富有前景的方法，但直接靶向NETs是否能抑制COPD患者的病情發(fā)展，目前尚不清楚。

3.2 支氣管哮喘

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎性反應(yīng)起關(guān)鍵作用的異質(zhì)性疾病,當(dāng)各種過(guò)敏原刺激機(jī)體時(shí)，循環(huán)中的中性粒細(xì)胞在IL-6、IL-8等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下聚集到氣道浸潤(rùn)并激活[18]。LPS誘導(dǎo)形成的NETs可以直接或間接地?fù)p傷了肺上皮緊密連接蛋白o(hù)ccludin，加劇中性粒細(xì)胞為主導(dǎo)的過(guò)敏性氣道炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度，由此推斷NETs可能是通過(guò)破壞肺上皮的緊密連接參與嚴(yán)重哮喘發(fā)病機(jī)制[19]。NETs也刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，促進(jìn)中性粒細(xì)胞在氣道的浸潤(rùn)，浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，可放大NETs和巨噬細(xì)胞造成的組織損傷，誘導(dǎo)和加重中性粒細(xì)胞型哮喘(neutrophil-dominated asthma，NA)，即NETs通過(guò)巨噬細(xì)胞促進(jìn)NA發(fā)病[20]。此外，嗜酸細(xì)胞胞外陷阱(eosinophil extracellular traps，EETs)與嗜酸粒細(xì)胞型哮喘嚴(yán)重程度有關(guān)，EETs通過(guò)整合免疫和神經(jīng)信號(hào)以推動(dòng)哮喘進(jìn)展[21]。

在治療方面，研究發(fā)現(xiàn)哮喘以循環(huán)中CITH3增加為特征，這可能與細(xì)胞胞外陷阱(ETs)形成有關(guān)。抑制ETs可能是特定哮喘表型(如中性粒細(xì)胞哮喘)的治療選擇，這也為治療哮喘提供了新的思路。

4 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)與腫瘤相關(guān)性肺部疾病

在小鼠和人類(lèi)中，中性粒細(xì)胞是主要的白細(xì)胞群體，中性粒細(xì)胞在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。晚期肺癌和結(jié)腸癌患者體內(nèi)循環(huán)NETs水平升高，利用小鼠肺癌和結(jié)腸癌模型，發(fā)現(xiàn)阻斷NETosis顯著抑制肺和肝臟的自發(fā)轉(zhuǎn)移。此外，乳腺癌細(xì)胞分泌的組織蛋白酶C(tumor-secreted protease cathepsin C，CTSC)通過(guò)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的募集和NETs的形成促進(jìn)了乳腺到肺的轉(zhuǎn)移。同時(shí)揭示了一個(gè)有趣的新途徑，CTSC激活中性粒細(xì)胞膜結(jié)合蛋白酶3(PR3)，從而促進(jìn)IL-1β加工和NF-κB活化，最終上調(diào)IL-6和CCL3促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集。CTSC-PR3-IL-1β軸誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和NETs的形成，這可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在肺部的轉(zhuǎn)移，抑制CTSC可以抑制實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移[22]。但目前尚不清楚靶向CTSC-PR3-IL-1β-NET通路的療效是否僅限于防止肺轉(zhuǎn)移，還是也可以防止其他組織的轉(zhuǎn)移,該研究為今后的臨床相關(guān)研究指明了方向。

除了發(fā)現(xiàn)NETs在癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用外，肺癌細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式高遷移率族蛋白B1(HMGB1)，HMGB1也促進(jìn)了NETs的形成[23]。肺癌中細(xì)胞外RNA和NETs存在交互作用，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞比正常肺泡細(xì)胞有更高水平的和NETs相關(guān)的lncRNA,經(jīng)NETs刺激后，lncRNA表達(dá)明顯增加,共12種NETs相關(guān)的lncRNA可以作為預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者生存的分子標(biāo)志物[24]。

綜上所述，表明NETs靶向治療可能限制轉(zhuǎn)移和原發(fā)性肺癌，這些已在小鼠模型中得到證實(shí)。但同時(shí)，人類(lèi)中性粒細(xì)胞和小鼠中性粒細(xì)胞釋放NETs的能力明顯不同，在研究腫瘤NETosis(中性粒細(xì)胞的炎性細(xì)胞死亡方式)時(shí)應(yīng)考慮物種間差異，并且目前為止還沒(méi)有臨床試驗(yàn)來(lái)評(píng)估靶向NETs對(duì)癌進(jìn)展的影響。這些開(kāi)創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)還需開(kāi)展臨床試驗(yàn)，以確定NETs靶向療法是否可以減少轉(zhuǎn)移。

5 問(wèn)題與展望

自發(fā)現(xiàn)NETs，關(guān)于NETs的形成和作用機(jī)制在肺部疾病中的研究越來(lái)越多，新型冠狀病毒疫情的暴發(fā)更進(jìn)一步推動(dòng)了該方面的研究。NETs發(fā)揮著雙刃劍作用：NETs在疾病的早期階段發(fā)揮抗感染作用，然而，在疾病的晚期階段，NETs的抗菌成分不再能夠?qū)垢腥?，而是造成自身組織損傷，因此，維持NETs平衡成為治療肺部疾病的關(guān)鍵，促進(jìn)研發(fā)更多潛在藥物，如選擇性NETs形成抑制劑或NETs相關(guān)蛋白抑制劑等，可以防止NETs對(duì)患者的有害影響，這可能將成為新興的治療手段。此外，目前的體外研究，多數(shù)是以非生理因素如PMA觸發(fā)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，很可能不能代表體內(nèi)的情況，并且在同一疾病的不同階段，對(duì)NETs的研究很少，因此，進(jìn)行更多的關(guān)于NETs對(duì)不同時(shí)期肺部疾病的研究也有助于加強(qiáng)對(duì)肺部疾病發(fā)病機(jī)制的理解，指導(dǎo)未來(lái)治療的發(fā)展。