Box-Behnken響應面設計法優(yōu)化商陸鮮制飲片工藝

王海燕，陳 重，余春生，楊俊杰

（1.信陽農(nóng)林學院制藥工程學院，河南 信陽 464000；2.武漢禾元生物科技股份有限公司，武漢 430074）

商陸為商陸科植物商陸（Phytolacca acinosaRoxb.）或垂序商陸（Phytolacca amerrcanaL.）的干燥根［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是一種應用歷史悠久的中草藥，有逐水消腫、通利二便、解毒散結的功能。商陸藥材在獸用方面有廣泛的用途，特別是用于家禽類泌尿系統(tǒng)感染方面［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，不同商陸提取物均能降低血清UA、Cr、腎組織NO 水平及腎指數(shù)，對雞腎腫癥有較好的治療效果［3］。商陸總皂苷對癌性腹水模型小鼠具祛腹水作用［4］，商陸皂苷甲對哮喘小鼠氣道炎癥有緩解作用［5］，抑制Aβ誘導的原代小膠質(zhì)細胞炎癥反應［6］，為商陸的有效成分，也是商陸質(zhì)量評價的指標性成分。

商陸為多年生草本，根莖肥大，干燥后切片困難，故在產(chǎn)地采收過程中，通常把商陸切成厚片或段，便于干燥，再加工成不同規(guī)格飲片，干燥方法［7］和不同飲片［8］所含化學成分及藥理效應有顯著差異。商陸藥材在加工成飲片的過程中，由于產(chǎn)地加工片過厚，不利于調(diào)劑，需要重新潤濕，薄切，干燥。產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)和炮制環(huán)節(jié)的重復操作，會造成有效成分的損失；另外商陸藥材貯藏運輸過程中，極易霉變，影響藥材質(zhì)量和用藥安全。將中藥材產(chǎn)地加工與中藥炮制一體化（“一體化”工藝），從鮮藥材直接加工成飲片，以減少中間重復環(huán)節(jié)，可以保證中藥飲片質(zhì)量。楊俊杰等［9，10］對商陸產(chǎn)地加工和炮制的現(xiàn)代研究進展進行系統(tǒng)梳理，但有關商陸鮮制飲片的具體操作工藝及系統(tǒng)加工參數(shù)未見報道，趁鮮切制工藝方面的研究尚屬空白。

本試驗采用商陸總皂苷和商陸皂苷甲含量的綜合評分為評價指標，運用Box-Behnken 響應面設計法，考察商陸鮮品切制厚度、干燥溫度、干燥時間3個因素的交互影響，確定商陸的鮮制飲片加工工藝，以期為商陸飲片的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Agilent1100 型高效液相色譜儀（VWD 紫外檢測器，Agilent 化學工作站），購自美國安捷倫科技有限公司；UV1901 型紫外-可見分光光度計，購自北京普析通用有限公司；電子分析天平，購自瑞士梅特勒公司。

1.2 主要藥品與試劑

商陸于2021 年11 月在信陽市平橋區(qū)丘陵坡地采挖，經(jīng)信陽農(nóng)林學院周巍副教授鑒定為商陸科植物垂序商陸的新鮮根莖；商陸皂苷甲對照品（HPLC≥98%，批號為ZY151023），購自上海譜振生物科技有限公司；葡萄糖對照品（批號為GBW10062），購自中國計量科學院；乙腈為色譜純；試驗用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

1.3 商陸總皂苷的測定

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取商陸皂苷甲對照品適量，用甲醇配制成濃度為1.98 mg/mL 的對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備 取商陸粗粉約4 g，精密稱定，加95%乙醇80 mL，用索氏提取器連續(xù)回流6 h。減壓濃縮至10 mL，取出，加入5 g 硅藻土拌勻，于水浴鍋上揮干。將殘渣置于100 mL 錐形瓶中，加50 mL 用水飽和的正丁醇，超聲提取40 min，過濾，將濾液減壓濃縮至干，用少量甲醇溶解殘渣，10 mL 容量瓶定容，過濾，取續(xù)濾液1 mL，用甲醇定容至10 mL，即得。

1.3.3 線性范圍考察 精密移取商陸皂苷甲對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加甲醇補足至1.0 mL，加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，77%硫酸8.5 mL，60 ℃水浴恒溫保持10 min，再置冰水浴中15 min。用紫外-可見分光光度計于450 nm 處測定吸光度（A），以吸光度對濃度進行線性回歸，得到回歸方程A=3.354 2C+0.130 6（r=0.999 5）。結果表明，商陸皂苷甲在0.019 8～0.198 0 mg/mL 濃度范圍與吸光度線性關系良好。

1.3.4 精密度試驗 精密移取對照品溶液1.0 mL，按“1.3.3”方法顯色、測定吸光度6 次，結果RSD為1.32%，表明儀器精密度良好。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密移取供試品溶液1.0 mL，按“1.3.3”方法顯色，顯色后每隔5 min 測定1 次，共7次。結果RSD為1.61%，表明該供試品溶液顯色后30 min 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.6 重復性試驗 取同一批次商陸樣品6 份，按“1.3.2”供試品溶液制備方法和“1.3.3”顯色方法，分別測定計算總皂苷含量，結果RSD為1.37%，表明該方法重復性良好。

1.3.7 加樣回收率試驗 取商陸樣品（總皂苷質(zhì)量分數(shù)1.762%）約2.0 g，共6 份，精密稱定，分別加入商陸皂苷甲對照品約10 mg，測定樣品中總皂苷含量，由表1 可知，平均回收率為99.85%，RSD為1.46%，表明該方法準確可靠。

表1 商陸總皂苷加樣回收試驗結果

1.4 商陸皂苷甲的含量測定

1.4.1 色譜條件 PM 952505-C18 色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），以含甲酸（0.1%）的乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B，按照表2 所示方法進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫30 ℃，進樣量為20 μL，理論塔板數(shù)按商陸皂苷甲計不低于3 000。

表2 商陸皂苷甲含量測定梯度洗脫條件

1.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取商陸皂苷甲對照品5.2 mg，用甲醇定容至10 mL 容量瓶，制得濃度為0.52 mg/mL 的商陸皂苷甲對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 取商陸粗粉約2 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱重，超聲處理（500 W，40 kHz）40 min，放冷，用50%甲醇補足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液得。

1.4.4 線性關系考察 精密吸取“1.4.2”對照品溶液，分別進樣3、6、9、12、15 μL 注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，以峰面積的積分值（A）為縱坐標、對照品進樣量（m）為橫坐標，進行線性回歸，得到回歸方程A=1.430 2m+9.311 8（r=0.999 8），表明商陸皂苷甲在1.56～7.80 μg 線性關系良好。

1.4.5 精密度試驗 精密吸取0.52 mg/mL 商陸皂苷甲對照品溶液進樣20 μL，重復進樣5 次，以峰面積計算RSD，RSD為1.70%，表明該儀器精密度良好。

1.4.6 穩(wěn)定性試驗 取商陸樣品粗粉約2 g，精密稱定，按“1.4.3”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h 測 定 商 陸 皂 苷 甲 含 量，結 果RSD為0.36%，表明該方法在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.4.7 重復性試驗 取商陸樣品粗粉2 g，按“1.4.3”方法制備供試品溶液，平行試驗6 份，結果樣品中商陸皂苷甲含量的RSD為1.42%，表明該方法重復性良好。

1.4.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量（0.473%）的商陸粗粉共6 份，每份約0.5 g，分別加入商陸皂苷甲對照品約2 mg，按“1.4.3”方法制備供試品溶液，測定商陸皂苷甲含量，計算加樣回收率，結果見表3，平均回收率為100.74%，RSD為1.31%，表明該方法準確可靠。

表3 商陸皂苷甲加樣回收試驗結果

1.5 綜合評分方法

《中華人民共和國藥典》（2020 年版）規(guī)定商陸的指標性成分為商陸皂苷甲，以干燥品計算，不得少于0.15%。商陸的有效成分主要為商陸總皂苷，加工過程中會伴有商陸皂苷的轉(zhuǎn)化，影響到商陸皂苷甲的含量。故將商陸皂苷甲和商陸總皂苷作為評價指標，綜合考慮。指標評分具體公式如下。

式中，X為總皂苷含量（%），Xmax為正交試驗設計9 組試驗中總皂苷含量的最大值，Y為商陸皂苷甲含量（%），Ymax為商陸皂苷甲含量的最大值。

1.6 單因素考察

1.6.1 切片厚度考察 商陸在產(chǎn)地加工過程中，為方便干燥保存，一般切成5 cm 左右的厚片，待飲片廠收購后再重新潤透、薄切，以利于調(diào)劑使用。本試驗選擇的切片厚度分別為1、3、5 mm。取新鮮商陸用多功能切藥機按照上述厚度切片，分別取3 份樣品，于55 ℃干燥，粉碎后進行測定。

1.6.2 干燥時間選擇 切片越厚，干燥需時越長。因此選擇5 mm 片作為考察干燥時間的樣品厚度，在不同溫度下35、45、55、65、75 ℃干燥，分別于不同時間點2、4、8、12、16 h 取樣、粉碎，測定含量。

1.6.3 干燥溫度選擇 取新鮮商陸，切3 mm 厚片，分別取3 份于35、45、55、65、75 ℃下干燥。取飲片粉碎，過二號篩，測定各指標含量。

1.7 Box-Behnken 響應面設計

選擇切片厚度（A）、干燥溫度（B）、干燥時間（C）3 個因素作為自變量，以商陸總皂苷、商陸皂苷甲含量2 個指標的綜合評分為效應值，根據(jù)Box-Behnken響應面設計原理，運用3 因素3 水平的響應面設計法進行分析。在單因素試驗結果的基礎上，確定Box-Behnken 響應面設計因素水平見表4。

表4 試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 單因素考察結果

2.1.1 切片厚度考察結果 切片厚度考察結果如表5所示。結果表明，當商陸飲片厚度增大時，商陸總皂苷、商陸皂苷甲含量明顯增加，在3 mm 時各指標性成分含量較高，且片形較好，不易造成碎片，因此選擇3 mm 作為考察水平。

表5 切片厚度對商陸有效成分含量的影響

2.1.2 干燥溫度考察結果 干燥溫度考察結果如表6所示。在55 ℃時，商陸飲片指標性成分的含量都較高，且干燥時間較短，適于大量生產(chǎn)，因此，商陸飲片于55 ℃下干燥較為合適。

表6 干燥溫度對商陸有效成分含量的影響

2.1.3 干燥時間考察結果 不同干燥溫度、干燥時間條件下，商陸水分含量、總皂苷含量、皂苷甲含量見表7。對商陸烘干過程考察發(fā)現(xiàn)，高溫條件75 ℃下干燥8 h，藥材含水量小于13.0%，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定，低溫條件35 ℃干燥16 h，同樣能達到要求。同時發(fā)現(xiàn)，干燥時間延長會造成商陸有效部位和有效成分的損失。綜合考慮本試驗設定干燥時間為12 h。

表7 干燥時間對商陸水分及有效成分含量的影響

2.2 Box-Behnken 響應面設計

將試驗結果輸入Design Expert 8.06 軟件，得試驗結果如表8 所示。

表8 響應面試驗設計方案及結果

2.3 回歸模型的建立與分析

用Design Expert 8.06 軟件對表8 結果進行二次多元回歸擬合，得到回歸模型為R1=95.19-0.80A+2.47B+1.13C-0.63AB+1.42BC-1.07A2-5.72B2-6.45C2。

對回歸模型進行方差分析，結果如表9 所示。由表9 可知，該模型P＜0.01，表明本回歸模型差異極顯著，試驗設計可行，誤差較小。失擬項P＞0.05，差異不顯著。經(jīng)可信度分析，校正決定系數(shù)為0.884 8，信噪比為10.648 0，遠大于4。表明使用該方程擬合效果較好，其他因素對試驗結果干擾較小，因此，可以用該方程確定商陸鮮制切片的最佳工藝參數(shù)。由試驗結果可知，干燥溫度（B）及其二次方的P均較小，表明其對商陸切制工藝的影響較顯著。3 因素對綜合評分的影響為干燥溫度＞干燥時間＞切片厚度。三者的交互等高線以及響應面曲線見圖1。響應曲面越陡峭，說明該因素對綜合評分的影響越顯著；響應曲面平緩，則說明該因素對綜合評分的影響不顯著。結合表9 和圖1 可知，切片厚度與干燥時間的交互作用對綜合評分的影響極顯著；切片厚度與干燥溫度、干燥溫度與干燥時間的交互作用對綜合評分的影響不顯著。

表9 響應面試驗設計結果方差分析

2.4 響應面優(yōu)化及驗證

由Design Expert 8.06 軟件得到商陸切片的最佳提取條件為厚度2.58 mm、干燥溫度54.11 ℃、干燥時間9.57 h。在此條件下，綜合得分為96.00%?？紤]到實際操作，將最佳工藝條件修正為厚度3 mm，干燥溫度55 ℃，干燥時間10 h。按照所得參數(shù)條件，加工3 批商陸飲片，分別測定商陸總皂苷和商陸皂苷甲含量后，計算得到綜合評分為95.21%±0.63%，與預測值十分接近，表明本試驗確定的優(yōu)化工藝結果可靠，具有一定的實用價值。

3 小結與討論

《中華人民共和國藥典》收錄的商陸質(zhì)量標準中，規(guī)定測定的指標性成分為商陸皂苷甲，既是其有效成分，又是其毒性成分，但商陸的生物活性是多種皂苷綜合作用的結果，同時，加工炮制過程中，存在不同皂苷的結構轉(zhuǎn)化，故在本試驗設計中，對商陸皂苷甲和總皂苷的含量作綜合分析，使試驗設計更加科學。工藝研究過程中，Box-Behnken 響應面法既可以減少單因素交叉試驗的繁瑣，又較傳統(tǒng)的正交試驗減少人為因素對結果的影響，特別是能反映出各因素之間的交互作用變化，使試驗結果更加合理。由于樣品采集的局限性，試驗所用批量較小，需進一步中試和擴大生產(chǎn)驗證。商陸屬于多年生藥材，生長年限和采收時節(jié)是否會對成品飲片的質(zhì)量造成影響，尚待進一步研究。

本試驗研究表明，商陸鮮制飲片加工過程中，影響因素為干燥溫度＞干燥時間＞切片厚度，其中干燥溫度影響顯著，切片厚度和干燥時間交互影響極顯著。優(yōu)化工藝為厚度3 mm，干燥溫度55 ℃，干燥時間10 h。本試驗從技術層面驗證了商陸產(chǎn)地加工與炮制一體化工藝的可行性，可為今后的商陸飲片生產(chǎn)提供參考。